骨髓基質(zhì)細(xì)胞通過(guò)TSP-1/CD36 通路對(duì)急性髓系白血病細(xì)胞影響的初步研究*

鄭雅心 亢俊楠 陳澤慧 王麗娜 鄭國(guó)光 熱西擔(dān)·努爾買(mǎi)買(mǎi)提 田晨

骨髓微環(huán)境參與急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）的發(fā)生發(fā)展和化療耐藥，骨髓基質(zhì)細(xì)胞（bone marrow-derived mesenchymal stromal cells，BM-MSCs）作為微環(huán)境中重要的非造血成分，在此過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究指出，BM-MSCs 能夠促進(jìn)AML 細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和化療耐藥，從而促進(jìn)AML 的發(fā)生發(fā)展[1-2]。凝血酶敏感蛋白-1（thrombospondin-1，TSP-1）作為細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生的一種分泌型蛋白，在骨髓微環(huán)境中能夠支持各種正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的黏附與運(yùn)動(dòng)，并調(diào)控細(xì)胞的增殖與凋亡[3-4]。

本研究采用過(guò)表達(dá)MLL-AF9 誘導(dǎo)的AML 小鼠模型，以野生型（wild type,WT）小鼠為對(duì)照，流式分選兩組不同來(lái)源的BM-MSCs 后行q-PCR 驗(yàn)證其內(nèi)TSP-1 的表達(dá)水平。隨后構(gòu)建過(guò)表達(dá)TSP-1 的慢病毒載體，設(shè)計(jì)transwell 共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AML 細(xì)胞的增殖及凋亡水平，旨在探尋BM-MSCs 影響AML 細(xì)胞生長(zhǎng)的潛在機(jī)制，為白血病的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 PRMI 1 640 培養(yǎng)基、DMEM 高糖培養(yǎng)基、0.25%EDTA 胰蛋白酶、新生胎牛血清（FBS）購(gòu)于美國(guó)Gibco 公司；Lineage-APC-CY7、CD45-PerCP-CY5.5、CD31-PE、F4/80-FITC、CD36-FITC、CD47-APC-CY7 抗體購(gòu)自美國(guó)Biolegend 公司；0.4 μm transwell 小室購(gòu)于美國(guó)Corning 公司；TransScript?Allin-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 購(gòu)于北京全式金公司；TB Green?Premix Ex Taq?購(gòu)于日本Takara 公司；高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒購(gòu)于Tiangen 公司；X-treme GENE HP 購(gòu)于瑞士 Roche 公司；PE-Annexin-V 凋亡試劑盒、APC-BrdU 增殖試劑盒及CantoⅡ流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD 公司產(chǎn)品；CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱、低溫臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Thermo 公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購(gòu)自新加坡Thermo 公司。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建過(guò)表達(dá)MLL-AF9 的AML 小鼠模型 采用C57 和B6 的小鼠來(lái)構(gòu)建AML 模型，如圖1A 所示。成功構(gòu)建過(guò)表達(dá)MLL-AF9 的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體MSCV-MLL-AF9-PGK-GFP 后感染B6 小鼠來(lái)源的Lin-Sca-1+細(xì)胞（表達(dá)CD45.1），將感染后攜帶綠色熒光的GFP+細(xì)胞（CD45.1）經(jīng)尾靜脈注射至C57 小鼠（表達(dá)CD45.2）體內(nèi)，建模后14 天解剖小鼠分析骨髓和脾中白血病細(xì)胞的浸潤(rùn)。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)分選BM-MSCs 將WT 小鼠及建模14 天后的AML 小鼠處死，剝離其股骨、脛骨，沖出骨髓后4℃避光條件下孵育如下抗體：Lineage-APC-CY7，CD45-PerCP-CY5.5，CD31-PE 和F4/80-FITC，使用流式細(xì)胞儀分選Lin-CD45-CD31-F4/80-細(xì)胞群，為BM-MSCs 群，并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)[5]。

1.2.3 q-PCR 驗(yàn)證TSP-1 在BM-MSCs 的表達(dá)水平收集細(xì)胞后采用Trizol 法裂解提取總RNA，隨后將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用Takara 公司的q-PCR 試劑盒（貨號(hào)：RR420A）進(jìn)行q-PCR 實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)體系為20 μL，其中TB Green Primer Ex Taq I 10 μL，PCR Primer Mix 0.8 μL，Rox Reference DyeⅠ0.4 μL，cDNA 2 μL，無(wú)DNA/RNA 酶水補(bǔ)至20 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，40 個(gè)循環(huán)。引物序列如下：TSP-1 上游引物序列5'-AAGACTGTG TTGGCGATGTGAC-3'，下游引物序列5'-ACCGAT GTTCTCCGTTGTGATTG-3'；GAPDH 上游引物序列 5'-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3'，下游引物序列5'-GCCATCACGCCACAGTTTC-3'。

1.2.4 慢病毒載體感染 將1.2 μg 目的質(zhì)粒pCDHCMV-TSP-1-EF1-GFP-Puro 和空載體pCDH-CMVEF1-GFP-Puro（優(yōu)寶生物）分別與0.6 μg 包裝質(zhì)粒：PMD2.G、pSPAX2（優(yōu)寶生物）、200 μL Opti-MEM 以及7.2 μL 轉(zhuǎn)染試劑混合均勻，室溫靜置15 min 后加入293T 細(xì)胞，于37℃ 5%CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)，12 h后更換為新鮮培養(yǎng)基，48 h 后于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況并收集病毒。

將收集到的病毒原液加入AML 小鼠BM-MSCs，按照 1∶1 000 比例加入 8 μg/mL 的 Polybrene。置于37℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，48 h 后熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，即感染成功。

1.2.5 transwell 共培養(yǎng) 將長(zhǎng)勢(shì)良好的BM-MSCs接種于0.4 μm transwell 細(xì)胞培養(yǎng)板的下室，細(xì)胞融合度達(dá)到90%以上時(shí)，將小鼠原代AML 細(xì)胞以1×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于細(xì)胞培養(yǎng)板的上室，共培養(yǎng)16 h 后收集上室內(nèi)的AML 細(xì)胞行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 流式檢測(cè)AML 細(xì)胞表面CD36/CD47 的表達(dá)水平 將transwell 法共培養(yǎng)后的AML 細(xì)胞進(jìn)行流式抗體標(biāo)記：CD36-FITC、CD47-APC-CY7，4℃避光孵育30 min 洗去未特異性結(jié)合的抗體；使用流式細(xì)胞儀分析AML 細(xì)胞表面CD36 和CD47 的表達(dá)。

1.2.7 BrdU 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將BrdU 加入培養(yǎng)基中混勻后于37℃孵箱內(nèi)孵育4～6 h，隨后收集細(xì)胞，按BD 公司APC-BrdU 增殖檢測(cè)試劑盒中說(shuō)明書(shū)進(jìn)行下述步驟：固定破膜、孵育、再固定、DNase 消化以暴露BrdU、標(biāo)記anti-BrdU APC 抗體、DNA 染色。最后補(bǔ)足staining buffer 至500 μL，流式細(xì)胞儀低速分析（<400 events/s）。

1.2.8 Annexin V/PI 法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 100 μL 1×binding buffer 重懸細(xì)胞后加入5 μL Annexin V 和5 μL 7-AAD 抗體，冰上避光孵育15 min 后補(bǔ)加 400 μL 1×binding buffer，上流式細(xì)胞儀分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。應(yīng)用FlowJo 軟件分析流式結(jié)果。兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)以±s表示。以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 過(guò)表達(dá)MLL-AF9 的AML 小鼠模型構(gòu)建

建模過(guò)程如圖1A 所示。建模后14 d 解剖小鼠脾臟、肝臟對(duì)其稱(chēng)重，發(fā)現(xiàn)AML 小鼠較WT 小鼠的肝、脾更重（圖1B～1E）。此外，AML 小鼠的骨髓細(xì)胞及脾臟細(xì)胞在倒置熒光顯微鏡下可見(jiàn)滿視野綠色熒光（圖1F），證明AML 小鼠建模成功。

圖1 AML 小鼠模型的構(gòu)建

2.2 AML 小鼠來(lái)源的BM-MSCs 低表達(dá)TSP-1

通過(guò)q-PCR 比較AML 小鼠和WT 小鼠BMMSCs 內(nèi)TSP-1 的表達(dá)水平（圖2）。結(jié)果顯示，AML來(lái)源的BM-MSCs 低表達(dá)TSP-1。

圖2 q-PCR 檢測(cè)AML 小鼠來(lái)源的BM-MSCs 內(nèi)TSP-1 表達(dá)水平

2.3 過(guò)表達(dá)TSP-1 的BM-MSCs 與AML 細(xì)胞共培養(yǎng)后CD36 與CD47 的表達(dá)變化

通過(guò)慢病毒載體感染AML 來(lái)源的BM-MSCs，使之過(guò)表達(dá)TSP-1（圖3）。共培養(yǎng)前AML 原代細(xì)胞表面CD36 及CD47 的表達(dá)情況如圖4A 所示，而與過(guò)表達(dá)TSP-1 的BM-MSCs 行transwell 共培養(yǎng)后的AML 細(xì)胞表面CD36 表達(dá)水平升高（圖4 B），但CD47 的表達(dá)未見(jiàn)明顯改變（圖4 C），提示高水平的TSP-1 可能誘導(dǎo)AML 細(xì)胞表面CD36 受體升高。

圖3 q-PCR 驗(yàn)證感染后BM-MSCs 的TSP-1 表達(dá)量

圖4 流式檢測(cè)CD36 及CD47 的表達(dá)水平

2.4 過(guò)表達(dá)TSP-1 的BM-MSCs 對(duì)AML 細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

經(jīng)transwell 共培養(yǎng)16 h 后的AML 細(xì)胞增殖減少，凋亡增多（圖5A～B）。為證實(shí)BM-MSCs 是否通過(guò)TSP-1/CD36 通路介導(dǎo)AML 細(xì)胞凋亡，我們?cè)谠摴才囵B(yǎng)體系下加入CD36 抑制劑N-油?；虼牾啺罚约尤氲攘康腜BS 組為對(duì)照，檢測(cè)AML 細(xì)胞的生長(zhǎng)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在抑制劑的作用下，AML細(xì)胞的增殖增多，凋亡減少（圖5C～D）。上述結(jié)果表明，在AML 微環(huán)境中，阻斷了BM-MSCs 和AML 細(xì)胞之間的TSP-1/CD36 通路，使得AML 細(xì)胞增殖增多，凋亡減少。

圖5 流式檢測(cè)AML 細(xì)胞的生長(zhǎng)變化

3 討論

骨髓微環(huán)境內(nèi)的MSCs 可分泌豐富的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白與細(xì)胞因子，與白血病細(xì)胞相互作用，對(duì)AML的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要[6-9]。本研究前期工作[7]發(fā)現(xiàn)MSCs 通過(guò)c-Myc 依賴(lài)性途徑保護(hù)AML 細(xì)胞免于凋亡。此外，AML 來(lái)源的BM-MSCs 較正常供體來(lái)源的BM-MSCs 具有更高的成脂潛能，更強(qiáng)的支持白血病祖細(xì)胞生存的能力[9]。

TSP-1 是一種多功能的粘附性糖蛋白，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移和分化，影響胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、炎癥、腫瘤轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)進(jìn)程[10]。研究發(fā)現(xiàn)，TSP-1在AML 患者骨髓血清中低表達(dá)，被認(rèn)為是一種新的預(yù)后因子[10]。TSP-1 可與多種受體相結(jié)合，如CD47、CD36 等[11]。CD36 表達(dá)于多種細(xì)胞類(lèi)型，介導(dǎo)免疫識(shí)別、炎癥、分子黏附和細(xì)胞凋亡[12]。研究表明，CD36除了通過(guò)促進(jìn)脂質(zhì)攝取和脂肪酸氧化來(lái)誘導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移和耐藥外，還可誘導(dǎo)腫瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡或阻斷血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子2 途徑來(lái)抑制血管生成[13]。在HL-60 細(xì)胞，TSP-1 可誘導(dǎo)由CD36 介導(dǎo)的caspase 依賴(lài)性細(xì)胞死亡[14]。此外，在慢性B 淋巴細(xì)胞白血病中，TSP-1 通過(guò)與CD47 結(jié)合觸發(fā)caspase 非依賴(lài)性的細(xì)胞死亡[15]，而在早幼粒細(xì)胞白血病中，TSP-1 則與CD47 結(jié)合觸發(fā)caspase 依賴(lài)性的細(xì)胞死亡[16]。

本研究首先通過(guò)q-PCR 技術(shù)比較不同來(lái)源BMMSCs 內(nèi)TSP-1 的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)AML 來(lái)源的BMMSCs 分泌TSP-1 的水平顯著下降。進(jìn)而通過(guò)慢病毒載體誘導(dǎo)MSC 中TSP-1 高表達(dá)，并與AML 細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)后的AML 細(xì)胞表面CD36 表達(dá)升高，且AML 細(xì)胞凋亡增多、增殖減少。在體外共培養(yǎng)體系中加入CD36 抑制劑后促進(jìn)AML 細(xì)胞的生長(zhǎng)。說(shuō)明在AML 微環(huán)境中，BM-MSCs 內(nèi)TSP-1 分泌減少，使得TSP-1/CD36 通路失活，從而促進(jìn)了AML 細(xì)胞生長(zhǎng)；而活化TSP-1/CD36 通路則可抑制AML 細(xì)胞生長(zhǎng)?？傊?，本研究揭示TSP-1/CD36 軸在AML 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用，為AML 的治療提供了潛在靶點(diǎn)。

本文無(wú)影響其科學(xué)性與可信度的利益沖突。