禽白血病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)研究進(jìn)展

王 哲,金 暉,李寅博,陳 晨,徐 暢,劉 賀通信作者

1.撫順市動物疫病預(yù)防控制中心,遼寧 撫順 113006 2.遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心,遼寧 沈陽 110164 3.鞍山市動物疫病預(yù)防控制中心,遼寧 鞍山 114016

0 引言

禽白血病(avian leucosis,AL),又稱雞淋巴性白血病,是由一種具有高度傳染性的逆轉(zhuǎn)錄病毒——禽白血病病毒(Avianleukosisvirus,ALV)引起的基于不同組織的良性或惡性腫瘤的總稱[1]。自1868年首次報道該病以來,ALV感染已遍布世界各國,對全球經(jīng)濟(jì)造成較大影響。由于該病毒基因組可以整合到宿主雞或鳥類的基因組上[2],會給檢測工作帶來一定的困難。本文通過對AL實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)進(jìn)行研究,以期為ALV分子流行病學(xué)調(diào)查、監(jiān)測凈化[3]和禽痘等活疫苗的外源病毒監(jiān)測[4]提供有效的技術(shù)支持。

1 病毒分離

采集發(fā)病雞的脾、肝、腎,按臟器質(zhì)量的1～2倍加入含雙抗的滅菌PBS液或細(xì)胞培養(yǎng)液制成勻漿,在4 ℃下以10 000 r/min離心5 min,上清液接種雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)[5],于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。之后更換新細(xì)胞維持液,培養(yǎng)5～7 d。因大多數(shù)ALV毒株并不能產(chǎn)生細(xì)胞病變[6],可以采取間接免疫熒光抗體反應(yīng) (IFA)進(jìn)行病毒鑒定,若出現(xiàn)被感染的 CEF內(nèi)呈現(xiàn)亮綠色熒光,判為ALV陽性。因該方法檢測費(fèi)時費(fèi)力,目前在大多數(shù)國家已不作為常規(guī)檢測方法[1]。

2 膠體金免疫層析試紙條

膠體金免疫層析試紙條(colloid gold strip,CGS)主要是指根據(jù)膠體金免疫層析相關(guān)技術(shù)進(jìn)行研發(fā),并以低成本、高效等特點(diǎn)對抗體試紙或抗原試紙進(jìn)行檢測。現(xiàn)階段,CGS在諸多領(lǐng)域和行業(yè)中獲得普遍應(yīng)用。Yu et al.[7]研發(fā)的針對群體特異性抗原p27蛋白的CGS法,檢測限低至6.25 ng/mL,對ALV不同亞組的檢測限低至80 TCID50/mL,對ALV-A、ALV-B、ALV-J、ALV-K均有較高的特異性,其檢測結(jié)果與ELISA試劑盒的符合率為97.1%。Qian et al.[8]基于2種高親和單克隆抗體,成功制備了檢測ALV衣殼蛋白抗原p27的GGS,既能檢測出600 pg的純化重組p27蛋白,還能定量檢測限低至70 TCID50/mL,與商品化試劑盒相比具有高敏感性,針對泄殖腔拭子、雞胎糞和病毒分離物檢測,2種方法符合性分別為93.91%、93.42%和100%。CGS相較于與其他分子生物學(xué)、免疫學(xué)檢測方法,有著不需要專業(yè)儀器、檢測時間較短、眼觀判定等優(yōu)點(diǎn),適用于現(xiàn)場操作、基層檢測等操作;同時也要注意在現(xiàn)有條件下,該方法存在著一定的風(fēng)險,即造成一定比例的假陰性從而造成漏檢[9]。

3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immune sorbent assay,ELISA)具有易操作、高效敏感等優(yōu)點(diǎn),是種雞場廣泛使用的檢測手段。商品化試劑盒已被廣泛應(yīng)用在ALV檢測和凈化中。當(dāng)前,ALV間接ELISA方法主要以表達(dá)純化的p27、gp85重組蛋白為包被抗原的檢測試劑盒。毛婭卿 等[10]利用p27抗原片段,蛋白表達(dá)、純化后包被,建立了檢測ALV-p27抗體的間接ELISA方法,有較好的特異性和重復(fù)性,特異性為91.67%,敏感性為94.12%,批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于10%。曹利利 等[11]建立ALV間接ELISA檢測方法,與市售商品試劑盒相比,符合率為96.92%,對314份疑似樣品進(jìn)行檢測,陽性檢出率為75.15%。Chang et al.[12]建立了亞群特異性間ELISA,以ALV-Jgp85蛋白為包被抗原檢測ALV-J抗體,靈敏度為1：51 200血清稀釋,較間接免疫熒光法(IFA)高155倍。Yun et al.[13]采用抗p27單克隆抗體和多克隆抗體建立了一種用于檢測ALV的抗原捕獲酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(antigen-capture ELISA,AC-ELISA),可以檢測到ALV-J、ALV-A和ALV-B標(biāo)樣信號,檢出限值為1.25 ng/mL,HLJ09MDJ-1(ALV-J)的TCID50為101.79,該方法快速、靈敏,可用于AL流行病學(xué)研究和根除計劃。

4 實(shí)時熒光定量PCR

實(shí)時熒光定量PCR(fluorescent quantitative-polymerase chain reaction,FQ-PCR)不僅保持了PCR方法的優(yōu)點(diǎn),還具有高靈敏度、高通量和高特異性,避免了因電泳產(chǎn)物污染風(fēng)險和溴化乙錠(EB)帶來的危害,該方法已被廣泛應(yīng)用于ALV檢測[14]。董征英 等[15]基于ALV-JNX0101毒株基因5 258-5 510 bp的堿基序列,設(shè)計了1對特異性引物,利用 SYBR Green I染料進(jìn)行RT-PCR反應(yīng),檢測限值約為81拷貝;屈素潔 等[16]針對ALV亞群ALV-J基因序列保守區(qū)域設(shè)計特異性引物和探針,構(gòu)建了ALV-J的熒光定量PCR檢測方法,該方法可檢測到32拷貝/μL的病毒核酸;嚴(yán)立福 等[17]建立檢測ALV-F的SYBR Green I熒光定量PCR方法,該方法標(biāo)準(zhǔn)品稀釋后PCR線性關(guān)系良好,R2為0.993,擴(kuò)增效率為1.03,最低檢測限為116拷貝/μL;上述方法均比RT-PCR靈敏100倍以上。

5 環(huán)介導(dǎo)恒等溫擴(kuò)增試驗(yàn)

環(huán)介導(dǎo)恒等溫擴(kuò)增試驗(yàn)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一種簡單快速的核酸擴(kuò)增方法,自2000年發(fā)明以來,該技術(shù)以其獨(dú)特的優(yōu)勢已被應(yīng)用于多種病毒的檢測。Wang et al.[18]基于ALV亞群序列比較和序列特征設(shè)計了以gp85基因片段檢測ALV-A的LAMP,其測限值檢測出20拷貝的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒,通過顏色變化可以評估出是否存在ALV-A感染。劉業(yè)兵 等[19]篩選確定了引物2(LV2)作為該方法的引物,其檢出限量為14.2 pg/μL,用建立的LAMP方法對24個樣品進(jìn)行檢測,檢測結(jié)果與其原用中國獸藥典中COFAL試驗(yàn)、ELISA檢測結(jié)果基本一致。黃海超 等[20]選取ALV-K亞群特異性的gp85基因序列,設(shè)計了特異性檢測ALV-KRT-LAMP的4條特異性引物,最低能夠檢測到34拷貝/mL的質(zhì)粒,該方法適用ALV-K的臨床快速篩查。張民秀 等[21]建立同時鑒別ALV和CIAV的二重?zé)晒釲AMP檢測方法,基于ALV的pol基因和CIAV的VP2基因保守序列,設(shè)計2套用于LAMP的特異性引物,該方法檢測CIAV和ALV單一模板的下限均為100拷貝/μL,檢測混合模板時ALV的檢測下限為100拷貝/μL、CIAV的檢測下限為1 000拷貝/μL。LAMP具有省時、高效和易操作等的特點(diǎn),在低濃度病毒量或無癥狀病毒攜帶者檢測中優(yōu)于PCR,適合生產(chǎn)技術(shù)人員和基層疫病防控人員對ALV臨床快速篩查和養(yǎng)殖場的ALV凈化。

6 結(jié)束語

隨著分子生物學(xué)診斷技術(shù)的不斷發(fā)展,多通道、熒光PCR、可視化LAMP、數(shù)字PCR(ddPCR)[22]、基因芯片[23]等方法較普通PCR在ALV核酸檢測上存在巨大優(yōu)勢,也得到行業(yè)認(rèn)可和廣泛應(yīng)用;另外,通過技術(shù)融合和改進(jìn),涌現(xiàn)了如熒光微球免疫層析檢測方法[24]、免疫聚合酶鏈反應(yīng)(Im-PCR)[25],但是也不能忽視病毒中和試驗(yàn)(VN)[26]、瓊擴(kuò)試驗(yàn)(AGID)[27]、免疫熒光抗體試驗(yàn)(FAT)[28]、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)[29-30]等檢測技術(shù)在基礎(chǔ)性研究中的價值。只有通過不斷地創(chuàng)新和整合,才能研發(fā)出更多、更有效的新診斷技術(shù),進(jìn)而為ALV精準(zhǔn)凈化和疫病防控提供科學(xué)、有效的技術(shù)支持。