應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測動物組織中的口蹄疫病毒

葉爾保勒,阿斯喀·夏熱甫漢

伊寧海關(guān)技術(shù)中心,新疆 伊寧 835000

0 引言

口蹄疫主要由口蹄疫病毒而引起,該病毒為當(dāng)前世界已知最小的動物病毒,主要發(fā)生于偶蹄獸中,是一種熱性、急性傳染病,具有高度接觸性面源傳染特點,患病動物口腔黏膜、乳房皮膚、蹄部和舌面部發(fā)生潰爛與水皰,因此也被稱為口瘡、蹄癀,一旦大規(guī)模發(fā)生將直接降低畜禽養(yǎng)殖質(zhì)量和養(yǎng)殖場經(jīng)濟效益。而在眾多病毒檢測方法中,RT-PCR技術(shù)憑借高靈敏度、高特異性、易操作、一步法可檢測大量樣本、環(huán)境污染小等優(yōu)勢,被廣泛應(yīng)用于動物口蹄疫病毒檢測中,以保證相關(guān)部門能在第一時間發(fā)現(xiàn)、清除與凈化口蹄疫病毒,最終保證畜禽健康養(yǎng)殖,避免疫病流行。

1 RT-PCR技術(shù)簡介

逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR),指提取細(xì)胞中的核糖核酸(RNA),以信使RNA(mRNA)作為模板,利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成互補DNA(cDNA),進而進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增,最終獲得基因表達[1]。該檢測方法能使RNA檢測靈敏性提高幾個數(shù)量級,多用于檢測細(xì)胞中基因表達水平,同時,從RNA合成cDNA,之后擴增合成目片段,即可檢測細(xì)胞中RNA病毒的含量,RT-PCR技術(shù)靈敏且用途廣泛,與病原分離、血清學(xué)檢測等方法相比,RT-PCR 方法具有直接、簡單、快速等優(yōu)勢,不局限于實驗室內(nèi)進行診斷操作,在雙重?zé)晒舛?RT-PCR 方法應(yīng)用下,可鑒別檢測不同血清型口蹄疫滅活疫苗中的抗原含量和病毒因子,為口蹄疫疾病診斷與防疫打下堅實基礎(chǔ)。

2 檢測材料與方法

2.1 檢測對象

本次檢測選擇4家養(yǎng)殖場不同豬、牛、羊群血清樣本共300份(其中豬血清樣本數(shù)104份,牛血清樣本數(shù)102份,羊血清樣本數(shù)94份)為例,對300頭豬、牛、羊的水皰液樣品進行檢測,本次所應(yīng)用到的生物試劑儀器、引物設(shè)計、檢測過程如下。

2.2 檢測試劑與儀器

1)生物試劑選擇如下。①寶生物工程(大連)有限公司提供的熒光定量RT-PCR試劑盒、NdeⅠ限制性內(nèi)切酶、Easy Dilution、6×Loading Buffer。②life公司提供的MEGAclearTM Kit RNA純化試劑。③QIAGEN公司提供的總RNA提取試劑盒RNeasy Mini Kit。④Promega公司提供的pGEM-T載體試劑盒。⑤北京百奧萊博科技有限公司提供的RLT Buffer分子生物學(xué)試劑。⑥南通市海銳實驗器材有限公司提供的EP管。⑦上海恪敏生物科技有限公司提供的TRlzol? Reagent試劑。⑧上海索萊寶生物科技有限公司提供的Binding Buffer-200 mL。⑨上海信裕生物技術(shù)有限公司提供的SPW Wash buffer-25 mL。上海澤葉生物科技有限公司提供的DH5α 感受態(tài)細(xì)胞。北京索萊寶科技有限公司提供的LB固體培養(yǎng)基(干粉)。

2)儀器選擇如下。①青島海爾科技有限公司提供的DTY-1360型潔凈工作臺。②北京六一儀器廠提供的DYY-7C電泳儀。③順德市美的微波爐制造公司提供的微波爐。④青島海爾電冰柜有限公司提供的冰箱。⑤美國SCILOGEX公司提供的D1008 手掌式離心機。⑥美國Thermo公司提供的Nano Drop ND2000C超微量核酸蛋白儀。⑦RS生物工程有限公司提供的CO2培養(yǎng)箱。⑧金壇市富華儀器有限公司提供的THZ-C恒溫振蕩器。⑨江蘇海門其林貝爾儀器公司提供的GL-802B型微型臺式真空泵。

2.3 引物設(shè)計

以口蹄疫O/GX/09-7株檢測為例,引物由寶生物工程(大連)有限公司合成,引物序列:FMDV-VP1-F:5’-TAAATGTATTGGACCTGATGCAGA-3’[2]。

2.4 檢測方法

2.4.1 病料處理

將水泡液樣品置于樣品保存液中(保存液含有磷酸鹽緩沖液0.08 mol/L,磷酸鹽緩沖液pH值7.2 ),水泡液樣品和保存液共10 mL,按照當(dāng)前劑量,放入0.002%酚紅、0.01%血清白蛋白、100 IU/mL 制霉菌素,50 IU/mL 多粘菌素,1 000 IU/mL青霉素,對樣品按照01、02……順序編號,采集的樣品置于-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆?獲得水泡液樣品浸出液之后,提取病毒總的RNA。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)品RNA制備

在提取病毒總的RNA時,整個操作過程在36～37 ℃室溫下進行,操作步驟如下。①將RLT Buffer裂解液加入到離心管(eppendorf,EP)中(下文均用EP管表示),EP管容量為1.5 mL,RLT Buffer裂解液容量為500 μL ,取病毒懸液250 μL,加入750 μL TRlzol? Reagent試劑中振蕩,振蕩時間約為30 s,36 ℃室溫靜置5 min。②每1.5 mL離心管中加入200 μL氯仿振蕩,振蕩時間約為30 s,37 ℃室溫靜置5 min。③離心后觀察到液體分層,第2次轉(zhuǎn)移700 μL液體至吸附柱中,棄收集管中液體。④取上層液相至1.5 mL離心管中(新管),重復(fù)搖勻,加入異丙醇(與上層液同體積),置于-20 ℃環(huán)境下10 min,之后每管用 l mL 75%冷乙醇洗一次,上清之前置4 ℃環(huán)境下離心15 min,室溫風(fēng)干,加入20 μL的無核酸酶水(RNasefree ddH2O)至膜中央,之后加入超純水(DEPC 處理水),劑量為9.5 μL,將得到的RNA用于反轉(zhuǎn)錄或置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.3 DNA 的聚合酶鏈?zhǔn)綌U增

用一步法 RT-PCR 試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄[3]。以提取的RNA作為模板,反應(yīng)體系(25 μL)具體如下。①RNA提取液:9.5 μL。②5×MLV Buffer(逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液5個):1.0 μL。③MLV (逆反錄酶):1.0 μL。④0.1 M DTT(0.1 M DTT還原劑,規(guī)格2 mL):1.1 μL。⑤脫氧核糖核苷三磷酸dNTPs(2.5 mmol):4.0 μL。⑥上游引物(10 μmol/L):0.5 μL。⑦模板RNA:2 μL。⑧下游引物(10 μmol/L):0.5μL。⑨RNA 酶抑制劑(20 U/μL):0.5 μL。反轉(zhuǎn)錄引物(20 pmol/μL):1.1 μL。

RT-PCR反應(yīng)參數(shù)為:反轉(zhuǎn)錄環(huán)境溫度45 ℃,變性溫度95 ℃,延伸溫度72 ℃,退火溫度58 ℃,預(yù)變性溫度95 ℃,終延伸溫度72 ℃,反應(yīng)時間依次設(shè)定為10 min、30 s、30 s、20 s、10 min、10 min。

2.4.4 回收純化

將上述PCR產(chǎn)物進行電泳檢測,利用DNA純化試劑盒回收純化,將切下的瓊脂糖凝膠置于EP管中[4]。在1.5 mLEP管中加入 Binding Buffer緩沖液,添加量為1 mL,置于55～65 ℃水浴中溫浴,把DNA和凝膠的混合物完全融化,上下顛倒輕微混勻1次,且每隔3 min進行1次,之后將混合溶液轉(zhuǎn)移到電泳緩沖液(HiBind DNA) 柱子,室溫下棄去收集管內(nèi)液體,10 000 g離心1 min,把柱子裝入2 mL收集管內(nèi),加300 μL Binding Buffer,10 000 g離心1 min,加入700 μL SPW Wash buffer,10 000 g離心1 min,將柱子重新套回收集管中,重復(fù)加入700 μL SPW Wash buffer,10 000 g離心1 min,把柱子裝在一個1.5 mL離心管上,室溫靜置2～3 min,-20 ℃保存?zhèn)溆?以此得到純化膠回收產(chǎn)物。

2.4.5 感受態(tài)細(xì)胞制備

從-80 ℃冰箱中取出DH5α 感受態(tài)細(xì)胞,熱應(yīng)激90 s,應(yīng)激溫度為42 ℃,之后再冰浴5 min,向離心管中加入800 μLB 液體,37 ℃(提前預(yù)熱至37 ℃)振蕩,培養(yǎng)45 min,轉(zhuǎn)速約為125～130 r/min。之后棄去大部分上清,置于12 000 r/min環(huán)境下離心30 s,用移液槍重懸細(xì)菌沉淀,余下約80 μL菌體,勻涂布于含氨芐青霉素的LB(Luria-Bertani) 固體培養(yǎng)基,含量約為20 μg/mL,先正面放置培養(yǎng)約5 min,37 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～16 h。之后挑取可疑菌落,37 ℃振蕩培養(yǎng)4～6 h。

2.4.6 陽性菌液保存

參照OMEGA公司質(zhì)粒提取試劑盒中使用方法進行質(zhì)粒抽提,部分菌液加入滅菌甘油(終濃度為 25%)[5]。向細(xì)菌沉淀加入酶溶液(SolutionⅠ),250 μL,獲取沉淀,室溫靜置2 min,徹底重懸之后加入SolutionⅢ(主要成分為醋酸鉀),350 μL),有白色絮狀沉淀產(chǎn)生后離心,離心時間為10 min,轉(zhuǎn)速為12 000 r/min,將吸附柱置于收集管上,用移液槍小心吸取上清,室溫12 000 r/min離心1 min,接著加入緩沖血紅蛋白(Buffer HB),500 μL,按照相同離心方式,離心后傾去液體,重復(fù)步驟2次,之后得到新的1.5 mL離心管(離心空管1 min,轉(zhuǎn)速為12 000 r/min),加入50 μL滅菌雙蒸水,離心1 min,轉(zhuǎn)速控制在12 000 r/min,室溫下靜置1 min,洗脫收集質(zhì)粒DNA。基線以儀器(試劑)默認(rèn)值為參考,陽性對照樣品Ct值不大于30,有對數(shù)擴增曲線,二者均成立則判定為陽性。

3 試驗結(jié)果

經(jīng)過以上檢測,得出本次口蹄疫陽性病例檢測結(jié)果,可以發(fā)現(xiàn)300份檢測樣本中,豬陽性率病例數(shù)為2例,陽性病例占比為1.92%(2/104),牛羊陽性率較低,各為1例,陽性病例占比分別為0.98%(1/102)、1.06%(1/94),總檢出率1.33%(4/300);如果按照畜種日齡和性質(zhì)劃分,300份檢測樣本中,育肥畜中陽性病例數(shù)量最多(2例),陽性病例在同群體占比1.42%,在總樣本中占比0.67%,其次是種公畜和仔畜(均為1例),種公畜陽性病例在同群體占比4.17%,在總樣本中占比.33%,仔畜陽性病例在同群體占比1.05,在總樣本中占比0.33%。具體情況如表1所示。

表1 口蹄疫陽性病例分布情況

4 結(jié)束語

文章主要以4家養(yǎng)殖場不同豬、牛、羊群血清樣本共300 份為例,對300頭豬牛羊的水皰液樣品進行檢測,在生物試劑與儀器、引物設(shè)計、標(biāo)準(zhǔn)品 RNA 制備、DNA 聚合酶鏈?zhǔn)綌U增、感受態(tài)細(xì)胞制備、陽性菌液保存等方面,給出口蹄疫病毒檢測方法,可得出本次試驗中陽性病例確診情況。相關(guān)部門和技術(shù)人員應(yīng)根據(jù)本次口蹄疫檢測結(jié)果,在確診后第一時間做出消毒、撲殺、凈化等一系列處理工作,以此避免疫情的大規(guī)模爆發(fā)和蔓延。