抑制黃曲霉乳酸菌的篩選與鑒定

鞏海強(qiáng)， 柴繼寬*， 陳三冬, 尹國麗， 鄧秀霞

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)研究中心， 甘肅 蘭州 730070)

黃曲霉(Aspergillusflavus)是飼料作物中普遍存在的一種腐生型好氧霉菌[1]。在適宜的條件下，這種霉菌可以侵染生長過程中和收獲后的農(nóng)作物，尤其對花生(ArachishypogaeaL.)、玉米、棉花(GossypiumsppL.)等油料作物的種子危害最為嚴(yán)重，且在侵染過程中會(huì)產(chǎn)生黃曲霉毒素[2]。據(jù)研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)，與2017和2018年的數(shù)據(jù)對比，2019年上半年黃曲霉在飼料上污染率有上升趨勢，存在較高的安全隱患[3]。同其他谷物比較，玉米胚部占比較大，具有極強(qiáng)的吸濕性，極易受黃曲霉侵染，在黑龍江、內(nèi)蒙古等9省(自治區(qū))28個(gè)縣的主要生產(chǎn)基地采集的251份樣品(90份全株玉米樣品和161份青貯玉米樣品)中均檢測出黃曲霉毒素[3]，黃曲霉毒素含量超標(biāo)率高達(dá)5.18%[4]。全球超過1.33億頭奶牛每年消耗青貯飼料高達(dá)6.65億噸，其中全株玉米青貯占比超過40%[5]，全株玉米具有豐富的可溶性碳水化合物和較低的緩沖能值，是選用全株玉米青貯的重要原因[6]。但全株青貯玉米飼料有氧暴露后霉菌快速繁殖容易造成有氧腐敗從而導(dǎo)致霉菌和霉菌毒素污染等飼料安全問題[7]。被黃曲霉污染的青貯玉米營養(yǎng)品質(zhì)下降且不易保存，發(fā)霉飼料不能利用給生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，另外富含黃曲霉毒素的飼料會(huì)直接危害家畜健康，使家畜中毒甚至誘發(fā)癌變。由此可見，解決玉米青貯中黃曲霉污染問題具有深遠(yuǎn)意義。

目前，防治黃曲霉及其毒素污染主要采用化學(xué)方法[8]，但化學(xué)添加劑對人體健康的危害性極大，且長期使用會(huì)產(chǎn)生抗性[9]，利用天然植物和微生物從源頭上控制黃曲霉在飼料中的生長和產(chǎn)毒具有綠色高效、無毒副作用、無殘留等優(yōu)點(diǎn)。然而，開發(fā)天然植物成本較高且作用穩(wěn)定性差，制約了其在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用，而乳酸菌作為一種添加劑在玉米青貯中的利用，備受國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[10-11]，是國際公認(rèn)的最傳統(tǒng)最安全的添加劑之一[12-13]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)[14]部分乳酸菌對黃曲霉及其毒素具有拮抗作用，如從泰國發(fā)酵面粉中分離出的植物乳桿菌K35(L.plantarumK35)幾乎可以完全抑制黃曲霉的生長；另外李利紅等[15]也從大量材料中篩選出2株對曲霉生長有明顯抑制作用的乳酸菌，其中1株為發(fā)酵乳桿菌(Lactiplantibacillusfermentum)，另1株是植物乳桿菌。但是，目前還少有專用于玉米青貯飼料的抑黃曲霉乳酸菌添加劑。

研究表明，植物表面附著的和內(nèi)源性的乳酸菌能較好的適應(yīng)植物生存環(huán)境[16]，因此，從植物原料發(fā)酵過程中篩選青貯用拮抗乳酸菌是一種高效、快捷的方法。鑒于此，本研究擬從玉米青貯飼料中篩選能有效抑制黃曲霉生長的乳酸菌，以期為解決青貯飼料中黃曲霉及其毒素的污染問題提供微生物資源，并為改善玉米青貯飼料品質(zhì)和質(zhì)量安全提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品與菌種

樣品處理：于2021年10月11日在甘肅省蘭州市西固區(qū)采集‘和盛5288’品種玉米，全株蠟熟期收割，切碎(2～3 cm)，壓實(shí)，用真空包裝機(jī)袋裝密封，制作鋁箔青貯袋(25 cm× 16 cm)50個(gè)，每袋約重500 g，室內(nèi)常溫條件下，自然發(fā)酵30 天。

菌種來源：乳酸菌分離于‘和盛5288’全株青貯玉米發(fā)酵第3天，4天，5天，6天，7天，10 天，15 天，25 天，30 天；黃曲霉標(biāo)準(zhǔn)菌(AspergillusflavusLWCC2009)購自上海魯微科技有限公司，保存于—20℃冰箱。

1.2 乳酸菌的分離純化

在全株玉米青貯的第3天，4天，5天，6天，7天，10天，15天，25天，30天打開3包青貯袋。從每包青貯袋中稱取適量飼料樣品共10 g于250 mL錐形瓶中，再加90 mL無菌蛋白胨水溶液于250 mL錐形瓶中，封口；后置于搖床以150 r·min-1振蕩90 min，取上清液1 mL加入到含9 mL無菌蛋白胨水溶液中適當(dāng)振蕩，將溶液依次稀釋成10-5，10-6，10-7三個(gè)梯度，各取菌液100 μL在MRS培養(yǎng)基上涂布，每個(gè)梯度4個(gè)重復(fù)，30℃培養(yǎng)72 h；根據(jù)菌落顏色、大小、光澤、有無透明圈等挑單菌落進(jìn)行劃線[12]，不斷純化培養(yǎng)直到獲得純菌株，后將菌株富集后與40%甘油混合置于—80℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆肹17]。

1.3 霉菌孢子懸液的制備

28℃恒溫培養(yǎng)3 d，取孢子制菌懸液[18]，濃度調(diào)整為106個(gè)·mL-1，待用。

1.4 抑制黃曲霉活性乳酸菌的篩選

采用雙層平板法[19]篩選對黃曲霉具有抑菌能力的乳酸菌。用游標(biāo)卡尺測菌株的抑菌圈直徑，計(jì)算抑菌率，抑菌率等于抑菌圈直徑除以對照組直徑。

1.5 菌株的形態(tài)特征及生理生化鑒定

觀察乳酸菌的菌落形態(tài)，并挑取單菌進(jìn)行革蘭氏染色，用油鏡觀察細(xì)胞形狀、大小、染色結(jié)果及菌體是否有鞭毛和芽孢等。將篩選出抑制黃曲霉能力較強(qiáng)的產(chǎn)酸菌進(jìn)行基本生理生化特征檢測[20]。

1.6 菌株生長速率和產(chǎn)酸速率的測定

將菌株活化2次后，以2%接種量在培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,溫度控制在35℃左右，以未加菌懸液的空白培養(yǎng)基為對照，每2 h取一次樣，每株取3個(gè)平行樣，測定各樣品在波長600 nm時(shí)的OD值。同時(shí)測定發(fā)酵液pH值[21]。生長速率是指單位時(shí)間內(nèi)OD值的變化，在圖中斜率表示生長速率。產(chǎn)酸速率用單位時(shí)間內(nèi)pH值的變化表示。

1.7 16S rDNA序列同源性分析

將活化的菌株富集培養(yǎng)24 h后離心收集菌體，提取細(xì)菌DNA[22]，用細(xì)菌16S rDNA的通用引物27F，1492R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增[23]。反應(yīng)體系：2×PCR Master Mix，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，9.5 μL ddH2O，總體積為25 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，51℃退火45 s、72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min后4℃保存[24]。檢測目的條帶后將擴(kuò)增產(chǎn)物送至擎科生物有限公司測序。

將獲得的乳酸菌菌株基因序列信息與NCBI網(wǎng)站里的Gene Bank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，選擇與所測序列同源性最高的已知分類地位的菌種。從Gene Bank數(shù)據(jù)庫中下載已知菌株的16S rDNA基因序列，與所測菌株的16S rDNA序列一起，采用Clustal進(jìn)行比對，用MEGA7.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(Phylogeny)，確定各菌株分類地位[25]。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2019對數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，采用SPSS 21.0軟件對不同菌株測定指標(biāo)進(jìn)行單因子ANOVA模型分析，結(jié)合Duncan法進(jìn)行多重比較(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離培養(yǎng)

通過分離培養(yǎng)共篩選得到50株乳酸菌。在全株玉米青貯第3天、4天、5天、6天、7天、10 天、15 天、25 天、30 天樣品中分別篩選出15，7，2，7，10，6，1，1，1株乳酸菌。

表1 菌株編號和菌種來源Table 1 The strains of lactic acid bacteria and their source

2.2 抑黃曲霉活性菌株的篩選

通過抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)50株乳酸菌中有7株菌對黃曲霉有明顯抑制作用，與其余43株菌株的抑菌直徑差異顯著(P<0.05)，抑菌圈直徑達(dá)3.67～4.17 cm，抑菌率在40%以上(表2)。其中抑菌效果最好的是分離自青貯第7天的菌株Q39和Q40，抑菌圈直徑都達(dá)4.00 cm以上(圖1)，抑菌率分別達(dá)49.40%和49.60%。50株菌株中有8株菌株完全沒有抑菌能力，抑菌率為0%，有35株乳酸菌抑菌直徑在2.07～3.15 cm，抑菌率在24.60%～37.50%。

圖1 雙層平板對峙試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 The results of double plate confrontation test

表2 乳酸菌對黃曲霉的抑制效果Table 2 Inhibitory effects of the strains of lactic acid bacteria on Aspergillus flavus

2.3 抑黃曲霉菌株形態(tài)特征和生理生化特性

7株抑菌菌株革蘭氏染色后均呈現(xiàn)紫色，形態(tài)為桿狀(表3)，均能在5℃，15℃，35℃和45℃生長；菌株Q13，Q28，Q39和Q40能在pH值3.0～7.0范圍內(nèi)正常生長，因此，可以認(rèn)為這4株菌株耐酸性較強(qiáng)；Q49在pH值為3時(shí)不生長，另外2株菌株Q11和Q44表現(xiàn)為弱生長(表4)。由表5可知，菌株Q28，Q40，Q44和Q11與22種碳源作用均呈陽性，菌株Q49和Q39與鼠李糖作用呈陰性，與松三糖反應(yīng)呈弱陽性。菌株Q13利用碳水化合物的能力較弱，與松三糖、海藻糖、纖維二糖、甘露醇作用均為陰性。

表3 抑菌乳酸菌的形態(tài)特征Table 3 Morphological characteristics of the strains of bacteriostatic lactic acid bacteria

表4 抑菌乳酸菌的生理生化特性Table 4 Physiological and biochemical characteristics of the strains of bacteriostatic lactic acid bacteria

表5 抑菌乳酸菌碳源發(fā)酵試驗(yàn)Table 5 Carbon source test on the strains of antibacterial lactiplantibacillus fermentation

2.4 抑黃曲霉菌株的生長特性及產(chǎn)酸速率

7株菌株的生長速率曲線如圖2 a所示，在0～2 h時(shí)菌株Q40生長速率最高，Q44生長速率最低，但7株菌均進(jìn)入對數(shù)生長期，在2～4 h時(shí)菌株Q11，Q28，Q39和Q40生長速度達(dá)到最快，而菌株Q44和Q49在4～6 h生長速度才達(dá)到最快，培養(yǎng)4 h時(shí)7株菌株間生長速率差異極顯著(P<0.01)，Q11和Q49發(fā)酵初期生長速率明顯低于其他5株菌株，6 h后菌株Q39的OD值為7株菌株最高，12 h后7菌株OD值變化都趨近0(表6)。

7株菌株產(chǎn)酸速率曲線如圖2 b所示，0～8 h菌株Q39的產(chǎn)酸速率最高，4～6 h時(shí)菌株Q11，Q13，Q39，Q40和Q49產(chǎn)酸速率達(dá)到最大值，其中Q39，Q40和Q49顯著低于另外4株菌株(P<0.01)，6～8 h菌株Q28和Q44產(chǎn)酸速率達(dá)到最大值，8 h后除菌株Q44其余菌株產(chǎn)酸速率逐漸下降，菌株Q44在12 h后開始下降(表7)。在培養(yǎng)12 h后菌液pH值均降低至4以下，產(chǎn)酸速率較快。

表6 抑菌乳酸菌的生長速率Table 6 Growth rate of the strains of bacteriostatic lactic acid bacteria

表7 抑菌乳酸菌的產(chǎn)酸速率Table 7 Acid production rate of strains of bacteriostatic lactic acid bacteria

圖2 乳酸菌菌株的生長和產(chǎn)酸速率曲線Fig.2 Growth and acid production rate of the strains of lactic acid bacteria

2.5 抑黃曲霉菌株16S rDNA序列同源性分析

經(jīng)16S rDNA序列比對及同源性分析發(fā)現(xiàn)，Q49，Q39，Q28，Q40，Q44，Q11，Q13與植物乳桿菌(L.plantarum)JCM1149遺傳距離最近，其次是戊糖乳桿菌(L.pentosus)124-2(圖3)。

3 討論

目前黃曲霉污染仍是全球玉米作物在飼料及其深加工領(lǐng)域應(yīng)用的主要問題之一，利用微生物發(fā)酵降低毒素污染既經(jīng)濟(jì)又高效[26]。研究表明，各種真菌、細(xì)菌、放線菌等均有抑制黃曲霉生長的作用，但乳酸菌作為添加劑用于飼料防霉和提高青貯品質(zhì)的應(yīng)用更廣泛，并具有不破壞營養(yǎng)成分、環(huán)保等特點(diǎn)[27]，是用于制作微生物菌劑的首選。本試驗(yàn)從玉米青貯飼料發(fā)酵不同階段中篩選出7株能抑制黃曲霉生長的拮抗乳酸菌，抑菌直徑顯著高于其他菌株(P<0.05)，抑菌率由大到小依次為Q40(49.60%)，Q39(49.40%)，Q11(44.76%)，Q28(44.44%)，Q49(43.85%)，Q44(43.85%)，Q13(43.65%)，其在抑制黃曲霉生長方面具有很大的應(yīng)用潛力，這與馬妙蓮[28]的研究結(jié)果相似。

圖3 抑菌乳酸菌的 16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of bacteriostatic lactic acid bacteria based on 16S rDNA sequence

菌株Q49，Q39，Q28，Q40，Q44，Q11，Q13經(jīng)16S rDNA序列比對及同源性分析發(fā)現(xiàn)，與植物乳桿菌JCM1149和戊糖乳桿菌124-2遺傳距離最近。目前，普遍認(rèn)為在種分類水平上如果2個(gè)分類單位間同源性高于97.5%，則屬同一個(gè)種[29]。菌株Q39，Q49，Q39，Q40，Q44，Q11和Q13與植物乳桿菌和戊糖乳桿菌進(jìn)化親緣度都近似100%，但具體為哪一種尚不能確定，這與藺豆豆等[24]關(guān)于燕麥附著耐低溫乳酸菌的篩選中3株菌的鑒定結(jié)果基本一致。植物乳桿菌和戊糖乳桿菌在16S rDNA序列上僅有2 bp的差異，因此16S rDNA鑒定難以區(qū)分[30]。因此結(jié)合碳源發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行區(qū)分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株Q29，Q40，Q44，Q11和Q13均能發(fā)酵D-木糖和鼠李糖，由此可知，這5株菌株為戊糖乳桿菌，而菌株Q49和Q39都不能發(fā)酵鼠李糖，且可發(fā)酵D-木糖但呈弱陽性，故將這2株菌鑒定為植物乳桿菌[31]。嚴(yán)萍等[32]在飼料玉米中分離出12株優(yōu)質(zhì)乳酸菌其中4株為植物乳桿菌，這與本試驗(yàn)中獲得的優(yōu)勢菌株植物乳桿菌相一致，除此之外，我們還獲得了植物乳桿菌的近緣種戊糖乳桿菌菌株。

目前關(guān)于植物乳桿菌作為青貯添加劑的報(bào)道較多[33-34],而戊糖乳桿菌作為飼料添加劑用于生產(chǎn)實(shí)踐較少，但戊糖乳桿菌也是飼料中的常見種，其生理生化特性與植物乳桿菌類似，有大量研究表明植物乳桿菌和戊糖乳桿菌都具有較好的抑菌活性，如章昱等[35]篩選的植物乳桿菌CMCC-P0002，陸春波等[36]關(guān)于植物乳桿菌DY6的抑菌機(jī)制研究都充分說明植物乳桿菌具有較強(qiáng)抑菌能力。薄禮娟[37]在對戊糖乳桿菌S1-4的研究中證實(shí)其在飼料應(yīng)用中有很好的抑菌效果。杜賀超等[38]研究獲得1株抑菌效果最佳的植物乳桿菌PC4-5，能夠很好的抑制有害細(xì)菌。王昌祿等[39]的研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌可作為益生菌被廣泛用于控制黃曲霉的生長。同時(shí)郭艷萍等[40]研究篩選獲得的6株對黃曲霉有明顯抑制作用株菌中3株是植物乳桿菌。王昌祿和郭艷萍與本試驗(yàn)結(jié)果相一致，進(jìn)一步說明植物乳桿菌的確有較強(qiáng)的抑黃曲霉效果。但本試驗(yàn)僅對分離菌株進(jìn)行抑黃曲霉篩選和初步鑒定，7株菌株間抑菌效果差異顯著(P<0.05)。菌株Q13，Q28，Q39和Q40有良好的耐低溫和耐低pH能力，在16小時(shí)Q39和Q40的pH值分別降低到3.61和3.59，相比楊澤敏等[41]篩選的鯉魚源植物乳桿菌更低；菌株Q28，Q40，Q44，Q11和Q39對碳源利用相比于另外兩株更好，與尹雪等[12]篩選的3株抑黃曲霉乳酸菌相比可發(fā)酵碳源種類更多；菌株Q44和Q11在培養(yǎng)初期生長緩慢，生長速度顯著低于另外5株(P<0.01)，同時(shí)在發(fā)酵4～24 h菌株pH值均顯著低于另外5株菌株(P<0.01)。綜上，作為全株玉米青貯發(fā)酵的備選添加菌株Q39和Q40有更好的應(yīng)用前景，但關(guān)于菌株的功能特性和抑菌機(jī)制尚不明確，仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

從玉米青貯飼料中初步分離到50株乳酸菌資源，利用雙層平板法對菌株抑黃曲霉能力初篩，并結(jié)合碳源利用情況、生長及產(chǎn)酸速率最終得到2株有明顯抑制效果的菌株，Q39和Q40，其抑菌圈直徑為4.15 cm和4.17 cm，為革蘭氏陽性同型發(fā)酵乳酸菌；經(jīng)16S rDNA序列同源性分析并結(jié)合生理生化試驗(yàn)確定Q39和Q49為植物乳桿菌，Q11，Q13，Q28，Q40和Q44為戊糖乳桿菌，菌株Q39和Q40可作為全株玉米青貯發(fā)酵的備選添加菌株。