日本結縷草ZjTCP20基因生物信息學及表達模式分析

楊卓雄， 董 笛， 韓烈保，晁躍輝

(北京林業(yè)大學， 北京 100083)

TCP轉(zhuǎn)錄因子是高等植物所特有的轉(zhuǎn)錄因子小家族，由三個特征成員玉米的TEOSINTE BRANCHRED 1(TB1)、金魚草(Antirrhinummajus)的CYCLOIDEA(CYC)以及水稻(Oryzasativa)的PROLIFERATING CELL FACTORS(PCFs)命名[1]。TCP結構域包含一個非典型的堿性-螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)結構域，涉及DNA結合、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)核定位[2]?；诎被嵝蛄械牟町?，特別是在TCP結構域的基本區(qū)域，TCP轉(zhuǎn)錄因子家族可進一步分為Ⅰ類和Ⅱ類兩個亞家族，Class Ⅰ類的TCP也稱作TCP-P類，以水稻中的PCF1與PCF2為代表，Class Ⅱ類的TCP也稱作TCP-C類，以金魚草中的CYC和玉米中的TB1為代表[3]。與Class Ⅰ的成員相比，Ⅱ類成員在TCP結構域多有四個氨基酸殘基，例如谷氨酸-半胱氨酸-谷氨酸(ECE)延伸，一些Ⅱ類蛋白質(zhì)包含一個由極性氨基酸組成的保守R結構域，通過形成親水螺旋介導蛋白質(zhì)相互作用[2,4]。Ⅱ類成員可以根據(jù)TCP結構域中的序列差異進一步細分為CIN和CYC兩個分支，CIN子代以CINCINNATA(CIN)為代表，而CYC子代以CYC/TB1為代表[5-6]。

TCP轉(zhuǎn)錄因子在植物發(fā)育過程中起著至關重要的作用。研究表明Class Ⅱ類中的CIN和CYC兩個分支主要參與植物發(fā)育，但Class Ⅰ類的基因的作用則與之相反，在調(diào)控葉片發(fā)育過程中最為明顯，Ⅱ類基因抑制細胞增殖，而Ⅰ類則是正向調(diào)控[7]。此外，在Ⅰ類TCP轉(zhuǎn)錄因子成員中，擬南芥(Arabidopsisthaliana)的TCP14和TCP15分別參與了葉片和花發(fā)育過程中細胞增殖的激活和抑制[8]。TCP1通過與DWF4啟動子相互作用，調(diào)控DWF4的轉(zhuǎn)錄，進一步調(diào)控植物的生長發(fā)育[9]。擬南芥AtTCP23過表達株系顯示出晚花表型和葉片形態(tài)改變，表明AtTCP23參與了對開花時間和發(fā)育的調(diào)控[10]。在Ⅱ類TCP轉(zhuǎn)錄因子成員中，CIN基因參與了側(cè)向器官的發(fā)育及調(diào)控細胞分裂素和生長素信號轉(zhuǎn)導，CYC/TB1基因與植物開花有關[11]。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析，將CYC/TB1基因進一步分為三類(CYC1,CYC2和CYC3)[12]。CYC1基因在控制腋芽分化和分枝中起著重要作用，CYC2基因在控制花的正向和背面對稱性中起著重要作用，而CYC3在花原基和側(cè)枝中均有表達，但對花分枝的控制不大[4,12-13]。

TCP20是Ⅰ類TCP轉(zhuǎn)錄因子中的成員，屬于古老植物特有的基因家族，可調(diào)控植物芽、花和胚的發(fā)育[14]。在擬南芥中，AtTCP20可以促進生長素的合成，對茉莉酸的代謝起負調(diào)控作用[15-16]。有研究顯示，AtTCP20可介導擬南芥根部的硝酸鹽吸收的系統(tǒng)信號通路，tcp20突變體在根生長方面有缺陷，但在根的硝酸鹽吸收反應中沒有缺陷[17]。

日本結縷草(Zoysiajaponica)是禾本科(Gramineae)結縷草屬(Zoysia)多年生草本，主要用于運動場地草坪。屬于暖季型草坪草喜溫暖濕潤氣候，喜光，且有一定的耐陰性，抗旱、抗鹽堿、耐瘠薄、耐踐踏[18-19]。TCP基因家族廣泛存在與高等植物中，但關于TCP20基因的研究鮮有報道，因此本研究通過對日本結縷草ZjTCP20基因的克隆及生物信息學分析來為TCP轉(zhuǎn)錄因子提供科學依據(jù)，也有助于后續(xù)研究日本結縷草的生長發(fā)育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試劑

試驗采用的日本結縷草種由北京林業(yè)大學草坪分子實驗室提供，放置人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)，晝夜相對時長為14/10 h，溫度為26℃，濕度為60%?？寺≥d體pMD19-T、T4 DNA連接酶、反轉(zhuǎn)錄Prime Script RT試劑盒、限制性核酸酶NcoⅠ和EcoRⅠ、酵母轉(zhuǎn)化試劑盒和熒光定量試劑TB Green Premix Ex Taq Ⅱ購買于TaKaRa公司。RNA提取試劑盒Plant RNA Kit、PCR純化試劑盒Cycle-Pure Kit、細胞質(zhì)粒提取試劑盒Plasmid mini KitⅠ等購買于OMEGA公司。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購買于博雅宏興，酵母菌株Y2HGold、酵母陽性對照質(zhì)粒pGBT9、陰性對照BD空載、農(nóng)桿菌EHA105、植物表達載體3302-3flag等，均來自北京林業(yè)大學草坪分子實驗室。脫落酸等植物激素購自SIGMA公司。其它應用的試劑均為國內(nèi)分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1引物設計 引物設計應用軟件Primer Premier 5[19]?；谝阎娜毡窘Y縷草參考基因組序列及本實驗室測定的轉(zhuǎn)錄組信息設計特異性引物ZjTCP20-F和ZjTCP20-R擴增ZjTCP20基因以所獲得的ZjTCP20全長序列[20]。并且以BD載體的序列為基礎，設計BD載體連接引物BD-TCP20-F和BD-TCP20-R。設計引物3302Y-TCP20-F及3302Y-TCP20-R用于35S-ZjTCP20-YFP的載體構建。日本結縷草Actin基因作為內(nèi)參，內(nèi)參引物分別為ZjActin-F以及ZjActin-R，ZjTCP20-qPCR-F和ZjTCP20-qPCR-R以ZjTCP20基因序列為基礎，作為熒光定量檢測的特異性引物(表1)。

表1 本試驗所用引物序列Table 1 Primer sequences used in the experiment

1.2.2基因克隆 日本結縷草經(jīng)1個月生長成熟后，剪取葉片將其研磨，按照試劑盒說明提取總RNA并進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。利用ZjTCP20-F和ZjTCP20-R對cDNA進行擴增，反應程序為95℃/ 10 min；95℃/15 s，58℃/30 s(—0.1℃/cycle)，72℃/90 s，30個循環(huán)；72℃/5 min，12℃保溫。凝膠電泳檢測后，將其與T載相連，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，挑取在Amp抗性LB培養(yǎng)基上大腸桿菌單菌落，進行檢測，選擇符合長度要求的菌落送至生物公司測序，選擇測序正確的菌落進行保菌和質(zhì)粒提取。

1.2.3生物信息學分析 使用ExPASy網(wǎng)站(http://expasy.org/)對蛋白質(zhì)長度、等電點、分子量、疏水性等性質(zhì)進行分析[21]。利用Phyre 2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)工具預測蛋白質(zhì)三級結構[22]。根據(jù)SignalP 4.1網(wǎng)站(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測信號肽[23]。通過NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene)查找TCP20同源蛋白[24]。利用MEME網(wǎng)站(http://meme-suite.org/tools/meme)以及TBtools、MEGA 5.0 軟件進行保守結構域以及系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析[25-26]。

1.2.435S-ZjTCP20-YFP載體構建及亞細胞定位 利用特異性引物3302Y-TCP20-F和3302Y-TCP20-R擴增模板pMD-ZjTCP20，并且使用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ酶切35S-YFP載體，利用無縫鏈接酶連接PCR產(chǎn)物和35S-YFP載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。對構建成功的載體，將其質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105，注射本生煙草葉片，然后將煙草置于黑暗環(huán)境下培養(yǎng)48 h，共聚焦顯微鏡下觀察YFP信號在細胞中的分布情況[27]。

1.2.5BD-ZjTCP20載體的構建及Y2HGold酵母的轉(zhuǎn)化 利用引物BD-TCP20-F和BD-TCP20-R，擴增pMD-ZjTCP20模板，并用限制性內(nèi)切酶Nco Ⅰ酶切載體BD，純化后，將切好的載體與PCR產(chǎn)物連接，構建BD-TCP20載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)DH5α中。使用BD載體的通用引物3’ BD和T7對單菌落進行驗證，選擇長度接近的單菌落送至生物公司測序。大量提取測序準確的載體質(zhì)粒，并將其陽性對照pGBT9質(zhì)粒和陰性對照BD空載按照酵母轉(zhuǎn)化試劑盒要求一起轉(zhuǎn)到大腸桿菌Y2H菌株中。

1.2.6轉(zhuǎn)錄自激活試驗 將轉(zhuǎn)化的BD-ZjTCP20的Y2HGold酵母菌株涂于SD/-Trp平板上，比較BD和BD-ZjTCP20在培養(yǎng)基上菌落呈現(xiàn)的狀態(tài)。然后將轉(zhuǎn)化BD-TCP20載體成功的Y2HGold酵母涂于SD/-Trp、SD/-Trp/X-a-Gal、SD/-Trp/X-a-Gal/AbA培養(yǎng)基上，在30℃下孵育。觀察Y2HGold酵母菌株的生長狀態(tài)和菌株顏色進行記錄及統(tǒng)計。

1.2.7實時熒光定量PCR 采集植物幼嫩葉片，成熟葉片和衰老葉片以及成熟的莖和根。對成熟葉片分別噴施10 μmol·L-1濃度的赤霉素及0.5 mmol·L-1濃度的水楊酸，取6個時間點0，1，3，6，12和24 h的葉片樣品。將上述所有樣品立即液氮速凍，并研磨提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。內(nèi)參引物為ZjActin-F和ZjActin-R，設計特殊引物ZjTCP20-qPCR-F和ZjTCP20-qPCR-R按照試劑盒要求進行實時熒光定量。

1.2.8數(shù)據(jù)分析 利用SPSS進行顯著性分析(P<0.05)，利用Microsoft Excel 2010繪圖。

2 結果與分析

2.1 日本結縷草ZjTCP20基因的克隆

利用設計好的引物ZjTCP20-F和ZjTCP20-R對cDNA進行擴增，擴增出一條長624 bp的單一條帶，編碼208個氨基酸(圖1)。將其與T載相連，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，挑取在大腸桿菌單菌落，選擇符合長度要求的質(zhì)粒命名為pMD-ZjTCP20。

圖1 日本結縷草ZjTCP20基因的克隆Fig.1 Cloning of ZjTCP20 gene from Zoysia japonica注：A，ZjTCP20基因的PCR鑒定；B，ZjTCP20基因的cDNA序列及蛋白質(zhì)序列Note: A, PCR identification of ZjTCP20 gene;B,The cDNA sequence and protein sequence of the ZjTCP20 gene

2.2 日本結縷草ZjTCP20蛋白質(zhì)結構分析

ZjTCP20分子式為C909H1397N277O287S7，由208個氨基酸組成，分子量為21.02 kD，理論等電點為5.55。在蛋白二級結構組件中，隨機線圈占比高達69%，α螺旋占比為46%，β鏈的含量占比最少，為1%(圖2A)。蛋白質(zhì)三級結構結果預測ZjTCP20蛋白由螺旋和環(huán)構成(圖2B)。利用SignalP 4.1 網(wǎng)站預測ZjTCP20蛋白質(zhì)，結果顯示無信號肽(圖2C)。ZjTCP20蛋白質(zhì)的疏水性圖譜如圖2D所示，數(shù)值大于0表示疏水性，小于0則表示親水性?？偲骄H水性為-0.250，則ZjTCP20可能為親水蛋白。

圖2 日本結縷草ZjTCP20蛋白結構預測Fig.2 Prediction structure of ZjTCP20 protein from Zoysia japonica注：A，ZjTCP20 蛋白的二級結構預測；B，ZjTCP20 蛋白的三級結構預測；C，ZjTCP20信號肽預測；D，ZjTCP20蛋白疏水性圖譜Note:A,Prediction secondary structure of ZjTCP20 protein;B,Prediction tertiary structure of ZjTCP20 protein;C,Prediction signal peptide of ZjTCP20 protein;D,Prediction hydrophobicity map of ZjTCP20 protein

2.3 日本結縷草蛋白進化樹及保守結構域分析

MEGA 5.0 及TBtools對TCP20 同源蛋白進行比對并繪制系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結果顯示日本結縷草中的TCP20蛋白與玉米中ZmTCP20最相似(圖3)。蛋白的保守結構域分析顯示TCP20蛋白內(nèi)有三段最為保守的結構域，ZjTCP20 蛋白與BrTCP20 蛋白等其他TCP20蛋白相比缺少了一段蛋白結構域(圖4)。

圖3 日本結縷草ZjTCP20蛋白的遺傳進化樹分析Fig.3 Phylogenetic analysis of ZjTCP20 protein from Zoysia japonica注：RcTCP20表示QXP08756.1 月季(Rosa chinensis)TCP20-like，PhTCP20表示QZI95745.1 二球懸鈴木(Platanusx hispanica)TCP20-like，JcTCP20表示XP_012085729.1 麻風樹(Jatropha curcas)TCP20-like，CmTCP20表示QBK47072.1 杭白菊(Chrysanthemum x morifolium)TCP20-like，DcTCP20表示PKU81455.1 鐵皮石斛(Dendrobium catenatum)TCP20-like，ZmTCP20表示NP_001142396.1 玉米(Zea mays)TCP20-like，AtTCP20表示OAP02465.1 擬南芥(Arabidopsis thaliana)TCP20-like，BrTCP20表示ATG83546.1 蕪菁(Brassica rapa subsp. Rapa)TCP20-likeNote：RcTCP20 stands for Rosa chinensis TCP20-like,PhTCP20 stands for QZI95745.1 Platanusx hispanica TCP20-like,JcTCP20 stands for XP_012085729.1 Jatropha curcas TCP20-like,CmTCP20 stands for QBK47072.1 Chrysanthemum x morifolium TCP20-like,DcTCP20 stands for PKU81455.1 Dendrobium catenatum TCP20-like,ZmTCP20 stands for NP_001142396.1 Zea mays TCP20-like,AtTCP20 stands for OAP02465.1 Arabidopsis thaliana TCP20-like,BrTCP20 stands for ATG83546.1 Brassica rapa subsp. Rapa TCP20-like

圖4 TCP20蛋白的保守結構域分析Fig.4 The conserved motifs analysis of TCP20 proteins

2.4 日本結縷草ZjTCP20亞細胞定位分析

為研究ZjTCP20在細胞中的定位情況，將構建完整的 35S-ZjTCP20-YFP載體轉(zhuǎn)化EHA105農(nóng)桿菌，注射本生煙草葉片，結果顯示ZjTCP20 蛋白定位在葉綠體、細胞質(zhì)和細胞核上(圖5)。

圖5 日本結縷草ZjTCP20 亞細胞定位情況Fig.5 Subcellular localization of ZjTCP20 from Zoysia japonica注:A，融合場；B，葉綠體自發(fā)熒光；C，激發(fā)光Note:A,Merged;B,Chloroplast autofluorescence;C,Ultraviolet field

2.5 酵母自激活檢測

轉(zhuǎn)入BD-TCP20載體、陽性對照pGBT9載體和陰性對照BD空載的Y2HGold酵母在SD/-Trp的培養(yǎng)基內(nèi)生長正常，且BD-TCP20和陽性對照在SD/-Trp/X-a-Gal培養(yǎng)基和SD/-Trp/X-a-Gal/AbA培養(yǎng)基內(nèi)可以正常生長，形成藍色菌斑(圖6A，6B)，BD空載不能形成藍色菌斑(圖6C)，證實ZjTCP20具備自激活活性。

2.6 日本結縷草ZjTCP20基因表達模式分析

通過RT-PCR試驗研究日本結縷草ZjTCP20基因在不同組織器官、葉片不同發(fā)育時期及不同激素處理的表達模式。結果表明，該基因在葉片中大量表達，且與根和莖的表達量有顯著差異(圖7A)。在葉片不同發(fā)育時期下，ZjTCP20基因在幼嫩葉片中大量表達，隨植物生長基因表達量不斷下降(圖7B)。經(jīng)脫落酸(ABA)處理后，ZjTCP20基因的表達沒有顯著差異(圖7C)，這表明ZjTCP20基因很可能不受ABA激素的誘導。經(jīng)水楊酸(SA)處理后，ZjTCP20表達量在噴施6 h后顯著下降，但總體沒有顯著差異(圖7D)。經(jīng)茉莉酸甲酯(MeJA)處理后，ZjTCP20表達量在3 h沒有顯著差異，但在6 h迅速升高，總體沒有顯著差異(圖7E)。

圖7 日本結縷草中的ZjTCP20的表達模式Fig.7 Expression patterns of ZjTCP20 in Zoysia japonica

3 討論

轉(zhuǎn)錄因子參與特定生理或生化過程的調(diào)控，在調(diào)控植物非生物逆境脅迫方面發(fā)揮重要作用[28]。TCP是植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，在諸多植物中被鑒定出來，參與調(diào)控植物的生長發(fā)育、衰老及逆境應答等多個生物學過程[29-30]。根據(jù)氨基酸序列的差異,TCP轉(zhuǎn)錄因子可被分為Class Ⅰ和Class Ⅱ兩個亞家族，TCP20屬于Ⅰ類TCP轉(zhuǎn)錄因子中的成員[31]。本研究對日本結縷草ZjTCP20基因進行克隆、生物信息學分析、自激活檢測及表達分析來探究ZjTCP20基因的特性。從日本結縷草中克隆得到ZjTCP20完整編碼區(qū)有624 bp，編碼208個氨基酸。蛋白分子量為21.02 kD，具有疏水性，但不具信號肽。構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹有利于研究生物的進化關系，對TCP20同源蛋白進行比對，繪制系統(tǒng)發(fā)育進化樹顯示日本結縷草中的TCP20蛋白與玉米中ZmTCP20親緣關系最近[32]。亞細胞定位顯示ZjTCP20定位在葉綠體、細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)。酵母雙雜交系統(tǒng)主要應用于快速驗證蛋白之間的相互作用，將構建好的載體BD-TCP20 轉(zhuǎn)入酵母菌Y2HGold，其在SD/-Trp培養(yǎng)基上可以正常生長，且在SD/-Trp/X-a-Gal和SD/-Trp/X-a-Gal/AbA培養(yǎng)基上正常生長并形成藍色菌斑，其陽性對照pGBT9也可以形成藍色菌斑，而陰性對照BD空載不能形成藍色菌斑，證明ZjTCP20 可自激活，說明ZjTCP20不能用于酵母雙雜交系統(tǒng)。TCP轉(zhuǎn)錄因子的N末端擁有非典型螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)結構域，但TCP轉(zhuǎn)錄因子與bHLH轉(zhuǎn)錄因子沒有同源性，并結合不同于bHLH轉(zhuǎn)錄因子識別的DNA結構域[14]。根據(jù)蛋白質(zhì)二、三級結構預測，ZjTCP20屬于非典型的bHLH蛋白。

研究顯示I類和II類TCP的分子機制可能在拮抗關系中發(fā)揮作用[7]。TCP20可能與它相互作用的蛋白TCP4，充當靶基因轉(zhuǎn)錄的激活子或抑制子。TCP20等的I類TCP抑制茉莉酸生物合成基因LOX2(脂氧合酶2，LIPOXYGENASE2)，II類TCP4則可以激活其表達。隨著TCP4豐度的增加，LOX2的表達量以及茉莉酸產(chǎn)量在葉片發(fā)育后期增加。在葉片發(fā)育的早期，茉莉酸通過抑制細胞增殖影響細胞增殖向細胞膨脹轉(zhuǎn)變，而在葉片發(fā)育的晚期，茉莉酸誘導葉片衰老(圖8)[16]。表達模式結果顯示，該基因在葉片中大量表達，與根系和莖的表達量存在顯著差異，且相對于成熟和衰老葉片，ZjTCP20基因在幼嫩葉片中大量表達，并與成熟和衰老葉片的基因表達量存在顯著差異。激素處理后，該基因不受脫落酸(ABA)誘導，在水楊酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)的誘導下ZjTCP20基因表達總體沒有顯著差異。ZjTCP20響應茉莉酸調(diào)控的相關研究有待后續(xù)試驗進行探究。后續(xù)研究中可通過研究表達模式及激素含量測定，探究ZjTCP20基因應答茉莉酸的機制，為ZjTCP20基因的功能提供更多參考依據(jù)。

圖8 I類及II類TCP轉(zhuǎn)錄因子拮抗調(diào)控葉片發(fā)育模型Fig.8 Leaf development model for antagonistic regulation by Class I and Class II of TCP transcription factors注：I類TCP，TCP20，TCP9；II類TCP，TCP4Note:Class I TCP,TCP20,TCP9;Class II TCP,TCP4

4 結論

本試驗將ZjTCP20基因從日本結縷草中成功克隆出，共624 bp，編碼208個氨基酸殘基。ZjTCP20蛋白預測結果表明該蛋白不具有信號肽，具有疏水性，通過蛋白質(zhì)二級、三級結構預測，發(fā)現(xiàn)其屬于非典型的bHLH蛋白。系統(tǒng)發(fā)育進化樹顯示ZjTCP20蛋白與玉米ZmTCP20親緣關系最近。亞細胞定位結果顯示其定位在葉綠體、細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)。酵母雙雜交試驗發(fā)現(xiàn)，載體BD-TCP20 在SD/-Trp培養(yǎng)基上可正常生長，在SD/-Trp/X-a-Gal和SD/-Trp/X-a-Gal/AbA培養(yǎng)基上生長且形成藍色菌斑，ZjTCP20可自激活。ZjTCP20表達模式分析顯示，該基因在葉片中大量表達，且在幼嫩葉片中大量表達，隨植物葉片發(fā)育該基因的表達量逐漸減少，但三種激素ABA,SA和MeJA不能誘導該基因顯著性表達。