基于NF-κB 信號(hào)通路探討牛膝總皂苷治療膝骨性關(guān)節(jié)炎滑膜炎癥效果機(jī)制*

任立桐 姚志城 喻曉龍

[1.北京中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院（龍崗）急診科，廣東 深圳 518172；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院（龍崗）骨傷科，廣東 深圳 518172]

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是一種由許多因素造成的關(guān)節(jié)退行疾病[1]，常見于老年人。隨著老齡化的逐漸加深，以及肥胖人群的增加，患骨關(guān)節(jié)炎的患者有明顯上升趨勢(shì)。骨關(guān)節(jié)炎的主要特征表現(xiàn)在軟骨上[2]，關(guān)節(jié)炎讓軟骨退化，引起軟骨下骨的變化，以及造成骨贅形成、滑膜炎癥和骨關(guān)節(jié)炎，并逐步損壞關(guān)節(jié)軟骨，讓患者的關(guān)節(jié)功能受限，肌肉僵硬。雖然當(dāng)前仍然沒(méi)有明確引發(fā)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病因素，但是有報(bào)道顯示，骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病因素被年齡、性別、肥胖等影響。研究[3]顯示，目前已確認(rèn)NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子在骨關(guān)節(jié)炎中表達(dá)非?；钴S，也是導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎的疾病因子。NF-κB 在骨關(guān)節(jié)炎的許多發(fā)病環(huán)節(jié)都有體現(xiàn)，比如軟骨細(xì)胞分解代謝、軟骨細(xì)胞存活和滑膜炎癥。另有研究[4，5]表明，在骨關(guān)節(jié)炎軟骨中SOX9 的基因表達(dá)水平降低[4]，并且SOX9 的蛋白表達(dá)水平也有降低，而miR-19a 作為一種新的生物標(biāo)志物，具有非入侵、敏感以及可靠的特性，多用來(lái)診斷和評(píng)估多種惡性腫瘤以及其他炎癥性疾病。還有研究[6]發(fā)現(xiàn)，牛膝總皂苷對(duì)關(guān)節(jié)軟骨具有保護(hù)作用，同時(shí)能達(dá)到保護(hù)軟骨細(xì)胞的目的。因此，本研究旨在基于NF-κB 信號(hào)通路探討牛膝總皂苷治療膝骨性關(guān)節(jié)炎滑膜炎癥的效果機(jī)制，現(xiàn)作報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 動(dòng)物選擇SPF 級(jí)SD 大鼠60 只，雌雄各半，10 周齡，體質(zhì)量（260±10）g，購(gòu)自廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：scxK（閩）2021—012。將大鼠分籠飼養(yǎng)，按照需求飲食，調(diào)節(jié)室內(nèi)溫度至適宜。本動(dòng)物研究實(shí)驗(yàn)已經(jīng)過(guò)批準(zhǔn)。

1.1.2 藥物牛膝總皂苷（Total saponins of achyranthes，TSA，（陜西森弗生物技術(shù)有限公司），含量70.2%；TRIzol 試劑、PrimeScriptTMRT 試劑盒（美國(guó)Sigma 公司）；SYBR Premix Ex Taq 實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒（日本Takara 公司）；SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒（美國(guó)BD 公司）；蛋白酶抑制劑、BCA 蛋白質(zhì)試劑盒、蛋白酶抑制劑的放射免疫沉淀測(cè)定緩沖液（北京索萊寶科技有限公司）；PVDF 膜（美國(guó)PeproTech 公司）；SOX9、NF-κB 一抗、單克隆GAPDH 抗體、熒光染料標(biāo)記的二抗（武漢博士德生物有限公司）；引物由上海羽朵生物科技有限公司合成。

1.2 方法大鼠隨機(jī)分成5 組：對(duì)比組、模型組、牛膝總皂苷低劑量組（15 mg·kg-1）、牛膝總皂苷中劑量組（30 mg·kg-1）、牛膝總皂苷高劑量組（50 mg·kg-1），每組12 只。除對(duì)比組外，其他各組大鼠在關(guān)節(jié)兩側(cè)進(jìn)針，從第1 天開始每間隔2 d 分別注射0.3 mL l5%木瓜蛋白酶水溶液（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)：MFCD00131791）到大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)。隨后采用kquesne MG 評(píng)估方式，對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)進(jìn)行評(píng)估，若評(píng)分＞4 分則表示模型建立成功；在建造好模型后第7 天，讓牛膝總皂苷低、中、高劑量組分別進(jìn)行灌胃，計(jì)量分別為牛膝總皂苷60、120、240 μg/g，對(duì)比組和模型組用相等體積的水進(jìn)行灌胃，每天1 次，連續(xù)1 個(gè)月。

1.3 觀察指標(biāo)（1）各組大鼠的炎癥程度比較。給藥完成后，對(duì)大鼠關(guān)節(jié)炎癥進(jìn)行評(píng)分，按照腫脹嚴(yán)重程度分為5 級(jí)，0 分無(wú)腫脹、1 分為輕度、2 分為中度、3分為嚴(yán)重、4 分為變形。（2）各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞miR-19a、SOX9、NF-κB 表達(dá)水平比較。選用TRIzol試劑，提取膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞總DNA，檢測(cè)miR-19a、SOX9、NF-κB 基因水平。（3）各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞SOX9、NF-κB 蛋白表達(dá)水平比較。使用1%的蛋白酶抑制劑檢測(cè)緩沖液，得到膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞總蛋白質(zhì)，再使用BCA 蛋白試劑盒檢測(cè)其濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法研究數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，行χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以（）表示，行t 檢驗(yàn)。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞miR-19a、SOX9、NF-κB 表達(dá)水平比較與對(duì)比組比較，模型組的miR-19a 表達(dá)水平較低，SOX9、NF-κB 表達(dá)水平較高（P ＜0.05）；使用了牛膝總皂苷的3 組，按照劑量的不同，miR-19a 表達(dá)水平從低劑量到高劑量依次增高（P ＜0.05），而SOX9、NF-κB 表達(dá)水平依次降低（P ＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞miR-19a、SOX9、NF-κB 表達(dá)水平比較 （）

表1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞miR-19a、SOX9、NF-κB 表達(dá)水平比較 （）

注：與對(duì)比組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與牛膝總皂苷低劑量組比較，3）P＜0.05；與牛膝總皂苷中劑量組比較，4）P＜0.05。

2.2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹度程度比較與對(duì)比組比較，模型組的腫脹程度相對(duì)嚴(yán)重（P ＜0.05），使用了牛膝總皂苷的3 組，按照劑量的不同，服用劑量從低到高關(guān)節(jié)腫脹程度依次減輕，牛膝總皂苷中劑量組腫脹程度評(píng)分低于牛膝總皂苷低劑量組，牛膝總皂苷高劑量組腫脹程度評(píng)分低于牛膝總皂苷低劑量組和中劑量組（P ＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹度程度評(píng)分比較 （，分）

表2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹度程度評(píng)分比較 （，分）

注：與對(duì)比組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與牛膝總皂苷低劑量組比較，3）P＜0.05；與牛膝總皂苷中劑量組比較，4）P＜0.05。

2.3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞SOX9、NF-κB 蛋白表達(dá)水平比較與對(duì)比組比較，模型組SOX9、NF-κB 蛋白表達(dá)水平較高，使用了牛膝總皂苷的3 組，按照劑量的不同，SOX9、NF-κB 蛋白表達(dá)水平從低劑量到高劑量依次降低（P ＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞SOX9、NF-κB 蛋白表達(dá)水平比較（）

表3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞SOX9、NF-κB 蛋白表達(dá)水平比較（）

注：與對(duì)比組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與牛膝總皂苷低劑量組比較，3）P＜0.05；與牛膝總皂苷中劑量組比較，4）P＜0.05。

3 討論

過(guò)往實(shí)驗(yàn)[7]證明，SOX9 是NF-κB 的靶基因，而NF-κB 是影響骨關(guān)節(jié)炎的主要因子，NF-κB 會(huì)引起軟骨細(xì)胞凋亡，如果使用川芎嗪則可以通過(guò)調(diào)節(jié)SOX9 來(lái)保護(hù)軟骨細(xì)胞免受誘導(dǎo)引起損傷。近年有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[8]，通過(guò)NF-κB 的過(guò)表達(dá)能夠模擬骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程，而使用NF-κB 拮抗劑可抑制NF-κB 的表達(dá)水平。同樣，如果NF-κB 在軟骨以及滑膜組織中表達(dá)水平居高[9]，可以用NF-κB 拮抗劑降低NF-κB 的表達(dá)水平。由此可見，NF-κB 在降低軟骨基質(zhì)膠原蛋白和蛋白多糖合成分泌，修復(fù)軟骨損傷，加快骨關(guān)節(jié)炎的過(guò)程中有巨大作用。并且，有其他研究[10]表明，miR-19a 的過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞的活躍度和遷移，從而抑制細(xì)胞凋亡，這說(shuō)明miR-19a 對(duì)控制軟骨細(xì)胞的生成有很大作用。

本研究顯示，與對(duì)比組比較，模型組的膝關(guān)節(jié)腫脹程度較嚴(yán)重，miR-19a 的基因表達(dá)水平較低，而SOX9、NF-κB 的基因水平表達(dá)較高，使用牛膝總皂苷的3 組，根據(jù)劑量的增加腫脹水平依次降低，miR-19a基因表達(dá)水平依次增加，而SOX9 以及NF-κB 的基因表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平依次降低。這說(shuō)明牛膝總皂苷可上調(diào)miR-19 的表達(dá)[11]，從而激活SOX9mRNA 以及SOX9 蛋白表達(dá)，能在一定程度上抑制NF-κBmRNA 表達(dá)和蛋白表達(dá)。綜上所述，牛膝總皂苷能減輕骨關(guān)節(jié)炎的炎癥癥狀，并且能通過(guò)上調(diào)miR-19a 的表達(dá)，抑制SOX9、NF-κB 的表達(dá)水平，保護(hù)軟骨細(xì)胞的凋亡，采用牛膝總皂苷的治療方案可在臨床上大力推廣。