組學技術在紅曲霉研究中應用的進展

王昌祿, 王旭鋒, 丁成芳, 丁文濤, 郭慶彬

(天津科技大學 食品科學與工程學院/省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室,天津 300457)

紅曲霉是一種絲狀真菌,將紅曲霉接種于大米發(fā)酵而成的紅曲米在中國及周邊國家擁有上千年的食用歷史。紅曲霉以其豐富的有益代謝產物(如紅曲色素、莫納克林K、γ-氨基丁酸、麥角甾醇和紅曲多糖等)[1],在食品、藥品及化妝品等工業(yè)領域有較大的應用潛力,受到了全球的廣泛關注。

分子生物學技術和組學技術的發(fā)展,為紅曲霉的研究和提高其生產性能提供了有效手段[2]。組學是研究生物體各種組分之間關系的學科,強調從整體的角度出發(fā)去研究細胞結構、基因、蛋白及其分子間相互作用,以掌握DNA、RNA、蛋白質和代謝產物的基本狀態(tài),從而對生物系統(tǒng)進行全面解讀。組學包括基因組學、蛋白質組學、代謝組學、轉錄組學、脂類組學、免疫組學及糖組學等。目前,已經對十余個紅曲霉基因組數(shù)據進行了分析和研究,有近百篇與紅曲霉生長發(fā)育、代謝調控相關的轉錄組學、蛋白質組學及代謝組學文獻作為支撐,為闡明紅曲霉的代謝機制提供了有力的數(shù)據支持。通過對紅曲霉組學技術進行系統(tǒng)闡述,可以幫助人們全面了解組學技術在紅曲霉研究和應用中的重要作用。因此,本研究系統(tǒng)闡述了基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學等組學技術在紅曲霉次級代謝產物研究中的最新進展,以期為進一步開發(fā)利用紅曲霉基因資源、對紅曲霉進行深入研究及其代謝產物的生產和應用提供參考。

1 組學技術在紅曲霉研究中應用的熱點

以Web of Science(WOS)數(shù)據庫為例,分析了近20年紅曲霉組學研究的文獻及其關鍵詞。紅曲霉組學研究按研究方法可分為基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學,其中,轉錄組學文獻占比超過45%,是紅曲霉組學研究中最常用的技術,表明轉錄組學在紅曲霉研究中占據十分重要地位。此外,多組學聯(lián)用是近年來紅曲霉研究的一個熱點趨勢,尤其是各組學與轉錄組學聯(lián)用的研究,在紅曲霉次級代謝產物代謝調控機制分析及新型調控因子挖掘方面發(fā)揮關鍵作用。

通過關鍵詞出現(xiàn)頻率對紅曲霉研究的熱點主題進行了解析,研究最多的紅曲霉種類分別為紅色紅曲霉(Monascusruber)、紫色紅曲霉(Monascuspurpureus)和叢毛紅曲霉(Monascuspilosus);研究最廣泛的次級代謝產物依次為紅曲色素(monascus pigments,MPs)、桔霉素(citrinin,Cit)和莫納克林K(monacolin K,MK),色素和桔霉素是當前研究的熱點問題,如何在紅曲色素等相關產品生產中控制其安全性仍然是目前紅曲霉在食品工業(yè)等領域進行應用的主要研究方向之一。

2 組學技術在紅曲霉研究中的應用

2.1 基因組學

2.1.1種屬進化分析

微生物基因組學已經非常成熟的應用于微生物種群分析、種屬間差異和進化地位分析等研究中。Chen等[3]研究了食品加工與安全領域具有代表性的12種絲狀真菌,并對它們的tRNA基因分布、密碼子使用模式和氨基酸組成等基因組特征進行了比較研究,發(fā)現(xiàn)紅曲霉與曲霉屬親緣性較近。Houbraken等[4]進一步通過系統(tǒng)發(fā)育分析證實了紅曲霉基因組序列與曲霉屬關系密切。

2.1.2次級代謝基因簇預測及功能解析

通過基因敲除等分子生物學手段,已基本確定了紅曲霉3種主要次級代謝產物——MPs、MK及Cit的生物合成基因簇(biosynthetic gene clusters,BGC)及其合成途徑[2]。然而,通過解析不同亞種的紅曲霉菌株的基因組及其代謝產物,發(fā)現(xiàn)不同菌株之間代謝產物差異較大,且次級代謝產物BGC也發(fā)生了明顯分化[5],這表明紅曲霉基因組差異是代謝產物多樣化的重要原因之一。研究者分別從基因組學的角度進一步補充和豐富了MPs合成代謝的基因簇功能及代謝調控因子[6-7]。Dai等[8]利用基因組學解析了4株紅曲霉MK合成相關基因在BGC上的差異,發(fā)現(xiàn)M.pilosusYDJ-1菌株缺失部分基因。同時,與土曲霉洛伐他汀(lovastatin,LOV)基因簇相比,紅曲霉MK的BGC規(guī)模較小。隨著更多紅曲霉基因組被測序[9-10],研究者發(fā)現(xiàn)MPs、MK和Cit的合成基因簇在種間存在普遍的基因丟失事件,其中Cit基因簇的丟失最為嚴重[10]。此外,Liu等[11]根據生物合成基因簇分布和系統(tǒng)發(fā)育結果,建立了一個新的分類系統(tǒng),將26個紅曲霉菌株劃分為A、B和C三大類,其中B類是Cit缺陷菌株,遺傳上不能合成Cit。此外,研究還發(fā)現(xiàn),MK和Cit在基因表達上似乎是互斥的。而A類中一株紅曲霉(M.sanguineus)同時缺失Cit和MK合成能力,為MPs菌株的選育提供了參考。因此,紅曲霉次級代謝產物BGC的丟失在紅曲霉進化中廣泛存在,可能是營養(yǎng)和能量競爭的適應性選擇。

越來越多的研究者通過比較泛基因組學方法分析了不同菌株MPs的合成和代謝的差異,同時,預測和解析了大量與MPs合成相關的基因[5,12-13]。此外,基因組學常用于挖掘潛在的候選功能基因,探究其對紅曲霉生長發(fā)育和次級代謝產物合成的影響[6,14]?；蚪M序列分析大大促進了紅曲霉種屬進化解析、次級代謝產物調控以及功能基因挖掘工作,可加深對紅曲霉遺傳和代謝的認識,有助于選育高產和更加安全穩(wěn)定的MPs等代謝產物有關的紅曲霉工業(yè)菌株。

2.2 轉錄組學

2.2.1基因簇的邊界校準

紅曲霉色素BGC基因圖譜已經基本確定,但由于不同菌株之間基因簇的基因存在缺失、突變等復雜特性,導致單獨使用基因組學分析在BGC功能預測中通常存在偏差。Liu等[15]采用計算分析和轉錄組分析相結合的方法來預測紅曲霉M7中MPs的BGC分布,結合基因敲除驗證預測結果,發(fā)現(xiàn)BGC由16個基因組成,從mrpigA延伸到mrpigP,外側較近區(qū)域的基因不屬于BGC的范圍。由此可見,單純的基因組生物信息學預測不能完整展現(xiàn)真實BGC,引入轉錄組學數(shù)據校準基因組預測結果可以更準確地確定次級代謝產物BGC的真實邊界。

2.2.2微生物互作關系分析

由紅曲霉和黑曲霉等共發(fā)酵獲得紅曲米的生產方式已經持續(xù)了上千年,但對紅曲米中共生微生物相互影響的作用機制尚未被有效證實。轉錄組學是當前從分子水平解析微生物代謝調控機制的常用手段之一,轉錄組學的特性要求其追求樣本較高的純凈度,而從混合菌種樣品中分離出單獨的轉錄本幾乎不可實現(xiàn)。Yuan等[16]巧妙設計了雙面細胞培養(yǎng)皿(double-sided petri dish,DSPD),研究了紅曲霉和黑曲霉自然共培養(yǎng)現(xiàn)象,發(fā)現(xiàn)二者是共生而非拮抗關系,且紅曲霉可促進黑曲霉孢子的生成,黑曲霉可以影響紅曲霉胞內、外MPs的種類。DSPD方法通過物理隔離方式克服了真菌共培養(yǎng)研究中的真菌生長速度不同、樣品分離困難等問題,成功獲得了兩種曲霉的轉錄本。遺憾的是,尚未見關于該研究中由轉錄組學數(shù)據對二者作用機制探討的報道。DSPD方法展現(xiàn)了其在研究微生物相互作用,特別是揭示了真菌間相互作用的潛在價值。

2.2.3環(huán)境因子及其代謝調控機制分析

2.2.3.1 化學調控因子

培養(yǎng)基組分作為微生物所需的營養(yǎng)成分,可為紅曲霉生長發(fā)育、次級代謝產物的合成提供必要的物質和能量來源,同時,在一定條件下也是一種環(huán)境刺激信號,參與紅曲霉各項生命活動的調節(jié)。已報道的對紅曲霉次級代謝產物合成有顯著調節(jié)作用的營養(yǎng)成分有單糖、淀粉、甘油等碳源,氨及銨鹽、硝酸鹽、蛋白胨等氮源。研究表明,糖酵解、丙酮酸代謝及三羧酸循環(huán)為MPs等次級代謝產物的合成提供了前體物質——乙酰輔酶A和丙酰輔酶A[7,17-18],而氮代謝過程也可直接或間接連接到三羧酸循環(huán)關鍵代謝環(huán)節(jié)[19],三羧酸循環(huán)是關聯(lián)初級代謝和次級代謝的關鍵樞紐。通過調節(jié)碳源的比例抑制中心碳代謝可以增加乙酰輔酶A庫,有助于提高MPs的產量[12]。而琥珀酸是三羧酸循環(huán)的中間產物,外源添加琥珀酸可顯著下調紅曲霉脂肪酸生物合成相關基因的表達,同時上調丙酮酸代謝相關基因的表達。通過對乙酰輔酶A生物合成代謝途徑的競爭調節(jié),進而提高MPs的產量[20]。此外,適當?shù)牡捶N類和水平不僅可以促進MPs的合成,而且還可以減少Cit的含量。深層發(fā)酵中以NH4Cl或NH4NO3為唯一氮源可顯著提高MPs(尤其是橙色素和紅色素)的產量并降低Cit的含量。轉錄組學表明,無機氮源可通過促進MPs前體的合成、降低Cit聚酮合酶的轉錄水平,降低Cit的合成[21]。而硝酸鹽通過上調mpigsA、mpigsH、mpigsK、mpigsL和mpigsP基因的表達,促進親水性黃色MPs的生物合成[22]。轉錄組學結合蛋白組學分析表明,這可能是MPs生物合成途徑(碳分解代謝、氨基酸代謝、聚酮合成和脂肪酸代謝)和分泌相關(細胞膜麥角甾醇生物合成和轉運)通路的上調表達共同作用的結果。

2.2.3.2 物理調控因子

光是調節(jié)真菌各種生理過程的重要環(huán)境因子。研究表明,紅光、綠光和藍光均可影響紅曲霉的生長發(fā)育和代謝活動。已經在紅曲霉中發(fā)現(xiàn)了紅光和綠光的受體蛋白,但目前尚未發(fā)現(xiàn)藍光蛋白。然而,轉錄組學研究表明,低劑量藍光通過上調芳香族氨基酸和支鏈氨基酸降解途徑、脂肪酸的β-氧化等途徑,可促進MPs生物合成前體(乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A)及能量(ATP和NADH)的供應,進而促進MPs的合成。而在高劑量藍光條件下會誘導紅曲霉分生孢子生長,體現(xiàn)對藍光誘導的應激防御[23]。這些結果表明,紅曲霉中可能存在與粗糙脈孢霉完全不同的藍光受體[24],需要進一步的研究。

靜磁場(static magnetic field,SMF)可提高紅曲霉初級代謝相關基因的轉錄水平,同時影響MPs、Cit和麥角甾醇生物合成途徑中相關基因的轉錄。轉錄組學分析表明,這種作用與有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路相關基因的轉錄密切相關。SMF通過MAPK信號通路,影響信息素應答通路、細胞壁完整性通路、高滲透壓通路和絲狀生長通路中大多數(shù)基因的轉錄水平,通過MAPK級聯(lián)的順序激活來激活下游轉錄因子,將SMF刺激與廣泛的細胞反應聯(lián)系起來[25]。已有研究表明,藍光和SMF或存在協(xié)同調控作用[26],而轉錄組學分析表明,MAPK信號通路顯著影響了二者作為環(huán)境信號的刺激應答[24-25],這或許有助于新型藍光受體的挖掘和驗證。

2.2.3.3 生長發(fā)育調控因子

真菌多糖是構成真菌細胞壁的重要組分,在生長發(fā)育、維持細胞穩(wěn)態(tài)、抵抗不良環(huán)境及控制物質轉運等方面發(fā)揮了重要作用。幾丁質是紅曲霉細胞壁的重要組分,研究表明,缺失幾丁質合成酶基因VI(chs6)可導致紅曲霉氣生菌絲短而稀疏,進而顯著降低活性孢子的發(fā)芽率,同時增加其對環(huán)境的敏感性[27]。比較轉錄組學發(fā)現(xiàn),與孢子發(fā)育和生長相關的途徑(包括MAPK信號途徑、幾丁質生物合成途徑以及調節(jié)因子LaeA和WetA)在發(fā)酵早期顯著下調,Cit等次級代謝產物的生物合成相關的基因表達也顯著下調。Xie等[28]利用比較轉錄組學探討了紅曲霉胞外多糖(extracellular polysaccharide,EPS)的生物合成機制,結果顯示,17種關鍵酶與EPS合成有關;與發(fā)酵2 d組相比,發(fā)酵4 d組差異表達基因主要集中在12個碳水化合物代謝亞類;但隨著發(fā)酵時間的延長,只有9個碳水化合物代謝子類中發(fā)生了富集,表明紅曲霉EPS的生物合成主要發(fā)生在碳水化合物代謝過程中。這些研究為紅曲霉中基于多糖的細胞生長和發(fā)育的研究提供了基因水平的重要參考。

2.2.4新轉錄調控因子的挖掘

得益于組學高通量測序和通路注釋,近年來在紅曲霉中相繼發(fā)現(xiàn)了許多新的轉錄調控因子。如酵母蛋白轉運子、ATP檸檬酸裂解酶、G蛋白亞基、MAPK、群體感應分子、促分裂素原活化蛋白激酶等。

酵母蛋白轉運子(yeast protein transports,Ypts),也稱為Ras相關結合GTPases(Rab),是小GTPases家族中最大的一組,已在真核細胞模型中被廣泛研究,并在膜轉運中發(fā)揮關鍵作用。紅曲霉中,Ypts同源基因mrypt7的缺失會導致菌絲徑向生長速度減慢、細胞內次級代謝產物的產量顯著增加。轉錄組學進一步表明,紅曲霉中MRYPT7蛋白可與許多參與紅曲霉M7生長、分生孢子發(fā)生、次生代謝生物合成和運輸?shù)幕蛳鄥f(xié)調。結合Ypt7同源物對其他真菌的類似作用,推測Ypt7是真菌中的一個全局調控因子[29]。

ATP檸檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase,ACL)在乙酰輔酶A的形成中起著關鍵作用,乙酰輔酶A是MPs生物合成的關鍵前體。Long等[30]研究了acl1和acl2基因,通過過表達acl1和acl2顯著增加ACL活性,導致乙酰輔酶A水平升高,并顯著提高了MPs總產量。轉錄組學測序分析表明,MPs合成過程中乙酰CoA和紅色MPs胺化過程中NH3的代謝通量密切相關,即ACL通過調節(jié)碳代謝和氨基酸代謝來調節(jié)紅曲霉MPs的合成。

異源三聚體G蛋白信號通路參與調節(jié)真菌的多種生物過程。Lei等[31]研究了紅曲霉M7 G蛋白3個α-亞基的功能。結合單基因和雙基因敲除及其轉錄組學數(shù)據,系統(tǒng)地分析和比較了Mga1～3的作用。研究表明,所有3個G蛋白α-亞基共同調節(jié)紅曲霉M7的生物過程,其中Mga1起主要作用,而Mga2和Mga3起補充作用。這些研究有助于深入了解不同G蛋白α-亞基對絲狀真菌生長、發(fā)育和次生代謝的影響。

MAPK是真核生物信號傳遞網絡中的重要途徑之一,調節(jié)著細胞的生長、分化、對環(huán)境的應激適應、炎癥反應等多種重要的細胞生理和病理過程,在基因表達調控和細胞質功能活動中發(fā)揮關鍵作用。在紅曲霉次級代謝產物合成調控中,已有多種代謝調控模型指向MAPK信號轉導途徑,例如紅曲霉響應藍光[23]和磁場信號[25]刺激觸發(fā)的轉錄調控。在較高強度的信號刺激時,可能通過觸發(fā)MAPK信號通路,進而提高多種次級代謝相關基因的轉錄水平,調控MPs、Cit等次級代謝產物的合成。然而,目前紅曲霉中完成觸發(fā)MAPK信號通路的感應分子尚未被發(fā)現(xiàn),MAPK信號通路末端直接參與調控次級代謝基因簇轉錄表達的受體因子也未被證實。因此,紅曲霉中MAPK信號通路的精細調控機制還需要進一步的實驗驗證。

群體感應(quorum sensing,QS)可調節(jié)絲狀真菌的菌絲體發(fā)育和次級代謝。在紅曲霉中,γ-丁內酯可顯著影響生長和菌絲形態(tài),促進MPs和MK的合成[32]。轉錄組學分析表明,γ-丁內酯與細胞生長、膜結構和能量代謝等途徑密切相關,表明γ-丁內酯在紅曲霉生長代謝中起QS分子的作用,并可能通過調節(jié)與細胞發(fā)育、次級代謝產物合成和能量代謝相關的基因的轉錄表達,進而影響紅曲霉的形態(tài)和次級代謝。

沉默信息調節(jié)因子2(silence information regulator 2,Sir2)家族是一類保守的去乙?；傅鞍准易?廣泛存在于多種生物中,具有依賴NAD+的去乙?；负虯DP-核糖轉移酶活性。Sir2在染色質沉默、基因調控、代謝調節(jié)和細胞壽命調節(jié)等眾多生命活動中發(fā)揮著重要作用。在紅曲霉中,缺失mrsir2(sir2同源基因)的菌株在生長階段積累了更多組蛋白H3亞基的乙?；嚢彼釟埢?表明其主要針對生長階段的H3亞基。此外,缺陷菌株菌絲過早老化,產生更多的孢子和次級代謝產物,并增強氧化應激。轉錄組學分析表明,MrSir2主要調節(jié)大分子代謝(如碳水化合物、蛋白質和核苷酸)中的基因表達以及編碼細胞壁合成和細胞膜成分的基因,表明MrSir2可能促進從最初生長階段到菌絲體衰老的代謝轉變[33]。

NADH-泛醌氧化還原酶核心亞基S8(NADH-ubiquinone oxidoreductase core subunit S8,NDUFS8)負責NADH氧化、泛醌還原和從線粒體中釋放質子。紅曲霉次級代謝產物的合成代謝與輔因子代謝密切相關。下調ndufs8表達,影響菌體形態(tài)及次級代謝產物的合成,還顯著地抑制呼吸復合物I、III及超氧化物歧化酶的酶活性,導致活性氧(ROS)水平升高和ATP濃度降低。轉錄組學進一步證實其參與呼吸鏈、三羧酸循環(huán)和脂肪酸降解等過程,同時,MPs和Cit基因表達水平顯著提高。因此,證實呼吸復合物I通過改變細胞內ROS和ATP水平,參與紅曲霉的細胞生長和次級代謝等重要生命活動[34]。

轉錄組學是紅曲霉代謝調控研究中使用最廣泛、最成功的組學技術,在基因及基因簇校準、代謝調控機制解析、調控因子的挖掘等方面發(fā)揮重要作用。此外,轉錄組學與其他組學的聯(lián)合使用,可以彌補單一組學的不足,并通過交互作用實現(xiàn)更精確地預測轉錄表達結果,從而全面地解釋生物學問題。

2.3 蛋白質組學

2.3.1關鍵酶等蛋白功能分析

蛋白質是體現(xiàn)生物學功能的最終載體,并且,作為調節(jié)因子的蛋白質在微生物生長發(fā)育、代謝調控等過程中發(fā)揮著重要作用。蛋白質組學的運用為解析蛋白質間的互作關系、揭示代謝調控機制提供了有效方法。近年來,隨著雙向凝膠電泳、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF/TOF MS)、串聯(lián)質譜(MS/MS)進行蛋白質組學分析、數(shù)據庫應用及分子生物學技術等的發(fā)展,為紅曲霉代謝調控中的蛋白質分析和鑒定提供了有效手段,如MrflbA和Erg4蛋白功能的解析。mrflbA是一種G蛋白α-亞基的調節(jié)因子,其敲除后導致菌絲體自溶,MPs沉著減少,真菌毒素產量降低,抗氧化酶和幾丁質酶活性升高。此外,mrflbA的缺失導致次級代謝產物(MPs和真菌毒素)的轉錄減少[35]。麥角甾醇合成酶(ERG4)基因Erg4的缺失降低了麥角甾醇濃度,并顯著提高了胞外MPs的產量。蛋白質組學分析表明,ERG4缺陷菌株促進了MPs的跨膜轉運,即細胞膜組分的轉變是促進MPs跨膜轉運的重要原因之一[36]。

2.3.2代謝途徑及代謝機制分析

為解析碳源調控紅曲霉代謝的作用機制,許多學者利用蛋白質組學技術對其進行了深入研究,提出了一系列調控理論,豐富和完善了紅曲霉次級代謝產物的調控機制。大米粉是紅曲霉發(fā)酵常用的碳源,與乳糖相比,紅曲霉細胞生長、紅色MPs的合成對大米粉缺乏的限制較為敏感。比較蛋白質組學分析表明,二者共有12種差異蛋白質,參與糖酵解、三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循環(huán)、能量產生、蛋白質折疊和肽生物合成等過程[37]。因此,推測來源于淀粉代謝的能量供應或許是限制紅曲紅胺合成的原因。然而,目前由橙色MPs到紅色MPs的合成一般認為是一個化學過程,環(huán)境中存在氨或者含氨基化合物可與MPs前體自主完成結合。因此,紅色MPs合成的減少,可能更多受制于前體物質的合成。以可溶性淀粉和甘油分別作為碳源,其MPs產量差異顯著,比較蛋白質組學分析表明,差異蛋白包括核糖體蛋白、熱休克蛋白等9個蛋白表達下調[17]。乙醇對紅曲霉生長和代謝調控的影響與支鏈氨基酸降解和乙醛脫氫酶表達水平有關,同時,熱休克反應相關的蛋白質的表達也被誘導。此外,乙醇處理可抑制聚酮合成代謝相關蛋白、脂肪酸合成酶、環(huán)氧化物水解酶和莽草酸代謝途徑相關蛋白的表達[38]。這些結果表明,不同碳源對紅曲霉生長和次級代謝的調控非常復雜,此外,MPs的合成調控與初級代謝中蛋白質的表達水平密切相關。

氮源方面,無機氮源硝酸鹽可促進親水性黃色MPs合成,主要是影響非核糖體肽合成酶、氧化還原酶、葡糖淀粉酶、內-1,4-β-羥化酶、O-乙?；呓z氨酸和異檸檬酸裂解酶等蛋白質的表達[22]。同時,細胞膜麥角甾醇生物合成和轉運分泌相關途徑也被顯著調節(jié),以促進MPs的跨膜轉運。氮源缺乏對紅色MPs合成的影響更大,氮源受限時,紅色MPs合成被顯著抑制,參與代謝調控的蛋白涉及氨基酸生物合成、蛋白質翻譯、抗氧化相關酶、糖酵解和轉錄調控等過程。這表明,氮源受到限制將誘導代謝流從糖酵解轉換為TCA循環(huán),以維持細胞能量穩(wěn)態(tài),并抑制用于紅色MPs生產的聚酮生物合成途徑[39]。當細胞受到高濃度氮源脅迫時,幾丁質和糖蛋白的合成將受到限制,導致細胞壁完整性降低,從而抑制細胞生長。此時,紅曲霉細胞開啟細胞保護機制,通過促進海藻糖合成、谷胱甘肽/谷胱甘肽氧還蛋白系統(tǒng),維持細胞內氧化還原狀態(tài),減少細胞的損傷。同時,與NADH脫氫酶相關的呼吸途徑被激活,以平衡物質和能量代謝[40]。

相似的結論也出現(xiàn)在磷酸鹽缺乏的例子中,研究顯示,磷酸鹽的缺乏會抑制紅曲霉紅色MPs的產生,通過蛋白質組學分析、數(shù)據庫比對以及相關蛋白質鑒定等手段,發(fā)現(xiàn)磷酸鹽缺乏的限制涉及的蛋白主要在糖酵解、能量代謝以及其他初級代謝等過程中。在發(fā)酵過程中,磷缺乏可誘導醛脫氫酶和糖酵解相關酶的上調表達,而葡萄糖胺:果糖-6-磷酸氨基轉移酶和ADP-核糖基化因子1等代謝酶的表達則被抑制[41]。因此,在相對穩(wěn)定環(huán)境中,碳、氮、磷等營養(yǎng)素可在一定程度上影響次級代謝產物的產量,但在惡劣環(huán)境中,生存策略促使細胞重新進行物質和能量平衡,抑制代謝過程及生長發(fā)育以維持細胞穩(wěn)態(tài)。

紅曲霉次級代謝產物的代謝調控機制相當復雜,蛋白質組學的運用促進了越來越多的功能蛋白的挖掘和鑒定。同時,蛋白質組學與轉錄組學、代謝組學等組學的聯(lián)合使用是當前組學研究的有效手段,可以彌補單一蛋白質組學研究的不足。

2.4 代謝組學

2.4.1紅曲霉代謝產物解析

代謝組學的研究主要基于代謝產物譜的分析和差異代謝產物向代謝途徑的映射,即對影響代謝產物合成的代謝途徑進行解析。通過色譜和質譜技術的聯(lián)合使用,大量紅曲霉合成的代謝產物被檢測和驗證。已知的紅曲霉代謝產物超過800種,含氨基酸和胺、有機酸、糖和糖醇[42]、酯類、烷類和聚酮化合物[43]、乙醇、綠原酸鹽、甘膽酸鹽[44]、維生素和輔酶及核苷酸[45]等。紅曲霉代謝產生的3類主要次級代謝產物MPs、MK和Cit都屬于聚酮類化合物,具有相同的合成前體(乙酰輔酶A和丙酰輔酶A)及類似的合成途徑。其中,MPs具有種類多樣的結構類似物和衍生物,目前已知的MPs種類超過50種。此外,紅曲霉還可以代謝產生多糖[46]、γ-氨基丁酸、二甲苯酸、類黃酮、植物甾醇及不飽和脂肪酸等生物活性化合物[2]。

2.4.2紅曲霉代謝途徑解析

MPs的生產中往往伴隨著Cit的產生,為MPs在食品工業(yè)中的應用帶來了風險。敲除Cit的BGC中基因pksCT[42]或添加外源誘導物(如染料木素)可以降低Cit的合成[44,47]。代謝組學分析表明,與Cit降低相關的差異代謝產物主要分布在氨基酸代謝途徑、糖酵解、丙酮酸合成及三羧酸循環(huán)等途徑。這些研究為MPs生產中Cit的代謝調控提供了重要依據,但這些代謝途徑廣泛參與紅曲霉的生長、發(fā)育等重要生命活動,使得平衡生長和次級代謝控制變得復雜。在MPs生產中,直接敲除Cit的BGC似乎是更方便、經濟的方式。

Zhang等[43]探究了谷氨酸對MK合成的影響,結合代謝組學分析發(fā)現(xiàn),差異代謝產物與TCA循環(huán)關系密切。進一步通過外源添加檸檬酸(TCA循環(huán)中間產物)研究了其對MK合成的影響。這為MK生產中培養(yǎng)基優(yōu)化及MK高產菌株的代謝工程改造提供了參考。

Li等[48]探究了普洱茶提取物對MPs合成的影響,并對調控MPs合成機制進行了解析。茶提取物可促進MPs的合成,代謝組學結合轉錄組學分析表明,茶提取物對MPs的合成調控主要通過影響初級代謝途徑而實現(xiàn),并為次級代謝提供充足的能量和更多的生物合成前體。MPs是由紅色MPs、黃色MPs和橙色MPs組成的混合色素,如何提高單一MPs的產率也是業(yè)界關注的重要問題之一。Liu等[49]利用比較代謝組學進行研究發(fā)現(xiàn),黃色MPs生產中(氯化銨和蛋白胨作為氮源)的差異代謝產物與葡萄糖、乳酸及磷酸戊糖途徑密切相關。進一步通過發(fā)酵試驗驗證了這些標記物和代謝途徑的作用,發(fā)現(xiàn)磷酸戊糖途徑作為“開關”在黃色MPs合成中發(fā)揮重要作用。然而,MPs合成調控是復雜多樣的。Huang等[45]在探究不同氮源與MPs合成類型的關系研究中發(fā)現(xiàn),在代謝水平上,紅色MPs合成與胞內氨基酸含量密切相關,而橙色和黃色MPs與核苷酸相關。此外,轉錄組學分析表明,多個初級代謝途徑與紅色MPs的合成密切相關,而橙色MPs與次級代謝途徑有關,黃色MPs與其他代謝途徑的調節(jié)有關。這表明MPs的多樣性在代謝組學和轉錄組學水平上受到聯(lián)合調節(jié),這使得單一MPs生產中的代謝調控變得困難。因此,在單一MPs生產中,得到MPs最大化產率/比例的目標代謝產物是最理想的選擇。

3 總結與展望

微生物組學技術大大推動了對紅曲霉研究的進程,極大地拓展了人們對紅曲霉生長發(fā)育、代謝產物合成及代謝調控的認知。在紅曲霉中,基因組學主要用于探討紅曲霉的進化地位分析、基因簇的預測和挖掘、同源基因的比對分析及代謝途徑分析等研究;利用轉錄組學研究紅曲霉生長和代謝過程中基因或基因簇的轉錄表達分析、環(huán)境適應代謝機制以及新轉錄調控因子的預測和挖掘;蛋白質組學主要涉及代謝過程中重要酶類的功能解析和總體的代謝調控機制的解析;而代謝組學則用于在代謝產物水平上闡述整體的代謝過程。

通過多年研究,已經掌握了紅曲霉三類主要代謝產物MPs、MK和Cit的合成途徑,但紅曲霉次級代謝產物的代謝調控變化多樣,容易受環(huán)境因子的影響,因此,還需要深入研究各種環(huán)境因子(如碳氮源、光照、磁場等)對紅曲霉生長發(fā)育和代謝產物合成的作用機制。MPs是組學研究中最熱門的主題之一,采用高通量測序等菌種選育技巧、培養(yǎng)基組分優(yōu)化、化學和物理調節(jié)及菌株的代謝改造等手段,圍繞高產MPs的調控、特定MPs組分的精細調節(jié)、胞外MPs的分泌調控及降低Cit的調控等方面,不斷發(fā)揮組學技術的作用,為MPs的高效、精準、安全生產做出貢獻。

目前,在紅曲色素的研究中被廣泛采納的觀點是,MPs的合成與碳代謝和氨基酸代謝等代謝途徑密切相關,因為MPs的從頭合成依賴于這些過程中提供的前體(乙酰-CoA和丙酰-CoA)和能量供應。然而,由于不同MPs共享相同的從頭合成過程,豐富的前體和充足的能量并不能將不同MPs進行精準控制。以黃色MPs為例,盡管可以通過篩選黃色MPs突變株或細胞壁表面修飾促進胞外黃色MPs的高效積累[50-51],但橙色MPs和黃色MPs分別由mppG和mppE兩個基因單獨調控合成[52],調節(jié)二者表達的分子開關尚未被證實。此外,胞外MPs的合成一定程度上受制于細胞膜和細胞壁轉運的限制,這些細胞屏障的解除可促進MPs等代謝產物的分泌,提高胞外MPs的產量。但由于細胞壁和細胞膜是細胞最外層的保護性結構,其對環(huán)境的刺激信號相對敏感。MAPK信號通路廣泛存在于真核生物中,作為對外界信號的適應性反應,廣泛參與生物的代謝調控過程[53]。作為對不良環(huán)境的響應,紅曲霉也通過可觸發(fā)MAPK信號的傳導過程調控MPs的合成[23,25]。因此,MPs的合成可認為是紅曲霉對環(huán)境適應的一種自我保護措施。盡管已有研究通過轉錄組學解析出紅曲霉存在MAPK信號調控過程,但其關鍵信號蛋白及受體調節(jié)因子還有待通過分子生物學手段進一步鑒定,其參與次級代謝產物合成的精細調控過程還有待通過組學技術進行解析和完善。

近年來,通過多組學的聯(lián)合使用來揭示紅曲霉代謝調控機制的研究趨勢更加明顯,也使得分析結果更加精準可靠?？梢灶A期,微生物組學技術將在紅曲霉未來研究和代謝產物工業(yè)化生產中繼續(xù)發(fā)揮重要作用,推動紅曲霉相關產業(yè)可持續(xù)發(fā)展。