引火湯對(duì)長(zhǎng)、短期雙側(cè)卵巢摘除術(shù)小鼠抑郁焦慮樣行為的影響

邢淑榮，劉爽，張悅，邱琦，徐紅丹，，3?

（1.佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；3.無(wú)錫衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，江蘇 無(wú)錫 214028）

據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)［1］，全球抑郁癥患者超過(guò)3.5億。截至2017年，中國(guó)超過(guò)5 400萬(wàn)人患有抑郁癥，其中女性發(fā)病率為65%，多發(fā)生于絕經(jīng)期，嚴(yán)重?fù)p害其身心健康［2］。雌激素撤退被認(rèn)為是導(dǎo)致女性抑郁癥發(fā)病的主要內(nèi)因。因此，雌激素替代療法（estrogen replacement therapy， ERT）是臨床主要的治療方案，但因其應(yīng)用有嚴(yán)格的時(shí)間窗限制，只能在圍絕經(jīng)期或絕經(jīng)早期應(yīng)用，并保持一定的雌激素水平才會(huì)對(duì)認(rèn)知功能起到保護(hù)作用。而在女性絕經(jīng)期，雌激素分泌急劇下降，ERT將不能發(fā)揮治療作用［3-4］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎陰虛而心火上炎是更年期抑郁癥的主要發(fā)病機(jī)制，治療更年期抑郁癥的關(guān)鍵在于補(bǔ)腎［5］。引火湯出自陳士鐸《辨證錄》，原方組成為熟地黃、巴戟天、麥冬、茯苓、五味子，具有滋補(bǔ)腎陰、引火歸元的功效［6］。本課題組前期對(duì)引火湯治療更年期抑郁癥的研究發(fā)現(xiàn)，引火湯可顯著改善雙側(cè)卵巢摘除（bilateral ovariectomies， OVX）小鼠術(shù)后1周的體質(zhì)量、睡眠，修飾攻擊樣行為，并有神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用［7-8］。然而，引火湯是否存在與ERT相同的治療窗口期限制，仍是需要研究的科學(xué)問(wèn)題。本研究采用雙側(cè)卵巢摘除（OVX）聯(lián)合慢性不可預(yù)知性溫和應(yīng)激刺激（chronic unpredictable mild stress， CUMS）的方法模擬雌激素剝奪性抑郁癥，觀察引火湯對(duì)長(zhǎng)期和短期OVX小鼠抑郁焦慮樣行為的治療作用，并與雌二醇（E2）做對(duì)比。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

16周齡雌性ICR品系小鼠80只，體質(zhì)量20～25 g，購(gòu)自于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)GLP實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào)：SCXK（黑）2013－0004。將小鼠飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物室，給予適宜溫、濕度（22～24 ℃，50%～60%），自然光源，12 h明暗交替，自由給水進(jìn)食。為使小鼠適應(yīng)環(huán)境，在實(shí)驗(yàn)開始之前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，本研究經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：2018121103。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

引火湯由熟地黃、巴戟天、茯苓、麥冬及北五味子組成（購(gòu)于北京同仁堂哈爾濱連鎖藥店）；補(bǔ)佳樂(lè)（戊酸雌二醇片，批號(hào)：214A劑，拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司）；青霉素鈉粉（批號(hào)：15040312－2，哈藥集團(tuán)制藥總廠）。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為長(zhǎng)期和短期OVX小鼠，再各分為4組，分別為假手術(shù)組（Sham組）、模型組（OVX組）、陽(yáng)性藥組（E2組）和引火湯組（YHT組），每組各10只，短期OVX 4組小鼠在術(shù)后第1周開始給予慢性不可預(yù)知性溫和應(yīng)激刺激（CUMS）并同時(shí)給藥，為期3周。長(zhǎng)期OVX4組小鼠在術(shù)后第8周開始CUMS和給藥，為期3周。

2.2 雙側(cè)卵巢摘除術(shù)

將小鼠用10%水合氯醛（0.4 mL/100 g）腹腔注射麻醉后進(jìn)行OVX手術(shù)。小鼠置俯臥位，在背部大腿根部?jī)?nèi)側(cè)斜上0.5 cm處剪毛、消毒皮膚，剪開皮膚并鈍性撕開肌層，尋找并結(jié)扎子宮，止血后剝離菜花狀卵巢并將其摘除，依次縫合肌層及皮膚切口，涂少許青霉素鈉粉防感染。同法摘取另一側(cè)卵巢。Sham組暴露卵巢后，摘取同體積的脂肪，回納卵巢。

2.3 陰道涂片

OVX術(shù)后，通過(guò)陰道涂片觀察脫落細(xì)胞組成及形態(tài)來(lái)判斷OVX手術(shù)是否成功。具體方法為OVX術(shù)后第5～8天，每日上午9∶00取各組小鼠陰道分泌物涂于載玻片上，晾干后進(jìn)行HE染色。

2.4 慢性不可預(yù)知性溫和應(yīng)激刺激（CUMS）

長(zhǎng)期和短期OVX各組小鼠在實(shí)驗(yàn)計(jì)劃時(shí)間內(nèi)進(jìn)行CUMS刺激。CUMS方法為，每天在下列7種軀體刺激中隨機(jī)選取一種對(duì)小鼠進(jìn)行刺激，包括斷食24 h、斷水24 h、潮濕墊料、傾斜鼠籠、搖晃鼠籠、黑白顛倒和超聲刺激20 min，同種刺激1周內(nèi)不重復(fù)出現(xiàn)，連續(xù)3周。

2.5 給藥劑量及方法

長(zhǎng)期和短期OVX小鼠CUMS刺激同時(shí)給藥，陽(yáng)性藥組（E2組）給予戊酸雌二醇片，給藥量為0.13 mg/kg，濃度為0.013 mg/mL；引火湯組（YHT組）給藥量為23.4 mg/kg，濃度2.34 g/mL。每日灌胃體積為0.1 mL/10 g體質(zhì)量，假手術(shù)組（Sham 組）和 引火湯組（OVX 組）給予等量蒸餾水，連續(xù)給藥3周。

引火湯組方：熟地黃15 g，麥冬10 g，茯苓5 g和五味子5 g。8倍水浸泡生藥2 h，水煎1 h，收集濾液，藥渣加入等量水繼續(xù)煎煮1 h，過(guò)濾后合并兩次煎煮所得濾液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至2.34 g/mL，置4 ℃冰箱備用。

2.6 行為學(xué)檢測(cè)方法

長(zhǎng)期和短期OVX各組小鼠均在給藥3周后進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試。

2.6.1 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)（forced swimming test， FST）

將小鼠被迫放在直徑10 cm容器中，水溫20～25 ℃。水面高度以小鼠后爪不著地且頭部剛好露出水面為準(zhǔn)。每只小鼠測(cè)試完后換水，排除排泄物對(duì)受試小鼠的影響。實(shí)驗(yàn)環(huán)境保持安靜，記錄各組小鼠入水6 min后出現(xiàn)4 min的不動(dòng)時(shí)間。

2.6.2 懸尾實(shí)驗(yàn)（tail suspension test， TST）

將小鼠置于獨(dú)立操作箱內(nèi)，用膠帶將其尾部距末端約1 cm 處固定于箱內(nèi)支架上，頭部朝下距離地面20 cm，使小鼠周圍無(wú)攀爬的地方。每只小鼠測(cè)試完清理糞便，保持環(huán)境安靜。記錄各組小鼠懸尾狀態(tài)6 min 后出現(xiàn) 4 min的不動(dòng)時(shí)間。

2.6.3 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)（elevetated plus maze，EPM）

EPM設(shè)備由兩只相對(duì)開放臂和閉合臂，以及交叉區(qū)的中央平臺(tái)組成，距離地面高50 cm。將小鼠放置中央平臺(tái)，背對(duì)操作者面向開放臂。每只小鼠測(cè)試完畢，95%酒精擦拭 EPM 設(shè)備，保持環(huán)境安靜。記錄各組小鼠5 min內(nèi)開放臂停留時(shí)間百分比（OAT）和開放臂進(jìn)入次數(shù)百分比（OAE）。

2.7 數(shù)據(jù)分析及圖像處理

HE染色圖采用Image－pro－Plus（IPP）6.0軟件進(jìn)行分析。采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。符合正態(tài)分布且總體方差齊的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（ANOVA），組間均數(shù)兩兩比較應(yīng)用最小顯著性差異法（LSD）檢驗(yàn)，應(yīng)用SNK進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后校正；方差不齊的數(shù)據(jù)采用 Tamhane's T2 法進(jìn)行組間比較。P＜ 0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 陰道涂片檢查結(jié)果

正常小鼠陰道細(xì)胞種類及特點(diǎn)隨著性周期的變化呈現(xiàn)出動(dòng)情前期、動(dòng)情期、動(dòng)情后期和動(dòng)情間期的周期性變化。陰道涂片結(jié)果顯示，OVX組小鼠陰道細(xì)胞周期性變化消失，持續(xù)處于動(dòng)情間期，特點(diǎn)為大量的白細(xì)胞伴有少量的上皮細(xì)胞。Sham組小鼠陰道細(xì)胞則出現(xiàn)典型的周期性變化。結(jié)果見圖1，其中圖1A可見上皮細(xì)胞完整；圖1B可見大量角化細(xì)胞且密集成片分布；圖1C可見大量白細(xì)胞伴隨角化細(xì)胞；圖1D可見白細(xì)胞伴少數(shù)有核上皮細(xì)胞。

圖1 小鼠不同時(shí)期陰道涂片（HE染色，×400）

3.2 各組小鼠不同時(shí)期FST、TST水平比較

與Sham組比較，短期OVX組小鼠在FST、TST實(shí)驗(yàn)中的不動(dòng)時(shí)間均顯著增加（P＜ 0.001），說(shuō)明OVX導(dǎo)致的雌激素剝奪狀態(tài)可誘發(fā)明顯的抑郁樣狀態(tài)。與短期OVX組比較，YHT組、E2組小鼠在FST、TST測(cè)試中不動(dòng)時(shí)間均顯著減少（P＜ 0.001）。與Sham組比較，長(zhǎng)期OVX組小鼠在FST、TST實(shí)驗(yàn)中的不動(dòng)時(shí)間均顯著增加（P＜ 0.001）；與OVX組比較，長(zhǎng)期YHT組在FST、TST測(cè)試中的不動(dòng)時(shí)間均顯著減少（P＜ 0.01）；與E2組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 各組小鼠不同時(shí)期FST、TST情況比較（ ± s，%）

表1 各組小鼠不同時(shí)期FST、TST情況比較（ ± s，%）

注：與Sham組比較，***P ＜ 0.001， 與OVX組比較，##P ＜ 0.01， ###P ＜ 0.001。

組別短期長(zhǎng)期TST 74．37 ± 15.26 141.81 ± 18.89***124.64 ± 23.64 67.35 ± 15.43##Sham組OVX組E2組YHT組FST 23.02 ± 7.47 159.42 ± 50.37***69.86 ± 7.65###65.32 ± 7.96###TST 59.67 ± 11.54 131.05 ± 19.00***55.23 ± 7.42###46.75 ± 17.08###FST 70.97 ± 9.81 160.32 ± 40.04***140.62 ± 20.12 74.67 ± 30.89##

3.3 各組小鼠不同時(shí)期OAT、OAE情況比較

高架十字迷宮（EPM）實(shí)驗(yàn)顯示，與Sham組比較，短期OVX組小鼠在EPM實(shí)驗(yàn)的開放臂停留時(shí)間百分比（OAT）、開放臂進(jìn)入次數(shù)百分比（OAE）均顯著減少（P＜ 0.01），說(shuō)明OVX導(dǎo)致的雌激素剝奪狀態(tài)可誘發(fā)明顯的抑郁樣狀態(tài)。與OVX組比較，短期YHT組、E2組小鼠OAT和OAE均顯著增加（P＜ 0.01）。與Sham組比較，長(zhǎng)期OVX組小鼠的開放臂停留時(shí)間百分比、開放臂進(jìn)入次數(shù)百分比均顯著減少（P＜ 0.01）；與OVX組比較，長(zhǎng)期YHT組小鼠OAT和OAE均顯著增加（P＜ 0.01）；與E2組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 引火湯對(duì)長(zhǎng)短期OVX小鼠在EPM實(shí)驗(yàn)中各指標(biāo)的影響（ ± s，%）

表2 引火湯對(duì)長(zhǎng)短期OVX小鼠在EPM實(shí)驗(yàn)中各指標(biāo)的影響（ ± s，%）

注：與Sham組比較，**P ＜ 0.01；與OVX組比較，##P ＜ 0.01。

短期長(zhǎng)期組別OAE 51.32 ± 6.82 31.83 ± 4.16**31.67 ± 7.38 44.74 ± 4.95##Sham組OVX組E2組YHT組OAT 24.74 ± 4.41 12.14 ± 3.03**25.18 ± 6.57##22.23 ± 4.01##OAE 52.00 ± 6.05 35.87 ± 6.05**51.74 ± 7.80##52.87 ± 7.53##OAT 26.04 ± 5.27 12.63 ± 3.56**14.88 ± 2.18 22.45 ± 5.04##

4 討論

目前關(guān)于更年期抑郁癥的神經(jīng)生物學(xué)的發(fā)病機(jī)制尚不明確，但大量研究表明，E2撤退是更年期抑郁癥發(fā)作的重要原因。因此，ERT是臨床治療抑郁癥最常用的方法［9］。但是，長(zhǎng)期補(bǔ)充外源性雌激素會(huì)有患子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌等生殖系統(tǒng)疾病，甚至胰腺炎、非小細(xì)胞肺癌、腦卒中等非生殖系統(tǒng)疾病的風(fēng)險(xiǎn)［10-13］。而且，ERT存在“關(guān)鍵窗口期”的限制，BRINTON［14］提出，在圍絕經(jīng)期使用雌激素，有利于防止和延緩認(rèn)知功能的下降；相反，在絕經(jīng)期，使用雌激素會(huì)加劇神經(jīng)退行性改變。膽堿能神經(jīng)元既表達(dá)雌二醇受體（ER），又表達(dá)多個(gè)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及其受體。雌激素可通過(guò)ER與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子相互調(diào)節(jié)對(duì)神經(jīng)元起營(yíng)養(yǎng)支持作用［4］。據(jù)報(bào)道，海馬膽堿能受損是導(dǎo)致甚至加劇認(rèn)知功能損傷的重要原因［15］。WINK等［16］認(rèn)為，隨著年齡的增長(zhǎng)，海馬的完整性會(huì)受損，圍絕經(jīng)期女性的膽堿能輸入相對(duì)完整，海馬對(duì)膽堿輸入的反應(yīng)也更敏感，而絕經(jīng)期女性海馬中膽堿能的輸入受損，可能是造成上述結(jié)果的原因。

引火湯方中熟地黃填精補(bǔ)髓，滋腎水之涸；巴戟天補(bǔ)腎助陽(yáng)，引火歸元；北五味子能收降浮火，補(bǔ)養(yǎng)腎陰［17］。陳士鐸認(rèn)為，人之神志活動(dòng)寓于心腎相交，即“心氣通于腎，而夜能安；腎氣通于心，而日亦安也”［6］。可見，引火湯治療更年期抑郁癥具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，且在改善認(rèn)知障礙、情志失衡等精神癥狀方面效果居佳。

本研究采用OVX聯(lián)合CUMS方法復(fù)制更年期抑郁癥模型，HE染色顯示OVX小鼠陰道大量白細(xì)胞脫落伴有少量的上皮細(xì)胞，其細(xì)胞周期性變化消失持續(xù)處于動(dòng)情間期，表明OVX手術(shù)造模成功。強(qiáng)迫游泳及懸尾實(shí)驗(yàn)可通過(guò)動(dòng)物的行為絕望水平評(píng)估實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的抑郁樣行為，高架十字迷宮通過(guò)動(dòng)物對(duì)新環(huán)境的探究和對(duì)高懸開放臂的恐懼形成矛盾沖突的狀態(tài)，來(lái)反映動(dòng)物焦慮樣行為。本研究經(jīng)強(qiáng)迫游泳、懸尾、高架十字迷宮等行為學(xué)檢測(cè)得出，E2可改善短期OVX小鼠的抑郁樣行為，對(duì)長(zhǎng)期OVX小鼠的抑郁焦慮樣行為無(wú)改善作用，該結(jié)果與雌激素的使用存在“關(guān)鍵窗口期” 的觀點(diǎn)不謀而合。而引火湯對(duì)長(zhǎng)期和短期OVX小鼠的抑郁樣行為都有改善作用，由此可知，引火湯對(duì)OVX小鼠可持續(xù)發(fā)揮抗焦慮抑郁樣作用，并且不受“關(guān)鍵窗口期”的限制。

綜上所述，引火湯與ERT療法比較，不受“關(guān)鍵窗口期”的限制，可持續(xù)發(fā)揮抗焦慮抑郁樣作用。筆者將對(duì)引火湯改善長(zhǎng)期OVX小鼠的抑郁行為的具體作用機(jī)制進(jìn)行深入研究，為引火湯治療絕經(jīng)期抑郁癥提供有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。