生牛乳中耐藥芽孢桿菌的分離鑒定及四環(huán)素抗性基因tetL定位研究

曹澤鈺，陸方舟，楊婧藝，余宛蕓，閆娟，狄文軒，郝彥玲，翟征遠(yuǎn)

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)營養(yǎng)與健康研究院，北京 100193）

0 引 言

奶牛養(yǎng)殖中的抗生素使用導(dǎo)致的食品安全問題已成為制約企業(yè)發(fā)展，影響人們健康的重大問題之一。奶牛飼養(yǎng)過程中使用的抗生素，可以防治疾病和促進(jìn)生長，也導(dǎo)致了原料乳中耐藥細(xì)菌累積，如部分耐藥芽孢桿菌。在經(jīng)過巴氏殺菌處理后，部分耐藥芽孢桿菌的芽孢仍然存在于乳中，且在適宜條件下萌發(fā)而形成正常繁殖的營養(yǎng)體，使得巴氏殺菌乳及下游產(chǎn)品含有耐藥芽孢桿菌。這些耐藥芽孢桿菌可能不具有致病性，但其包含的耐藥基因可能在乳制品生產(chǎn)加工過程中水平轉(zhuǎn)移到其他微生物中，造成潛在的安全問題[1]。

細(xì)菌可轉(zhuǎn)移質(zhì)?；蛉旧w上的可移動元件，如IS序列、Tn轉(zhuǎn)座子等可導(dǎo)致耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌B.subtilis 168能夠吸收UHT乳環(huán)境中的游離紅霉素抗性質(zhì)粒[2]；巴氏殺菌乳中分離的蠟樣芽孢桿菌BA117的質(zhì)粒帶有四環(huán)素抗性基因tetL，并且能夠接合轉(zhuǎn)移至地衣芽孢桿菌和沙福芽孢桿菌。但對生牛乳中耐熱芽孢桿菌的耐藥基因的定位及耐藥基因可轉(zhuǎn)移性的研究較少，已有研究結(jié)果多集中于抗生素敏感性普查和抗性基因的存在情況。

本研究從34個生牛乳樣品中分離鑒定芽孢桿菌，并利用微量肉湯稀釋法從中篩選抗生素抗性菌株；通過PCR和DNA測序確定耐藥基因；進(jìn)一步通過反向PCR和質(zhì)粒序列測定對耐藥基因進(jìn)行定位。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株、培養(yǎng)基及試劑

1.1.1 材料

34份生牛乳樣品分別采自天津市（11）、河北省廊坊市（4）、江蘇省徐州市（3）、黑龍江省大慶（1）的19個奶牛場，分4個批次采集樣品，時間分別為2021年6月25日、7月8日、9月6日和9月28日。

1.1.2 菌株

質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC29213由中國食品藥品檢定研究院惠贈。攜有tetL基因的蠟樣芽孢桿菌BA117為本實驗室保藏菌株。攜有tetL基因的蠟樣芽孢桿菌CAU 17由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)朱奎教授惠贈。接合轉(zhuǎn)移受體菌副地衣芽孢桿菌BA103為本實驗室保藏菌株。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，去離子水定容至1 L，p H 7.0，用于質(zhì)控菌株的培養(yǎng)；

NB培養(yǎng)基：牛肉浸粉5 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，去離子水定容至1 L，p H 7.1±0.1，用于芽孢桿菌的培養(yǎng)。

1.1.4 試劑

牛肉浸粉、甘露醇卵黃多黏菌素瓊脂培養(yǎng)基（MYP），北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；蛋白胨、酵母粉，OXOID；氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；藥敏檢測板，上海星佰生物技術(shù)有限公司；四環(huán)素、克林霉素，中國食品藥品檢定研究院；紅霉素、甲氧芐啶、磺胺甲惡唑，Sigma；可換膜濾器、0.45μm水系濾膜，購自寶如億（北京）生物技術(shù)有限公司；金牌M IX，北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；TaKaRa PCR Amplification Kit，TAKARA Bio；質(zhì)粒小提試劑盒，Omega bio-tek。

1.2 主要儀器和設(shè)備

生物安全柜，Thermo Fisher Scientific；冷凍離心機(jī),eppendorf；金屬浴，天根生化科技（北京）有限公司；PCR儀和電泳儀，Bio-Rad；凝膠成像系統(tǒng)，UVP；酶標(biāo)儀，Tecan。

1.3 實驗方法

1.3.1 芽孢桿菌的分離與鑒定

依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)[3]并作適當(dāng)調(diào)整，為了提高芽孢桿菌的分離率，對生牛乳樣品進(jìn)行80℃熱處理20 min后，進(jìn)行分菌。進(jìn)一步利用試劑盒提取芽孢桿菌基因組DNA，以基因組為模板，擴(kuò)增16S rDNA片段，16S rDNA PCR引物由上海生工生物科技有限公司合成。正向引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物1492R：5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，52℃退火30 s，72℃延伸40 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測序，測序結(jié)果上傳NCBI數(shù)據(jù)庫（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行比對分析，確定菌株的種屬。

1.3.2 芽孢桿菌的耐藥性評價

依據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（The Clinical&Laboratory Standards Institute,CLSI）[4]建議的微量肉湯稀釋法，對66株產(chǎn)芽孢細(xì)菌分離株進(jìn)行藥敏試驗，該方法注明質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC29213。共篩查分離株對11大類共12種抗生素的敏感性，分別為氨芐西林，青霉素，美羅培南，紅霉素，克林霉素，環(huán)丙沙星，利福平，復(fù)方新諾明，萬古霉素，四環(huán)素，氯霉素，慶大霉素。根據(jù)2016版CLSI不常見或苛養(yǎng)菌藥敏方法M 45中芽孢桿菌耐藥性判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行耐藥性評價。

1.3.3 攜帶獲得性耐藥基因的芽孢桿菌的質(zhì)粒普查

為了確定獲得性耐藥基因是否存在質(zhì)粒上，使用E.Z.N.A Plasmid Mini Kit試劑盒提取質(zhì)粒，通過瓊脂糖凝膠電泳普查獲得性耐藥芽孢桿菌質(zhì)粒存在情況。

1.3.4 四環(huán)素耐藥基因的特異性PCR檢測

根據(jù)芽孢桿菌四環(huán)素耐藥基因tetA、tetB、tetO、tetW、tetK、tetM和tet L的序列及參考文獻(xiàn)，設(shè)計引物如表1所示，以四環(huán)素耐藥的芽孢桿菌的基因組和質(zhì)粒DNA為模板，PCR擴(kuò)增四環(huán)素耐藥基因，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。

表1 四環(huán)素抗性基因擴(kuò)增引物

1.3.5 反向PCR

依據(jù)冷泉港實驗室（The Cold Spring Harbor Laboratory,CHL）[9]的方法，依據(jù)PCR擴(kuò)增到的tet L抗性基因序列設(shè)計引物Inverse-F-5’GCTGGTGCTGGAATGAGTTTG 3'，Inverse-R-5'TTGGTT GTGTCGTAAATTCG 3'，反向PCR確定四環(huán)素抗性基因上下游序列。

2 結(jié)果與討論

2.1 生牛乳中芽孢桿菌的分離與鑒定

從34個生牛乳樣品中分離并鑒定出66株產(chǎn)芽孢細(xì)菌，其中蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）38株（58%）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）3株（5%）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）3株（5%）、沙福芽孢桿菌（Bacillus safensis）2株（3%）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）3株（5%）、高地芽孢桿菌（Bacillus altitudinis）1株（2%）、摩加夫芽孢桿菌（Bacillus mojavensis）1株（2%）、越南芽孢桿菌（Bacillus wiedmannii）2株（3%）、魏登施泰芽孢桿菌（Bacillus weihenstephanensis）1株（2%）、漳州芽孢桿菌（Bacillus zhangzhouensis）2株（3%）、副黏菌芽孢桿菌（Bacillus paramycoides）4株（6%）、其他芽孢桿菌6株（9%）。

圖1 生牛乳中芽孢桿菌分離情況

2.2 芽孢桿菌抗生素抗性篩查

對66個分離株進(jìn)行藥敏試驗，共篩選出57株抗生素抗性菌株，分別為氨芐西林抗性（47株），青霉素抗性（50株），紅霉素抗性（1株），克林霉素抗性（7株），四環(huán)素抗性（5株）。分離株均未表現(xiàn)出對美羅培南、環(huán)丙沙星、利福平、萬古霉素、氯霉素、慶大霉素、復(fù)方新諾敏的抗性。菌種與抗生素抗性對應(yīng)關(guān)系如表2。分離株中芽孢桿菌普遍對氨芐西林、青霉素具有抗性，表明氨芐西林、青霉素屬于固有抗性。而四環(huán)素、紅霉素和克林霉素抗性表型在分離株中并不具有普遍性，因此可能是菌株的獲得性抗性。

表2 芽孢桿菌分離株耐藥表型（n=66）

（續(xù)表2）

2.3 獲得性耐藥菌的質(zhì)粒普查

為進(jìn)一步定位獲得性耐藥菌株的耐藥基因并探究其可移動性，使用質(zhì)粒小提試劑盒，對13株具有獲得性耐藥表型的芽孢桿菌進(jìn)行質(zhì)粒提取。瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果表明僅有四環(huán)素抗性的蠟樣芽孢桿菌S7和S11攜帶有質(zhì)粒。如圖2所示，通過同超螺旋DNA marker的比較，蠟樣芽孢桿菌S7存在一個約5 kb的質(zhì)粒，蠟樣芽孢桿菌S11存在約2 kb的質(zhì)粒。

圖2 蠟樣芽孢桿菌S7、S11質(zhì)粒電泳圖

2.4 四環(huán)素抗性基因的PCR擴(kuò)增及定位

分別以S7、S11的質(zhì)粒、基因組為DNA模板，擴(kuò)增芽孢桿菌四環(huán)素耐藥基因，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖如圖3。未見S7、S11質(zhì)粒與基因組擴(kuò)增出tetO清晰條帶，tetA、tet B、tet W、tet K、tetM擴(kuò)增產(chǎn)物均與參考文獻(xiàn)中不符，測序分析表明均為非特異性擴(kuò)增片段。使用tet L上下游引物，兩株菌的質(zhì)粒與基因組都擴(kuò)增出略大于750 bp的條帶，片段大小與文獻(xiàn)相符。序列的比對分析發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物同tetL基因相似度達(dá)到100%，表明蠟樣芽孢桿菌S7、S11中有tetL基因。以S7的質(zhì)粒DNA為模板能夠擴(kuò)增獲得tetL基因片段，說明tetL基因可能位于S7的質(zhì)粒上。

圖3 四環(huán)素抗性基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

為了定位tetL基因，以經(jīng)純化的S7質(zhì)粒為模板，反向擴(kuò)增tetL兩側(cè)基因，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜如圖4所示，CK為雙蒸水代替模板的陰性對照。S7存在一條明顯的約4 kb的條帶。將S7擴(kuò)增產(chǎn)物交由公司測序，產(chǎn)物序列與tetL序列拼接成環(huán)，獲得質(zhì)粒p BCs7的全序列，質(zhì)粒大小為4 634 bp。對質(zhì)粒全序列進(jìn)行注釋后，用Snap Gene繪制該質(zhì)粒的物理圖譜，如圖5所示。該質(zhì)粒包含四環(huán)素抗性基因tetL、兩個移動蛋白基因mob_1和mob_2、質(zhì)粒復(fù)制蛋白基因repU。質(zhì)粒p BCs7能夠編碼的移動蛋白M ob，而M ob蛋白一般能夠介導(dǎo)質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移。對質(zhì)粒p BCs7的核酸序列進(jìn)行Blast比對分析，發(fā)現(xiàn)其同Heyndrickxia oleronia FW 1的質(zhì)粒p AMalpha1（GenBank:CP079722.1）相似度為99.76%；同屎腸球菌E7654的質(zhì)粒4（GenBank:LR 135327.1）相似度為99.75%；同金黃色葡萄球菌X 22的質(zhì)粒（GenBank:CP042651.1）相似度為99.74%。因此，推測質(zhì)粒p BCs7可能具有轉(zhuǎn)移性，蠟樣芽孢桿菌S7可能成為四環(huán)素耐藥基因的供體菌。盡管我國乳制品生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)中尚未要求對芽孢桿菌進(jìn)行檢測，攜帶有可移動的耐藥基因的芽孢桿菌已經(jīng)成為影響乳制品安全的潛在風(fēng)險之一。研究表明，減少飼養(yǎng)環(huán)節(jié)的抗生素使用，改善養(yǎng)殖環(huán)境或擠奶過程的衛(wèi)生條件，可以有效降低原料乳中耐藥菌的數(shù)量[10]。在乳制品生產(chǎn)過程中，利用離心除芽孢機(jī)可以大幅降低原料乳中芽孢數(shù)量[11]，可以降低芽孢桿菌的耐藥基因的傳播。

圖4 反向PCR電泳圖

圖5 pBCs7質(zhì)粒物理圖譜

3 結(jié) 論

本研究從34個生牛乳樣品中分離鑒定出66株產(chǎn)芽孢細(xì)菌，包括蠟樣芽孢桿菌38株、地衣芽孢桿菌3株、短小芽孢桿菌3株、沙福芽孢桿菌2株、枯草芽孢桿菌3株、高地芽孢桿菌1株、摩加夫芽孢桿菌1株、越南芽孢桿菌2株、魏登施泰芽孢桿菌1株、漳州芽孢桿菌2株、副黏菌芽孢桿菌4株、其他芽孢桿菌6株。藥敏結(jié)果顯示，在固有抗生素耐藥性中氨芐西林耐藥率高達(dá)71.21%，青霉素耐藥率高達(dá)75.75%。在獲得性耐藥中7株芽孢桿菌具有克林霉素抗性，1株沙福芽孢桿菌具有紅霉素抗性，5株蠟樣芽孢桿菌具有四環(huán)素抗性。獲得性耐藥的菌株中，四環(huán)素抗性的蠟樣芽孢桿菌S7和S11攜帶有質(zhì)粒。進(jìn)一步通過芽孢桿菌四環(huán)素耐藥基因的PCR篩查及測序分析，確定S7和S11中四環(huán)素抗性基因為tetL。其中蠟樣芽孢桿菌S7的tetL基因位于質(zhì)粒上。通過反向PCR及DNA測序，獲得該質(zhì)粒p BCs7的全序列。該質(zhì)粒大小為4634 bp，包含四環(huán)素抗性基因tetL、兩個移動蛋白基因mob_1和mob_2、質(zhì)粒復(fù)制蛋白基因repU。移動蛋白M ob能夠介導(dǎo)質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移，所以推測p BCs7上的四環(huán)素抗性基因tetL可能具有轉(zhuǎn)移性。本研究結(jié)果說明，生牛乳中耐藥芽孢桿菌具有四環(huán)素、克林霉素和紅霉素等獲得性抗生素抗性，其中四環(huán)素抗性基因tetL位于可移動元件上，可能通過接合轉(zhuǎn)移方式在菌株之間傳播，具有一定的食品安全風(fēng)險。