堿液預(yù)處理對檸條錦雞兒莖理化結(jié)構(gòu)及酶解的影響

劉 寅，錢倩倩，2，苗彩云，李冠華，2，王玉芬

（1.內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 牧草與特色作物生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010070；2.內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 省部共建草原家畜生殖調(diào)控與繁育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特010070）

0 引言

檸條錦雞兒（Caragana korshinskii）是豆科錦雞兒屬灌木，廣泛分布在中國西北干旱和半干旱地區(qū)，是荒漠草原防風(fēng)固沙和改善環(huán)境的重要生態(tài)植物。隨著樹齡增長，檸條錦雞兒的導(dǎo)水能力下降，葉片光合效率降低，長勢變得衰弱。平茬能夠促進(jìn)枝條萌蘗及新根生發(fā)，增強(qiáng)檸條錦雞兒對水分和營養(yǎng)的吸收，提高光合效率，是保證檸條錦雞兒復(fù)壯、長勢繁茂的重要手段[1]。我國的檸條錦雞兒資源十分豐富，檸條錦雞兒平茬產(chǎn)物的年產(chǎn)量預(yù)計(jì)超過400萬t，平茬產(chǎn)物資源化利用，能夠增加檸條錦雞兒的林區(qū)經(jīng)濟(jì)效益，有助于實(shí)現(xiàn)檸條錦雞兒防風(fēng)固沙產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[2]。

目前，檸條錦雞兒平茬產(chǎn)物多被用于制備顆粒飼料，但檸條錦雞兒的木質(zhì)化程度較高，口感較差，這限制了其推廣使用。檸條錦雞兒也可用于直燃發(fā)電、制備板材等，但是，總體而言，相應(yīng)的產(chǎn)業(yè)發(fā)展并不成熟[3]。纖維素是自然界最豐富的有機(jī)物，也是檸條錦雞兒的主要成分之一，通過酶促水解反應(yīng)生成單糖，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其它生物質(zhì)及化學(xué)產(chǎn)品是實(shí)現(xiàn)纖維素高效利用的重要途徑。多樣的化學(xué)組分、致密的物理結(jié)構(gòu)、復(fù)雜的纖維形態(tài)，以及這些因素間的相互作用會阻礙纖維素的酶促水解反應(yīng)，學(xué)者們將這種頑抗性稱為抗降解屏障。預(yù)處理是破壞抗降解屏障，提高纖維素酶解糖化效率的有效手段。其中，堿液預(yù)處理具有操作簡便、介質(zhì)污染小、設(shè)備要求低和投資成本少等優(yōu)點(diǎn)，已被成功應(yīng)用于木材、小麥秸稈和甜菜渣等生物 質(zhì)[4]～[6]。

目前，有關(guān)堿液預(yù)處理檸條錦雞兒等灌木生物質(zhì)的研究報(bào)道較少。因此，本文以我國西北地區(qū)重要的生態(tài)灌木檸條錦雞兒為研究對象，首先以粗蛋白含量和酶解還原糖得率為指標(biāo)，比較了檸條錦雞兒葉和不同徑級莖的可消化性；然后以NH3·H2O，Ca（OH）2和NaOH3種 堿 溶 液 為 反 應(yīng) 介質(zhì)，預(yù)處理檸條錦雞兒莖，考察堿預(yù)處理對檸條錦雞兒莖的化學(xué)組分、化學(xué)基團(tuán)、結(jié)晶度、孔隙率、孔徑分布和酶解還原糖得率的影響，以期闡明堿液預(yù)處理對檸條錦雞兒等灌木生物質(zhì)抗降解屏障的破壞機(jī)制，并為檸條錦雞兒纖維素的高值轉(zhuǎn)化提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

檸條錦雞兒取自內(nèi)蒙古自治區(qū)和林格爾縣，樣品于60℃烘干后，將葉與莖分離，并根據(jù)直徑大小將莖進(jìn)一步分為細(xì)莖（直徑＜0.5cm）、中莖（直 徑 為0.5～1.0cm）和 粗 莖（直 徑＞1.0cm）。將 檸條錦雞兒葉和不同徑級莖分別粉碎后過40目篩，裝密封袋備用。纖維素酶（Trichoderma vride G）購于上海源葉生物科技有限公司，酶活為100U/g，溴化鉀（光譜純）購于Sigma-Aldrich公司，其他試劑（國產(chǎn)分析純）購于內(nèi)蒙古昭程商貿(mào)有限公司。

1.2 預(yù)處理

去除檸條錦雞兒的葉和細(xì)莖，剩余部分粉碎后過40目篩，放入100mL的藍(lán)蓋瓶中進(jìn)行預(yù)處理。依據(jù)相關(guān)的堿液預(yù)處理?xiàng)l件和前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[7]，分 別 以 質(zhì) 量 分 數(shù) 為10%的NH3·H2O，0.1%的Ca（OH）2（溶 解 度 僅 為1.65g/L）和1%的NaOH溶液為反應(yīng)介質(zhì)，固液比為1∶10，溫度為80℃，預(yù)處理時(shí)間為6h，反應(yīng)結(jié)束后用蒸餾水沖洗樣品至中性，然后60℃烘干至恒重，未經(jīng)預(yù)處理的樣品設(shè)為對照組。預(yù)處理過程的質(zhì)量損失率WL的計(jì)算式為

式 中：mA，mB分 別 為 預(yù) 處 理 前、后 樣 品 的 質(zhì) 量，g。

1.3 酶解還原糖得率的測定

向100mL的錐形瓶中依次加入1.5g樣品和30mL檸檬酸緩沖溶液（濃度為0.05mol/L，pH值為4.8），纖維素酶用量為20FPU/g，溫度為50℃，震蕩水浴48h。酶解反應(yīng)結(jié)束后，離心，收集上清液，采用3，5-二硝基水楊酸法測定還原糖濃度。酶解還原糖得率RSY的計(jì)算式為

式中：ρ為酶促水解反應(yīng)生成的還原糖濃度，mg/mL；V為 酶 解 液 體 積，mL；m為 樣 品 質(zhì) 量，g。

1.4 化學(xué)組分的測定

采用Van Soest法（稍作改進(jìn)）測定樣品的化學(xué)組分。樣品的初始質(zhì)量為m0，樣品依次經(jīng)過中性洗滌劑、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%的鹽酸和72%的硫酸處理，每一步處理后，過濾殘?jiān)来斡盟捅礈欤缓蠛娓煞Q重，殘?jiān)|(zhì)量依次記為m1，m2和m3。中性洗滌物含量（NDS）、半纖維素含量（HCel）、纖 維 素 含 量（Cel）和 木 質(zhì) 素 含 量（Lig）的 計(jì) 算式分別為

1.5 粗蛋白含量的測定

采用凱氏定氮法測定樣品的粗蛋白含量。樣品首先于KDN-08A型石墨消化爐中消煮1h，然后采用SKD-3000型全自動凱氏定氮儀測定樣品的含氮量。粗蛋白含量CP的計(jì)算式為

式中：N為氮含量，mg/g；6.25為氮含量換算為粗蛋白質(zhì)含量的平均系數(shù)。

1.6 傅里葉紅外光譜的測定

采用IR-Affinity-1S型傅里葉紅外光譜儀測定樣品的紅外吸收光譜。樣品粉碎后過200目篩，稱取1mg樣品與99mg KBr，混合后充分研磨，在150MPa下壓制10min，形成KBr錠片。掃描波長為400～4000cm-1，掃描次數(shù)為40次，分辨率為8 cm-1。

1.7 結(jié)晶度的測定

采用X'Pert PRO型X射線衍射儀測定樣品的結(jié)晶度。測試條件：電壓為40kV，電流為40 mA，步 長 為0.02°，掃 描 角 度2θ為5～40°。結(jié) 晶 度指數(shù)CrI的計(jì)算式為

式中：Icr為 纖維素中2θ為22～23°處的 結(jié)晶區(qū)強(qiáng)度峰值；Iamor為纖維素中2θ為18～19°處的非晶區(qū)強(qiáng)度最小值。

1.8 孔徑分布和孔隙率的測定

采用AutoPoreⅣ9500型壓汞儀測定樣品的孔徑分布和孔隙率，測試溫度為26℃，壓力為0.00345～227.53MPa。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸條錦雞兒可消化性分析

檸條錦雞兒是一類具有重要生態(tài)價(jià)值的飼用灌木，可消化性是表征植物飼用品質(zhì)的重要指標(biāo)，本研究從粗蛋白含量和酶解還原糖得率2個(gè)方面，比較了檸條錦雞兒莖和葉的可消化性。檸條錦雞兒不同部位的可消化性如圖1所示。從圖1可以看出，檸條錦雞兒葉的可消化性高于莖，葉的粗蛋白含量和酶解還原糖得率分別為222.68mg/g和178.61mg/g。植物的不同器官發(fā)揮著不同的生物學(xué)功能，其組織結(jié)構(gòu)上存在巨大差異，莖主要由起支撐和傳輸作用的維管組織構(gòu)成，而葉主要由薄壁組織構(gòu)成。Costa T H F的研究表明，植物的頑抗性因細(xì)胞類型而異，維管組織擁有比薄壁組織更強(qiáng)的抗降解性[8]。此外，葉是植物的光合器官，葉中與光合作用相關(guān)的蛋白質(zhì)較為豐富。因此，檸條錦雞兒葉的可消化性高于莖。

圖1 檸條錦雞兒不同部位的可消化性Fig.1 Digestibility of different parts of Caragana korshinskii

從圖1還可以看出：檸條錦雞兒不同徑級的莖可消化性不同，其中細(xì)莖的可消化性最好，其酶解還原糖得率和粗蛋白含量分別為127.55mg/g和129.12mg/g；中莖和粗莖的可消化性較差，且無顯著性差異。在植物生長過程中，隨著木質(zhì)素的積累，組織木質(zhì)化程度增加，導(dǎo)致可消化性降低。因此，檸條錦雞兒的飼用品質(zhì)與莖的直徑呈負(fù)相關(guān)[9]。檸條錦雞兒葉和細(xì)莖的可消化性較好，能夠直接用作飼料；而中莖和粗莖的可消化性較差，不宜直接作為飼料，但這一部分是檸條錦雞兒生物量的主體。在實(shí)現(xiàn)葉、莖分級的基礎(chǔ)上，提高中莖和粗莖的轉(zhuǎn)化效率，是對檸條錦雞兒資源化利用的關(guān)鍵。

2.2 堿液預(yù)處理對檸條錦雞兒莖化學(xué)結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 檸條錦雞兒莖顏色和化學(xué)組成的變化

堿液預(yù)處理前后，檸條錦雞兒莖顏色和化學(xué)組分的變化情況如圖2所示。從圖2（a）可以看出，堿液預(yù)處理后，樣品的顏色由淡黃色變?yōu)楹稚?，這是由非結(jié)構(gòu)組分的降解以及木質(zhì)素的溶出與活化引起的[10]。其中，NH3·H2O和NaOH預(yù)處理引起的顏色變化更為明顯；Ca（OH）2預(yù)處理引起的顏色變化較小，這是由于其堿性較弱。

圖2 堿液預(yù)處理前后，檸條錦雞兒莖顏色和化學(xué)組分的變化情況Fig.2 Changes of color and chemical component of stem from Caragana korshinskii before and after alkali pretreatment

從 圖2（b）可 以 看 出：樣 品 經(jīng)NH3·H2O，Ca（OH）2和NaOH預(yù)處理后，質(zhì)量損失率分別為16.95%，8.04%和22.25%；堿液預(yù)處理后，樣品中的中性洗滌物含量顯著降低。這是因?yàn)橹行韵礈煳镏饕羌?xì)胞內(nèi)的可溶性物質(zhì)，主要成分為蛋白質(zhì)、脂類、灰分、單寧等，堿液處理可以破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，溶出其中的可溶性物質(zhì)。半纖維素是具有支鏈的無定形多糖，經(jīng)過NH3·H2O和NaOH預(yù)處理后，其含量顯著減少，表明堿液預(yù)處理能去除半纖維素；半纖維素的去除使得半纖維素與木質(zhì)素間的交聯(lián)作用減弱。堿液預(yù)處理后，木質(zhì)素含量的變化不顯著，木質(zhì)素的去除效率受到反應(yīng)條件和樣品種類的影響，通常而言，堿液預(yù)處理對木質(zhì)素含量高的植物的作用效果較差[11]。經(jīng)Ca（OH）2預(yù)處理后，樣品中的半纖維素和木質(zhì)素含量率略有增加，這是由于該堿液的堿性較弱，對半纖維素和木質(zhì)素的去除能力較差，隨著中性洗滌物的減少，半纖維素和木質(zhì)素的含量相對增加。纖維素是一種高聚合度和高分子量的多糖化合物，分子間氫鍵使纖維素絲束排列緊密有序，在堿性條件下也具較高的穩(wěn)定性[12]。隨著其他化學(xué)組分的去除，纖維素的相對含量增加，更多的纖維素有助于產(chǎn)生更多的葡萄糖。

2.2.2 檸條錦雞兒莖化學(xué)基團(tuán)的變化

紅外光譜是分析樣品化學(xué)基團(tuán)變化的常用手段。堿液預(yù)處理前后，檸條錦雞兒莖的紅外光譜如圖3所示。從圖3可以看出：1735cm-1附近的吸收峰減弱或消失，表明半纖維素側(cè)鏈乙酰基被破壞，木質(zhì)素和半纖維素間的酯鍵被斷裂；1235cm-1和831cm-1附近的吸收峰減弱，表明木質(zhì)素間的醚鍵被破壞，紫丁香基被去除；1161cm-1和900 cm-1附近的吸收峰增強(qiáng)，表明不對稱C-O-C橋和β-葡萄糖苷含量增加，纖維素含量提高，這和化學(xué)組分的變化結(jié)果相一致。紅外光譜表明，堿液預(yù)處理對木質(zhì)素有一定去除效果但不顯著，然而堿液預(yù)處理能有效地去乙酰化，破壞木質(zhì)素與半纖維素間的酯鍵以及木質(zhì)素間的醚鍵，進(jìn)而破壞木質(zhì)素與半纖維素形成的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，這種交聯(lián)結(jié)構(gòu)的破壞有助于提高檸條錦雞兒莖的酶解還原糖得率[13]。

圖3 堿液預(yù)處理前后，檸條錦雞兒莖的紅外光譜圖Fig.3 FTIR of stem from Caragana korshinskii before and after alkali pretreatment

2.3 堿液預(yù)處理對檸條錦雞兒莖物理結(jié)構(gòu)的影響

堿液預(yù)處理前后，檸條錦雞兒莖的結(jié)晶度指數(shù)和孔隙率的變化見表1。由表1可知：對照組樣品 的 結(jié) 晶 度 指 數(shù) 為25.64%，經(jīng) 過NH3·H2O，Ca（OH）2和NaOH預(yù)處理后，樣品的結(jié)晶度指數(shù)均提高，分別達(dá)到39.73%，31.87%和45.64%；對照組樣品的孔 隙 率 為72.32%，經(jīng)NH3·H2O，Ca（OH）2和NaOH預(yù)處理后，樣品的孔隙率分別提高至77.71%，78.78%和78.70%。堿液預(yù)處理可以破壞纖維素的結(jié)晶區(qū)，降低纖維素結(jié)晶度；但就木質(zhì)纖維素而言，非結(jié)晶區(qū)不僅包括纖維素的無定形區(qū)，還包括中性洗滌物和半纖維素等無定形成分，結(jié)晶度的提高可能是由于中性洗滌物和半纖維素等非結(jié)晶組分的降解造成的，結(jié)晶度升高預(yù)示著結(jié)晶纖維素 的 暴 露[14]。

表1 堿液預(yù)處理前后，檸條錦雞兒莖的結(jié)晶度指數(shù)和孔隙率Table1 CrI and porosity of stem from Caragana korshinskii before and after alkali pretreatment

堿液預(yù)處理前后，檸條錦雞兒莖的孔徑分布如圖4所示。從圖4可以看出，對照組樣品的最可幾 孔 徑 為8055.51nm，經(jīng) 過NH3·H2O，Ca（OH）2和NaOH預(yù)處理后，樣品的最可幾孔徑分別增大至13964.78，11326.39nm和21368.87nm。這表明堿液預(yù)處理能夠破壞樣品的致密結(jié)構(gòu)，在樣品預(yù)處理過程中，隨著半纖維素和部分木質(zhì)素等組分的降解，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)被破壞，使樣品的孔隙和孔徑增多增大，這將有利于纖維素酶進(jìn)入檸條錦雞兒莖的孔隙內(nèi)部。

圖4 堿液預(yù)處理前后，檸條錦雞兒莖的孔徑分布Fig.4 Pore size distribution of stem from Caragana korshinskii before and after alkali pretreatment

2.4 堿液預(yù)處理對檸條錦雞兒莖酶解還原糖得率的影響

堿液預(yù)處理前后，檸條錦雞兒莖的酶解還原糖得率如圖5所示。從圖5可以看出，對照組樣品的酶解還原糖得率僅為91.51mg/g，經(jīng)NH3·H2O，Ca（OH）2和NaOH預(yù)處理后，檸條錦雞兒莖的酶解還原糖得率均顯著提高，分別達(dá)到152.57，108.08，176.72mg/g，分 別 提 升 了66.68%，17.91%，93.12%。木質(zhì)纖維素生物質(zhì)具有多樣的化學(xué)成分和多層次的分子結(jié)構(gòu)，木質(zhì)素和半纖維素通過化學(xué)鍵交聯(lián)形成的復(fù)雜致密網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，纖維素分子鏈之間由氫鍵有序連接形成致密的結(jié)晶區(qū)等，阻礙了酶與底物的接觸和作用，進(jìn)而影響纖維素酶解效率。有研究認(rèn)為，相比于木質(zhì)素的含量，木質(zhì)素與多糖間的交聯(lián)才是影響纖維素酶解效率的關(guān) 鍵 因 素[15]。

圖5 堿液預(yù)處理前后，檸條錦雞兒莖的酶解還原糖得率Fig.5 RSY of stem from Caragana korshinskii before and after alkali pretreatment

本研究利用較溫和的堿液預(yù)處理檸條錦雞兒莖，降解了半纖維素，有效斷裂了木質(zhì)素與半纖維素之間的化學(xué)鍵，進(jìn)而破壞了木質(zhì)素與半纖維素間的網(wǎng)狀交聯(lián)，暴露出纖維素結(jié)晶區(qū)，增強(qiáng)了纖維素可及性，最終表現(xiàn)為更高的酶解還原糖得率。此前研究中，堿液預(yù)處理通常需要較嚴(yán)苛的條件，如高濃度堿液、高溫（＞100℃）或高壓，以實(shí)現(xiàn)木質(zhì)素的溶出，從而提高生物質(zhì)酶解效率[11]。本文研究結(jié)果表明，使用堿液在相對溫和的條件下預(yù)處理檸條錦雞兒莖，通過破壞關(guān)鍵化學(xué)交聯(lián)鍵，改變木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)，同樣能夠達(dá)到較好的預(yù)處理效果，這為檸條錦雞兒等灌木生物質(zhì)預(yù)處理工藝的建立提供了新的思路。

3 結(jié)論

①檸條錦雞兒是一種具有較高開發(fā)利用價(jià)值的荒漠生態(tài)植物，根據(jù)不同部位的理化結(jié)構(gòu)差異對其進(jìn)行分級利用，是實(shí)現(xiàn)其高值化利用的有效手段。

②堿液預(yù)處理可以去除檸條錦雞兒莖中的半纖維素乙?；⒔到獍肜w維，斷裂半纖維素與木質(zhì)素間的酯鍵和木質(zhì)素間的醚鍵，提高纖維素含量，還可以破壞檸條錦雞兒莖的致密結(jié)構(gòu)，暴露纖維素結(jié)晶區(qū)，進(jìn)而顯著提高其酶解還原糖得率。

③溫和的堿液預(yù)處理是檸條錦雞兒等灌木生物質(zhì)的理想預(yù)處理手段。