安石榴苷通過優(yōu)化腸道菌群結構改善小鼠抑郁行為的實驗研究①

許 萍 龐振振 黃淑蕓 洪宗元 鐘樹志 （皖南醫(yī)學院， 蕪湖 241002）

石榴，亦名安石榴?！侗静菥V目·果部·安石榴》酸榴皮主治：“赤白痢下、久痢久瀉、疔腫惡毒、肚子生瘡”。藥用其皮，故名石榴皮。研究表明石榴皮提取物安石榴苷（punicalagin，PUN）在石榴酚類化合物中具有最強的抑菌活性［1-2］。PUN對腸道致病菌具有選擇性毒性，人類食用富含PUN的石榴制品可改善由應激和其他因素引起的腸道細菌失衡，從而促進腸道穩(wěn)態(tài)和整體健康［3-4］。

抑郁癥因患病率高、治愈率低，即將成為全球第二大殺手。有研究表明，抑郁癥患者的腸道菌群相較健康對照者有較大變化，包括α多樣性顯著增加、雙歧桿菌和乳桿菌明顯減少［5］。PUN能否通過抑制腸道某些致病菌群，增加益生菌群，從而改善抑郁癥狀，尚未見報道。本實驗研究將PUN應用于慢性不可預知溫和應激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）模型小鼠，探討PUN對CUMS小鼠抑郁行為及腸道菌群的影響，從改善機體炎癥的角度，探討其影響CUMS小鼠大腦功能的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 C57BL/6小鼠60只，雌雄各半，體質量（22±3） g，由長沙天勤生物技術有限公司提供，動物許可證號：SCXK（湘）2019-0014。常規(guī)飼養(yǎng)于實驗動物中心，室溫（23±20） ℃，相對濕度40%～70%，晝夜交替照明，自由飲水與攝食，實驗前1周適應性喂養(yǎng)。PUN凍干粉（P0349，純優(yōu)生物有限公司）；DNA合成試劑盒（10071325，美國Thermo Fisher）；Antioccludin兔抗小鼠一抗（ab216327），Anti-ZO1兔抗小鼠一抗（ab216880，英國Abcam）；引物由上海生工生物工程技術有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 小鼠抑郁模型的建立 參照文獻［6］的造模方法，實驗遵循隨機、不可預見性的原則，按照所有小鼠均單籠孤養(yǎng)，連續(xù)28 d，每天不定時隨機給 3種低強度刺激包括：夾尾、禁食、禁水、熱烘、振蕩、傾斜、潮濕、晝夜顛倒、冰水游泳。在小鼠造模0 d和28 d，分別進行行為學實驗的檢測，其檢測結果作為造模成功與否的依據(jù)。

1.2.2 分組和給藥 造模結束后，通過行為學檢測，將造模成功的48只抑郁模型小鼠隨機分為模型組（Model）、安石榴苷治療高、中、低劑量組（PUN-H、PUN-M、PUN-L）、治療組分別給予安石榴苷50、25和12.5 mg/kg灌胃，另取12只小鼠作為對照組，對照組與模型組給予等量溶劑灌胃，1次/d，連續(xù)45 d。

1.2.3 小鼠行為學檢測

1.2.3.1 強迫游泳實驗 強迫游泳實驗前，分別將小鼠置于強迫自制的游泳缸內強迫游泳6 min，記錄小鼠后4 min在水面漂浮的累計不動時間。

1.2.3.2 糖水消耗實驗 小鼠禁食、水12 h后，把蒸餾水瓶和蔗糖水瓶稱重同時放到鼠籠上，給予小鼠自由選擇飲水12 h，然后再次稱重2個水瓶，計算1 h內小鼠蒸餾水和蔗糖水的攝入量。糖水嗜好 度（%）=糖水攝入量/（糖水攝入量+蒸餾水攝入量）×100%。

1.2.3.3 懸尾不動實驗 用膠布在小鼠尾部1 cm處粘貼使小鼠懸掛，阻擋相鄰小鼠視線。觀察小鼠懸掛時間為6 min，記錄后4 min內懸尾累計不動時間。

1.2.4 標本采集 小鼠行為學實驗結束后，摘眼球取血，頸椎脫臼處死。手術剪打開腹腔，眼科剪剪開腸管，取腸道內容物置無菌EP管凍存待測腸道菌群，另取距胃10 cm小腸6 cm。其中前1/3段提取RNA，檢測炎癥因子相關mRNA的表達，中1/3段制作勻漿，檢測炎癥因子，后1/3段置4%甲醛充分固定。

1.2.5 免疫組織化學檢測腸壁屏障蛋白ZO-1和Occludin的表達 取固定好的小腸管，石蠟包埋，切5 μm厚切片，加H2O2置常溫10 min，漂洗后加入5%BSA常溫孵育60 min，不洗，滴加兔抗小鼠一抗ZO-1（1∶150）、Occludin（1∶150），4 ℃過夜，漂洗后加入生物素化羊抗兔IgG（1∶100）、兔抗山羊IgG （1∶100），室溫60 min，洗脫后，加入鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復合物液SABC（1∶100） 60 min，DAB顯色。

1.2.6 Real-time PCR檢測炎癥因子相關基因的水平 取凍存的小腸50 mg，加入1 ml TRNzol，按說明書提取總RNA，Nanodrop2000測定RNA的濃度和純度，根據(jù)試劑盒說明書反轉錄cDNA和擴增。IL-6、TNF-α、NLRP-3、Nod-2和β-actin引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成，見表1。反應體系為25 μl，反應參數(shù)為：94 ℃預熱3 min，45個循環(huán)（94 ℃變性15 s，57 ℃退火20 s 熒光采集，72 ℃延伸30 s）。

表1 PCR引物序列Tab.1 Sequences primers of PCR

1.2.7 ELISA 法檢測腦組織5-HT和DA水平 取凍存的腦組織50 mg，加入400 μl RIPA裂解液（含1 μl PMSF）和10 μl PMSF，冰上勻漿2 min，12 000 r/min，4 ℃離心15 min，取上清-80 ℃凍存，ELISA法檢測腦組織中5-HT和DA水平，按試劑盒說明書操作。

1.2.8 ELISA法檢測血液中LPS、IL-6和TNF-α水平 取分離的血清，按試劑盒說明書檢測血液中LPS、IL-6和TNF-α水平。

1.2.9 腸道菌群的分析測定 對收集的各組小鼠糞便進行16S rDNA高通量測序。提取糞便中細菌的總DNA，取用10 ng的DNA模板，依16S rDNA V3～V4區(qū)序列，采用帶Barcode的特異引物（引物序列為314 F 5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'和805 R：5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）進行PCR擴增。采用TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，將構建好的文庫經(jīng)Qubit和qPCR定量，文庫合格后，運用HiSeq2500 PE250進行上機測序。選取OTUs代表性序列，采用Mothur方法與SILVA SSUr RNA數(shù)據(jù)庫對其進行物種注釋且獲得分類學信息。

1.3 統(tǒng)計學處理 統(tǒng)計分析使用SPSS18.0軟件， 計量資料用±s表示，采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠行為學檢測結果

2.1.1 PUN 對抑郁小鼠懸尾不動時間的影響 如表2所示，與Normal組相比，Model組小鼠懸尾不動時間顯著延長（P＜0.01），與Model組相比，中、高劑量用藥組小鼠的懸尾不動時間顯著縮短（P＜0.05，P＜0.01）。

表2 PUN對抑郁小鼠懸尾不動時間的影響（±s，n=12）Tab.2 Effect of PUN on immobility time of tail suspension in depression mice （±s，n=12）

表2 PUN對抑郁小鼠懸尾不動時間的影響（±s，n=12）Tab.2 Effect of PUN on immobility time of tail suspension in depression mice （±s，n=12）

Note：Compared with normal group，1）P＜0.01；compared with model group，2）P＜0.05，3）P＜0.01.

2.1.2 PUN 對抑郁小鼠強迫游泳不動時間的影響 如表3所示，Normal組相比，Model組小鼠的強迫游泳不動時間顯著延長（P＜0.01），與Model組相比，高、中劑量用藥組小鼠強迫游泳不動時間顯著縮短（P＜0.05）。

表3 PUN對抑郁小鼠強迫游泳實驗不動時間的影響（±s，n=12）Tab.3 Effect of PUN on immobility time of forced swimming test in depression mice （±s，n=12）

表3 PUN對抑郁小鼠強迫游泳實驗不動時間的影響（±s，n=12）Tab.3 Effect of PUN on immobility time of forced swimming test in depression mice （±s，n=12）

Note：Compared with normal group，1）P＜0.01；compared with model group，2）P＜0.01.

2.1.3 PUN對抑郁小鼠糖水消耗實驗的影響 如表4所示，與Normal組相比，Model組小鼠糖水消耗明顯減少（P＜0.01），與Model組相比，用藥組小鼠的糖水消耗明顯增加（P＜0.01）。

表4 PUN對抑郁小鼠糖水偏好實驗的影響（±s，n=12）Tab.4 Effect of PUN on sugar preference test in depression mice （±s，n=12）

表4 PUN對抑郁小鼠糖水偏好實驗的影響（±s，n=12）Tab.4 Effect of PUN on sugar preference test in depression mice （±s，n=12）

Note：Compared with normal group，1）P＜0.01； compared with model group，2）P＜0.01.

2.2 PUN對小鼠小腸腸壁屏障的影響 在本實驗組化染色圖片中，棕褐色為陽性表達。如圖1所示，正常組腸上皮中Occludin、ZO-1蛋白表達較多，模型組僅有少量表達，PUN劑量依賴性地促進其表達。

圖1 小鼠小腸腸壁緊密連接蛋白ZO-1、Occludin的表達（×400）Fig.1 Expressions of ZO-1 and Occludin in small intestine of mice （×400）

2.3 PUN對小鼠腸組織炎癥因子相關基因表達的影響 如表5所示，與Normal組相比，Model組小鼠腸壁IL-6、TNF-α、NLRP-3、Nod-2表達明顯升高（P＜0.01）。與Model組相比，用藥組小鼠腸壁IL-6、TNF-α、NLRP-3、Nod-2表達明顯降低（P＜0.01或P＜0.05）。

表5 小鼠腸壁炎癥因子相關基因相對表達量（±s，n=12）Tab.5 Relative expression of inflammation related gene in each group of mice （±s，n=12）

表5 小鼠腸壁炎癥因子相關基因相對表達量（±s，n=12）Tab.5 Relative expression of inflammation related gene in each group of mice （±s，n=12）

Note：Compared with normal group， 1）P＜0.01； compared with model group，2）P＜0.05，3）P＜0.01.

2.4 PUN對抑郁小鼠相關因子的影響

2.4.1 對抑郁小鼠血清LPS、IL-6和TNF-α的影響 由表6可知，與Normal組相比，Model組小鼠血清中LPS、IL-6和TNF-α含量顯著升高（P＜0.01），與Model組相比，用藥組小鼠血清中LPS、IL-6和TNF-α顯著降低（P＜0.01）。

表6 血清中LPS、IL-6、TNF-α含量（±s，n=12）Tab.6 Contents of LPS， IL-6 and TNF-α in serum （±s，n=12）

表6 血清中LPS、IL-6、TNF-α含量（±s，n=12）Tab.6 Contents of LPS， IL-6 and TNF-α in serum （±s，n=12）

Note：Compared with normal group， 1）P＜0.01； compared with model group，2）P＜0.01.

2.4.2 對抑郁小鼠腦內5-HT和DA的影響 由表7可知，與Normal組相比，Model組小鼠腦內5-HT、DA 含量顯著降低（P＜0.01），與Model組相比，PUN用藥顯著升高抑郁小鼠腦內5-HT、DA水平（P＜0.01）。

表7 PUN 對抑郁小鼠腦內神經(jīng)遞質的影響（±s，n=12）Tab.7 Effects of PUN on neurotransmitters in brain of depression mice （±s，n=12）

表7 PUN 對抑郁小鼠腦內神經(jīng)遞質的影響（±s，n=12）Tab.7 Effects of PUN on neurotransmitters in brain of depression mice （±s，n=12）

Note：Compared with normal group， 1）P＜0.01； compared with model group，2）P＜0.01.

2.5 PUN對小鼠腸道菌群的影響 由門、科水平熱圖（圖2A、B）和構成比堆積圖（圖2C、D）可知，抑郁模型組小鼠和正常組小鼠腸道菌群有明顯不同。PUN給藥組與抑郁模型組也有顯著改變。由表8可知，與正常組相比，抑郁模型組小鼠腸道厚壁菌門、阿克曼菌科、瘤胃菌科豐度明顯下降，擬桿菌門、螺桿菌門豐度顯著升高（P＜0.01）；與抑郁模型組相比，PUN給藥組小鼠腸道厚壁菌門、疣微菌門、毛螺菌科、瘤胃菌科、阿克曼氏菌科豐度顯著升高，擬桿菌門、變形菌門、Muri菌科、螺桿菌科豐度顯著降低（P＜0.01）。

表8 PUN對抑郁小鼠腸道菌群豐度的影響（±s，n=3）Tab.8 Effect of PUN on composition of intestinal flora in mice （±s，n=3）

表8 PUN對抑郁小鼠腸道菌群豐度的影響（±s，n=3）Tab.8 Effect of PUN on composition of intestinal flora in mice （±s，n=3）

Note：Compared with normal group， 1）P＜0.01； compared with model group，2）P＜0.01.

圖2 小鼠門、屬水平上物種組成熱圖和柱狀堆疊圖Fig.2 Column stack diagram of species composition at phylum and genus level of mice

3 討論

CUMS抑郁動物模型是國際公認的抑郁癥動物造模方法［7-9］。本研究顯示，CUMS小鼠4周后，糖水偏好率明顯減少，懸尾不動和強迫游泳不動時間明顯延長，說明動物快感缺失、心理絕望，與人類的抑郁癥狀相似，表明抑郁模型成功建立。給予PUN治療后，抑郁模型小鼠糖水偏好率明顯上升，懸尾不動和強迫游泳不動時間明顯縮短，腦內5-HT和DA明顯減少，PUN治療組小鼠腦內5-HT和DA顯著升高，表明PUN可改善抑郁模型小鼠腦內相關神經(jīng)遞質的分泌，緩解小鼠抑郁癥狀。

腸道細菌數(shù)量多、種群復雜且相互作用。同時，它們也與機體形成共生關系，影響腸道內營養(yǎng)物質的消化和吸收，也可以通過釋放代謝物質，進入體液，或與腸壁直接作用，通過神經(jīng)內分泌系統(tǒng)或自主神經(jīng)系統(tǒng)，影響包括腦在內的多系統(tǒng)生理功能。反之，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能活動，也可以影響腸道菌群的結構。因此，“腸道微生物-腸-腦”形成了一種雙向信息調節(jié)通路［10］。有研究顯示，腸道菌群可通過上述途徑影響從而參與抑郁癥的發(fā)生［11-12］。

本研究也證實，CUMS抑郁模型小鼠腸道菌群與正常對照組間有顯著差異，抑郁模型小鼠腸道厚壁菌門、阿克曼菌科、瘤胃菌科豐度明顯下降，擬桿菌門、螺桿菌科豐度顯著升高。經(jīng)PUN治療后，小鼠腸道厚壁菌門、疣微菌門、毛螺菌科、瘤胃菌科、阿克曼氏菌科豐度顯著增加，其中高劑量組疣微菌門和阿克曼氏菌科豐度以數(shù)百倍增長。擬桿菌門、變形菌門、Muri菌科、螺桿菌科豐度顯著降低。PUN對小鼠腸道菌群的作用，多數(shù)具有劑量依賴性，但是對于有些菌群，低劑量反而比中劑量作用更明顯，可能與個體差異以及統(tǒng)計的樣本數(shù)過少有關（統(tǒng)計樣本數(shù)為3）。

擬桿菌門為革蘭陰性、無芽孢、專性厭氧菌，種類多，是腸道炎癥、敗血癥的主要致病菌。有研究表明，與正常對照組人群相比，抑郁癥患者腸道菌群擬桿菌門豐度顯著升高，且在抑郁患者血液中檢測到由IgA和IgM介導的革蘭陰性菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的免疫應答增加，表明抑郁癥患者腸壁屏障受損，毒素由腸腔進入血液［13-14］。本實驗中，抑郁模型小鼠腸道擬桿菌門豐度升高，腸壁屏障蛋白表達下調，腸壁炎癥因子相關基因表達上調，血液內LPS和炎癥因子顯著升高，進一步證實CUMS會導致腸道有害菌群比例增加，破壞腸壁結構。血液內的LPS、IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎癥因子能進一步破壞血腦屏障，誘導腦內神經(jīng)元功能失調或死亡。此外有研究表明，螺桿菌可直接或間接誘導中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變［15］。PUN處理后，這些病理生理變化均得到明顯改善。

阿克曼氏菌屬于疣微菌門，可以降解黏蛋白并增強腸黏膜屏障作用，緩解代謝性內毒素血癥［16］。瘤胃菌科屬于厚壁菌門，將原代膽汁酸轉化為次生膽汁酸的主要微生物，與潰瘍性結腸炎呈負相關關系。有研究表明，瘤胃球菌可通過代謝物短鏈脂肪酸和衍生物氧化三甲胺等影響腸肽分泌和腸道通透性等機制，減少C反應蛋白和IL-6等炎癥因子的表達，減輕炎癥反應［17-18］。本實驗中，PUN顯著增加厚壁菌門中瘤胃菌科和疣微菌門中阿克曼氏菌豐度，減輕腸壁炎癥狀態(tài)、改善腸壁屏障，使血液中的LPS和炎癥因子顯著減少，從而改善腦內相關神經(jīng)遞質的分泌，緩解小鼠抑郁癥狀。

綜上所述，PUN能通過改善CUMS模型小鼠的腸道菌群結構，減輕小鼠腸壁的炎癥反應，保護腸壁屏障功能，從而減輕炎癥因子對腦組織的損害，改善相關神經(jīng)遞質的分泌，進而緩解CUMS小鼠的抑郁癥狀。本研究為進一步揭示抑郁癥的發(fā)病機制提供了新思路，也為抑郁癥的治療提供了研究方向。