基于蛋白組學探討羥基紅花黃色素A對急性肝損傷的作用機制

侯祥梅 張子英 馬月宏 金蓉 乙兵 楊冬冬 馬麗杰

急性肝損傷(acute liver injury，ALI)是一種以急性肝細胞壞死為特征的嚴重急性疾病[1]，誘導ALI的因素包括病毒感染、創(chuàng)傷、乙醇和各種有毒物質(zhì)等[2]，如果沒有得到有效的治療，嚴重或連續(xù)的肝損傷將會導致肝纖維化、肝硬化，甚至發(fā)展為肝癌[3]。肝損傷的防治是肝病臨床治療的重要步驟。

羥基紅花黃色素A(Hydroxysafflor yellow A，HSYA)是從中藥紅花中提取的一種水溶性成分[4]，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡和保護神經(jīng)等多種藥理作用[5-6]，已被證明是心血管疾病、癌癥和糖尿病的有效治療劑[7]。最近，有研究發(fā)現(xiàn)羥基紅花黃色素A對多種肝病具有保護作用，可以通過減弱炎癥條件下的巨噬細胞活化減輕肝損傷[8]；通過抑制氧化應激減輕肝纖維化[9]，通過抑制p38 MAPK磷酸化抑制肝細胞癌的血管生成[10]。然而，關(guān)于羥基紅花黃色素A保護ALI的確切機制，目前還缺乏系統(tǒng)的研究。為進一步探討羥基紅花黃色素A在ALI中的作用，本研究擬利用蛋白組學的方法，對羥基紅花黃色素A作用于ALI的多靶點、多通路等進行研究。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級Wistar雄性大鼠50只，體質(zhì)量180～220 g，購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2019-0010。所有動物均飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學實驗動物中心，室溫18～22℃。大鼠自由進食、飲水，適應性飼養(yǎng)5天后進行后續(xù)實驗。動物實驗經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學醫(yī)學倫理學委員會批準(批準文號：YKD202001020)。

1.2 實驗主要儀器、藥物與試劑

高速臺式冷凍離心機，Thermo Scientific公司；超純水裝置，Millipore公司；快速組織細胞破碎儀，上海凈信有限公司；生物組織包埋機、烘片機、攤片機，浙江科迪儀器設備有限公司；輪轉(zhuǎn)切片機、智能熒光正置顯微鏡，美國Leica公司。

羥基紅花黃色素A，成都植標化純生物技術(shù)有限公司，批號：PCS-210608；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase, ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase, AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)檢測試劑盒，BIOBASE公司，批號分別為：10323011H、10427010H、10318008H；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號分別為：A001-3、A003-1；ELISA試劑盒，武漢基因美生物科技有限公司；蘇木素—伊紅染液，biosharp公司，批號分別為：BL700B-1、BL700B-2。其他化學試劑均為分析純。

1.3 動物分組、造模與給藥

將50只雄性Wistar大鼠隨機分為五組：正常對照組、模型組及羥基紅花黃色素A低、中、高劑量組，每組10只。羥基紅花黃色素A各劑量組分別以10、20、40 mg/kg濃度腹腔注射給藥，正常對照組和模型組腹腔注射等體積生理鹽水，持續(xù)8天。第8天給藥后的1小時，除正常對照組外其余組大鼠一次性腹腔注射50% CCl4花生油溶液(0.1 mL/100 g)致ALI模型，正常對照組注射等體積的花生油[11]。處死前24小時禁食不禁水，采用腹主動脈取血，收集血清和肝臟樣本進行后續(xù)分析。

1.4 檢測指標

1.4.1 大鼠肝臟系數(shù)的表達 處死大鼠后，立即取肝臟置于冷PBS中，清洗肝臟表面殘留血液，濾紙吸干水分后稱重，計算各組大鼠肝臟系數(shù)，肝臟系數(shù)=(肝重/體重)×100%。

1.4.2 大鼠血清生化指標的表達 將血液樣品靜置1小時，離心(4℃，3500 r/min，15分鐘)，取上清液用于檢測大鼠血清中ALT、AST和ALP的水平，檢測方法參照試劑盒說明書操作。

1.4.3 大鼠氧化指標以及炎癥因子的表達 各組取適量大鼠肝右葉組織，用冷PBS洗滌，制備10%肝勻漿，離心(4℃，3500 r/min，15分鐘)，吸取上清，根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA)檢測試劑盒說明書檢測氧化指標(SOD、MDA)以及炎癥因子[腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素(interleukin,IL)-1β、IL-6]的表達。

1.4.4 大鼠肝組織的病理變化 各組大鼠肝左葉組織用10%中性福爾馬林固定，脫水，石蠟包埋，切片厚度5 μm。隨后進行蘇木素—伊紅(HE)染色，用中性樹膠封片后在光鏡下觀察各組大鼠的肝組織形態(tài)變化。

1.5 蛋白組學分析

1.5.1 蛋白制備 在正常對照組、模型組、羥基紅花黃色素A中劑量組中各隨機選取3例大鼠肝臟樣本(注：文中蛋白組學結(jié)果中所提到的羥基紅花黃色素A組僅代表羥基紅花黃色素A中劑量組)，稱取各組大鼠適量肝左葉組織，提取蛋白，依BCA試劑盒說明書進行蛋白濃度測定。

1.5.2 TMT標記以及HPLC分級 取各組等量蛋白樣品進行胰酶酶解后的肽段用Strata X C18(Phenomenex)除鹽、冷凍干燥。肽段溶解于0.5 M的TEAB溶液中，按TMT試劑盒說明書進行標記。之后用高pH反相HPLC分級，色譜柱為Agilent 300 Extend C18(粒徑5 μm，內(nèi)徑4.6 mm，長250 mm)。

1.5.3 液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用分析 肽段溶解后使用EASY-nLC 1200超高效液相系統(tǒng)進行分離[流動相A為含0.1%甲酸和2%乙腈的水溶液；流動相B為含0.1%甲酸和90%乙腈的水溶液。洗脫梯度(0～4分鐘，7%～11% B；4～53分鐘，11%～32% B；53～57分鐘，32%～80% B；57～60分鐘，80% B)，流速維持在500 nL/分鐘]。分離后的肽段被注入NSI離子源中進行電離，然后進入Orbitrap ExplorisTM480質(zhì)譜進行分析(一級質(zhì)譜掃描范圍設置為400～1200 m/z，掃描分辨率設置為60000；二級質(zhì)譜掃描范圍固定起點為110 m/z，二級掃描分辨率設置為45000，TurboTMT設置為Off)。為提高質(zhì)譜的有效利用率，自動增益控制設置為100%，信號閾值設置為5E4ions/s，最大注入時間設置為Auto，串聯(lián)質(zhì)譜掃描的動態(tài)排除時間設置為30秒避免母離子的重復掃描。

1.5.4 質(zhì)控檢測 大部分肽段分布在7～20個氨基酸，符合基于酶解和質(zhì)譜碎裂方式的一般規(guī)律。質(zhì)譜鑒定到的肽段長度的分布符合質(zhì)控要求。見圖1。

圖1 肽段長度分布圖

1.5.5 數(shù)據(jù)分析 本研究以蛋白差異表達量變化(fold change，F(xiàn)C)>1.3且P<0.05篩選差異表達蛋白(differentially expressed proteins，DEPs)；酶切方式設置為Trypsin(Full)；漏切位點數(shù)設為2；肽段最小長度設置為6個氨基酸殘基；肽段最大修飾數(shù)設為3；一級母離子質(zhì)量誤差容忍度設為10 ppm，二級碎片離子的質(zhì)量誤差容忍度為0.02 Da。將Carbamidomethyl(C)、TMTpro(peptide N-Terminus)、TMTpro(K)設置為固定修飾，將Acetyl(protein N-Terminus)、Oxidation(M)設置為可變修飾。定量方法設置為TMTpro-16plex，蛋白、肽段、PSM鑒定的FDR都設置為1%。上述試驗由杭州景杰生物科技有限公司完成。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 羥基紅花黃色素A對ALI大鼠肝臟系數(shù)以及生化指標的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠肝臟系數(shù)以及ALT、AST、ALP含量均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，羥基紅花黃色素A各劑量組大鼠ALT、ALP含量顯著降低(P<0.05)，羥基紅花黃色素A中、高劑量組大鼠肝臟系數(shù)以及AST含量均顯著降低(P<0.05)。提示羥基紅花黃色素A對大鼠肝臟具有一定的保護作用。見表1。

表1 羥基紅花黃色素A對ALI大鼠肝臟系數(shù)以及生化指標的影響

2.2 羥基紅花黃色素A對ALI大鼠氧化指標以及炎癥指標的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠肝臟中SOD含量均顯著降低(P<0.05)，MDA、TNF-α、IL-1β和IL-6的含量均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，羥基紅花黃色素A低、中、高劑量組大鼠肝臟中MDA、IL-1β和IL-6顯著降低(P<0.05)，羥基紅花黃色素A中、高劑量組中TNF-α含量均顯著降低(P<0.05)，羥基紅花黃色素A中、高劑量組中SOD含量均顯著升高(P<0.05)。提示羥基紅花黃色素A可以通過降低氧化應激以及炎癥反應發(fā)揮保肝護肝作用。見表2。

表2 羥基紅花黃色素A對ALI大鼠氧化指標以及炎癥指標的影響

2.3 羥基紅花黃色素A對ALI大鼠肝組織病理變化的影響

HE染色見正常對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝板排列整齊，未見炎性浸潤以及變性壞死；模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，肝板排列混亂，中央靜脈周圍多數(shù)融合壞死，易見凋亡小體，大部分肝細胞腫脹呈氣球樣變，肝組織可見大量炎癥細胞浸潤；羥基紅花黃色素A各劑量組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝板排列較整齊，多數(shù)中央靜脈周圍偶見凋亡小體，炎癥細胞浸潤減少，細胞變性、壞死減少。肝臟組織學結(jié)果與肝功能檢測結(jié)果一致，表明羥基紅花黃色素A可以減輕CCl4造成的ALI，有效保護肝臟。見圖2。

注：A.正常對照組；B.模型組；C.羥基紅花黃色素A低劑量組；D.羥基紅花黃色素A中劑量組；E.羥基紅花黃色素A高劑量組。

2.4 羥基紅花黃色素A對ALI大鼠DEPs變化的影響

采用TMT結(jié)合高效液相色譜分離技術(shù)，在FC>1.3和P<0.05處為顯著上調(diào)的變化閾值蛋白，在FC<1/1.3處為顯著下調(diào)的變化閾值。圖中的水平軸代表Log2轉(zhuǎn)換后的相對蛋白質(zhì)水平，而垂直軸代表在-Log10轉(zhuǎn)換后的顯著性檢驗中獲得的P值，黃點和綠點分別代表顯著上調(diào)和下調(diào)的蛋白質(zhì)。模型組與正常對照組共有243個DEPs，其中188個上調(diào)蛋白質(zhì)和55個下調(diào)蛋白；羥基紅花黃色素A組與模型組共有104個DEPs，其中37個上調(diào)蛋白質(zhì)和67個下調(diào)蛋白。見圖3。

注：A.模型組與正常對照組DEPs定量火山圖；B.羥基紅花黃色素A組與模型組DEPs定量火山圖。

2.5 羥基紅花黃色素A對ALI大鼠DEPs生物信息學變化的影響

為了闡明羥基紅花黃色素A組與模型組DEPs在某些功能上的富集趨勢，對其進行GO以及KEGG富集分析(P<0.05)。GO分析顯示：DEPs主要在胞外區(qū)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、脂蛋白顆粒等細胞組分，在輔酶結(jié)合、免疫球蛋白受體結(jié)合、抗氧化活性等分子功能，在脂質(zhì)代謝、急性炎癥反應、蛋白質(zhì)活化級聯(lián)等生物過程上顯著富集。KEGG結(jié)果顯示：DEPs主要富集在神經(jīng)活性配體-受體相互作用、藥物代謝、補體和凝血級聯(lián)、脂肪酸生物合成、PPAR等通路。見圖4。

注：A.DEPs的GO富集分析；B.DEPs的KEGG富集分析；C.PPAR信號通路圖。

3 討論

有研究證實，一些草藥提取物對肝臟疾病具有預防和治療價值[12]，且具備安全性高、多靶點、多通路等特性[13-14]。羥基紅花黃色素A被認為是該草藥類別中最具潛力的藥物之一[15]。CCl4是一種強效肝毒性藥物，常被用于ALI模型的構(gòu)建[16]。本文通過復制此動物模型，來探討羥基紅花黃色素A對ALI的潛在作用及其可能存在的分子機制。

血清酶ALT、AST、ALP是用于檢測肝功能的經(jīng)典指標，三者水平與肝組織病理學的嚴重程度成正比[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，模型組大鼠血清中的ALT、AST、ALP水平顯著升高，并伴有明顯的肝損傷病理改變。與模型組相比，羥基紅花黃色素A各劑量組可不同程度的降低ALT、AST、ALP水平，改善肝臟病變，提示羥基紅花黃色素A對CCl4誘導的ALI具有明顯的保護作用。

氧化應激和炎癥反應是CCl4誘導ALI發(fā)展過程中的關(guān)鍵步驟[18]。MDA和SOD是具有代表性的氧化參數(shù)。MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，常被用作肝臟氧化損傷的生物標志物，具有細胞毒性。SOD是一種重要的抗氧化酶，廣泛分布于各種生物體內(nèi)，是生物體內(nèi)清除脂質(zhì)過氧化物和氧自由基的首要物質(zhì)[19]。TNF-α、IL-1β等因子的釋放會誘導肝細胞炎癥，最終導致肝損傷[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠肝臟中MDA以及炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平顯著升高，SOD活性顯著降低；而給予羥基紅花黃色素A干預后，可明顯降低MDA、TNF-α、IL-1β和IL-6的水平，增強SOD活性，表明羥基紅花黃色素A通過發(fā)揮抗氧化、抗炎作用，有效保護肝臟。這與相關(guān)的報道結(jié)果基本一致[21]。

為充分了解羥基紅花黃色素A的生物學效應，本研究借助TMT技術(shù)對DEPs進行蛋白組定量分析。在模型組和正常對照組中共篩選到243個DEPs，其中188個上調(diào)蛋白質(zhì)和55個下調(diào)蛋白；在羥基紅花黃色素A組和模型組中共篩選到104個DEPs，其中37個上調(diào)蛋白質(zhì)和67個下調(diào)蛋白。GO分析顯示：DEPs主要在胞外區(qū)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、脂蛋白顆粒等部位，通過脂質(zhì)代謝、急性炎癥反應、蛋白質(zhì)活化級聯(lián)等生物過程，發(fā)揮與輔酶結(jié)合、免疫球蛋白受體結(jié)合、抗氧化活性等作用。KEGG結(jié)果顯示DEPs在脂肪酸生物合成、PPAR、補體和凝血級聯(lián)等通路富集最為顯著。脂肪酸已被證實參與肝損傷[22]。脂肪酸生物合成與脂質(zhì)積累呈正相關(guān)，一些藥物可以通過減少脂肪酸合成和脂質(zhì)積累起到保肝作用[23]。與上述報道一致，本研究發(fā)現(xiàn)，給予羥基紅花黃色素A干預后，脂肪酸生物合成通路被顯著抑制，提示羥基紅花黃色素A可以有效保護肝臟。有研究表明，PPAR通路參與多種肝臟疾病的發(fā)生，如ALI[24]、肝纖維化[25]、非酒精性脂肪性肝炎[26]等，提示該代謝通路可能是羥基紅花黃色素A干預ALI的靶點。本研究繼續(xù)挖掘到PPAR通路上富集的蘋果酸酶1(ME1)和CYP4A1。ME1是一種胞質(zhì)蛋白，可將蘋果酸催化為丙酮酸，進一步生成NADPH，從而參與脂質(zhì)和膽固醇生物合成過程[27]。ME1在多種癌癥中過表達，如胃癌[28]、結(jié)直腸癌[29]和肝癌[30]。有研究證實，ME1在非酒精性脂肪肝小鼠體內(nèi)表達升高，經(jīng)針灸治療后，則可逆轉(zhuǎn)這一過程，提示該蛋白可能參與肝損傷的過程[31]。CYP4A1屬于CYP450家族酶[32]，參與外源性物質(zhì)(如各種藥物、前毒劑)以及內(nèi)源性物質(zhì)(如膽汁酸、甾體激素、花生四烯酸)的代謝[33]。短期暴露于實驗性肝毒物氯貝特和苯巴比妥后，CYP4A1轉(zhuǎn)錄水平增加，導致體內(nèi)膽汁酸代謝異常[34]。上述靶點在CCl4誘導的ALI中未見報道，本研究發(fā)現(xiàn)，給予羥基紅花黃色素A干預后，ME1、CYP4A1蛋白均顯著下調(diào)，提示羥基紅花黃色素A可能通過調(diào)控ME1、CYP4A1來發(fā)揮保肝護肝的作用。

綜上所述，羥基紅花黃色素A可通過抑制炎癥反應、氧化應激以及多靶點、多通路改善由CCl4誘導的ALI。本課題組后期將通過轉(zhuǎn)錄組學、代謝組學等手段進一步探討羥基紅花黃色素A保肝的具體機制，為該藥在臨床上的應用提供可靠的理論基礎。