啟宮丸對多囊卵巢綜合征大鼠WNT/β-catenin信號通路的影響

李曉俊 楊斌 謝京紅

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是在遺傳、環(huán)境等多種復(fù)雜因素共同影響下引起的一種育齡期婦女常見內(nèi)分泌及代謝紊亂疾病，主要臨床特征包括：月經(jīng)紊亂或閉經(jīng)、高雄激素血癥、多囊樣卵巢、胰島素抵抗等。越來越多的證據(jù)表明卵巢顆粒細(xì)胞(granulosa cell，GC)凋亡水平增加是PCOS的發(fā)生關(guān)鍵病理機(jī)制；其中Wnt信號通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡的經(jīng)典通路，在卵巢卵泡發(fā)育中至關(guān)重要[1-2]。目前促進(jìn)PCOS卵巢GC增殖并抑制其凋亡是PCOS主要治療策略[3]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為PCOS的發(fā)生與腎、脾、肝三臟功能失調(diào)，痰濁、瘀血阻滯密切相關(guān)。眾多醫(yī)家認(rèn)為痰濕阻滯胞宮是PCOS發(fā)生的主要原因[4-5]。啟宮丸具有健脾化濕，行氣祛痰、啟宮助孕的作用，在臨床治療PCOS中療效顯著。本實(shí)驗(yàn)通過觀察啟宮丸對PCOS大鼠性激素水平的表達(dá)、卵巢病理組織形態(tài)、凋亡狀況及Wnt/β-catenin信號通路的蛋白表達(dá)的影響，探究啟宮丸對PCOS模型大鼠的治療作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級SD雌性大鼠，40只，5～6周齡，體質(zhì)量為180～220 g，購自北京市華阜康生物科技股份有限公司。動物生產(chǎn)許證號：SCXK(京)2017-0001，室溫(22±2)℃，相對濕度 55%～65%。

1.2 藥品與試劑

來曲唑片，規(guī)格：2.5 mg/片，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號：22003153。

啟宮丸，藥物組成：半夏20 g、香附20 g、川芎20 g、白術(shù)20 g、神曲15 g、茯苓15 g、蒼術(shù)12 g、橘紅12 g、甘草6 g，藥物均由中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院中藥房提供及質(zhì)檢，統(tǒng)一采用中藥煎藥機(jī)煎制，制成濃縮藥液(含生藥量0.735 g/mL)。

炔雌醇環(huán)丙孕酮片，商品名：達(dá)英-35，德國拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號：KT09FJ52。

羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，美國Sigma公司，批號：1002375619。

1.3 主要儀器

3K18型離心機(jī)(美國Sigma)，Olympus BX53型顯微鏡，TP1020型全自動脫水機(jī)(德國Leica)，RM2235型組織切片機(jī)(德國Leica)，Image-Pro Plus 6.0(美國Media Cybernetics)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 造模 所有實(shí)驗(yàn)大鼠均進(jìn)行2天的適應(yīng)性喂養(yǎng)，采用隨機(jī)數(shù)法在40只雌鼠中選取10只為正常組，正常組采用普通飼料喂養(yǎng)，余下30只大鼠灌注服來曲唑聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)進(jìn)行造模。造模組每日灌胃給藥來曲唑溶液1 mg/(kg·d)溶于0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。同時給與高脂飼料喂養(yǎng)(配方：普通飼料60%、蛋黃粉12%、豬油11%、全脂奶粉5%、蔗糖5%、花生5%、麻油1.5%、食鹽0.5%)，連續(xù)21天，進(jìn)行造模處理，正常組灌服等體積溶劑。造模第7天起，每天進(jìn)行陰道涂片，觀察2個周期，以陰道上皮細(xì)胞持續(xù)角化者為造模成功[6-7]。

1.4.2 分組與給藥方法 模型建立成功后，將30只成模大鼠隨機(jī)分為模型組，中藥啟宮丸組、陽性藥達(dá)英-35組，每組10只。中藥啟宮丸組和達(dá)英-35組統(tǒng)一按照女性60 kg體質(zhì)量，采用人和大鼠體表面積換算法計(jì)算用藥劑量，中藥組給予14.7g/(kg·d)，口服灌胃，每日一次。達(dá)英-35組給0.21 mg/(kg·d)口服灌胃，每日一次，正常組及模型組給予等量蒸餾水灌胃，干預(yù)周期為3周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后無動物死亡情況。各組大鼠末次給藥結(jié)束后，當(dāng)晚8：00后禁食，于次日測量各組大鼠體質(zhì)量并記錄，以10%水合氯醛麻醉，抽取腹主動脈血約5 mL，靜置20分鐘后3000 r/min離心15分鐘，吸取上層血清置于離心管中。取血后，采用頸椎脫臼法處死大鼠，統(tǒng)一取出子宮及卵巢。以4%的甲醛中固定。便于后續(xù)HE染色及免疫組化檢測。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 ELISA法檢測血清激素水平 按照ELISA試劑盒說明書，測定各組大鼠血清睪酮(testosterone，T)、雌二醇(Estradiol，E2)、孕酮(progesterone，P)、促黃體生成素(luteinizing hormone，LH)、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormonel，F(xiàn)SH)的激素水平并計(jì)算LH/FSH比值。

1.5.2 HE染色觀察卵巢組織病理變化 卵巢組織10%中性福爾馬林切開固定24小時后，取材，梯度酒精脫水，將透明組織浸入60℃石蠟中包埋，制成石蠟塊。將石蠟塊進(jìn)行4 μm連續(xù)切片，烤片，二甲苯脫蠟后下水，HE染色，脫水、封片后置于顯微鏡下觀察大鼠卵巢組織病理變化。

1.5.3 TUNEL染色觀察卵巢組織凋亡狀況 石蠟切片3 μm，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，20 μg/mL蛋白酶K工作液溶解蛋白酶。PBS沖洗，滴入TUNEL混合液50 μL，加蓋玻片，置于37℃暗黑盒中反應(yīng)1小時，PBS沖洗，DAB顯色，發(fā)生凋亡的細(xì)胞核顯示淡黃色至深棕色。高倍鏡下拍攝3個連續(xù)不重復(fù)視野，統(tǒng)計(jì)每個視野中細(xì)胞總數(shù)和陽性凋亡細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算凋亡率即TUNEL陽性率(%)=陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5.4 采用免疫組化法檢測Wnt、β-catenin蛋白在大鼠卵巢組織中的表達(dá) 石蠟切片3 μm，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，采用檸檬酸鹽緩沖液高壓抗原修復(fù)，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10分鐘。PBS液沖洗，滴加一抗Wnt、β-catenin(濃度分別為1/100，1/200)，4℃孵育過夜，次日常溫下復(fù)溫0.5小時，滴加二抗孵育30分鐘，DAB顯色，鏡下觀察顯色程度，顯色后自來水沖洗終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片。高倍鏡下拍攝3個連續(xù)不重復(fù)視野，采用Image-pro Plus6.0圖像分析軟件測定陽性信號的積分光密度(integral optical density，IOD)值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清中E2、T、P表達(dá)的比較

與正常組比較，模型組血清T水平升高，E2及P水平明顯減低(P<0.01)；與模型組相比較，啟宮丸組及達(dá)英-35組中E2及P水平升高，T水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。如表1所示。

表1 各組大鼠血清T、E2及P表達(dá)水平比較

2.2 大鼠血清中FSH、LH及LH/FSH數(shù)值比較

與正常組比較，模型組LH及LH/FSH水平顯著升高、FSH水平下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，啟宮丸組和達(dá)英-35組LH水平及LH/FSH比值均顯著降低(P<0.01)，F(xiàn)SH水平均有不同程度升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。如表2所示。

表2 各組大鼠血清FSH、LH及LH/FSH表達(dá)比較

2.3 大鼠卵巢組織病理改變

鏡下可見：正常組表現(xiàn)為大鼠卵巢組織中隨處可見處于不同發(fā)育階段的各級卵泡。其中優(yōu)勢卵泡中可見形態(tài)完整的多層GC(多為6～8層)，可見正常黃體。模型組表現(xiàn)為卵泡總體數(shù)量減少，閉鎖卵泡、囊狀卵泡增多，多數(shù)卵泡呈囊性改變，GC層數(shù)減少變薄(多為3～4層)，排列紊亂，黃體減少。啟宮丸組表現(xiàn)為卵泡總體數(shù)量無明顯減少，可見各級生長卵泡，閉鎖卵泡相對較少，少量卵泡呈囊性改變，GC層數(shù)明顯增加(多為4～6層)，排列規(guī)則，可見少量黃體、白體，GC數(shù)增多。達(dá)英-35組卵泡發(fā)育及閉鎖卵泡改善方面效果同啟宮丸組，但是GC層稀疏較少(多為3～4層)。如圖1所示。

注：A正常組; B模型組；C啟宮丸組; D達(dá)英-35組

2.4 大鼠卵巢組織凋亡狀況

TUNEL陽性表達(dá)在卵巢組織GC核內(nèi)，呈淡黃色至深棕色染色。正常組大鼠卵巢組織僅有少量TUNEL陽性細(xì)胞散在分布。與正常組相比，模型組TUNEL陽性細(xì)胞率明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，啟宮丸組和達(dá)英-35組TUNEL陽性細(xì)胞率明顯下降(P<0.01)，其中啟功丸組和達(dá)英35組TUNEL陽性細(xì)胞率未見明顯差異(P>0.05)。如表3所示。

表3 各組大鼠卵巢組織凋亡狀況比較

2.5 大鼠卵巢組織Wnt、β-catenin蛋白表達(dá)

檢查指標(biāo)Wnt和β-catenin表達(dá)在卵巢組織的GC胞膜及胞漿內(nèi)，呈淡黃色至棕黃色，以胞膜為主，卵泡膜細(xì)胞偶有表達(dá)，本次實(shí)驗(yàn)僅統(tǒng)計(jì)GC胞膜表達(dá)部分，正常組Wnt及β-catenin蛋白呈強(qiáng)陽性表達(dá)，表達(dá)范圍廣泛。與正常組相比，模型組Wnt及β-catenin蛋白表達(dá)水平均顯著下降(P<0.01)，表達(dá)率減少；與模型組相比，啟宮丸組和達(dá)英-35組Wnt及β-catenin表達(dá)水平均有不同程度上升(P<0.05或P<0.01)，表達(dá)范圍增加。如圖2～3、表4所示。

表4 各組大鼠卵巢組織Wnt、β-catenin蛋白表達(dá)比較

注：A正常組;B模型組；C啟宮丸組;D達(dá)英-35組

注：A正常組;B模型組；C啟宮丸組;D達(dá)英-35組

3 討論

PCOS是女性常見異質(zhì)性生殖、代謝紊亂疾病，是導(dǎo)致育齡期女性不孕的主要原因，占無排卵性不孕的75%[8]。遠(yuǎn)期可引起腫瘤、心腦血管疾病、血脂血糖異常等多種內(nèi)分泌代謝系統(tǒng)并發(fā)癥[9-10]，嚴(yán)重危害患者身心健康及家庭，現(xiàn)代流行病學(xué)調(diào)查顯示：該病在育齡期女性的發(fā)病率為6%～21%[11]，是目前生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域主要研究方向。臨床主要治療方式包括調(diào)整月經(jīng)周期、促排卵、手術(shù)等，但副作用多，治療效果不理想。本病屬于中醫(yī)學(xué)中閉經(jīng)、月經(jīng)過少、不孕、癥瘕、崩漏等范疇，歷代醫(yī)家認(rèn)為PCOS的主要病機(jī)為水濕內(nèi)停，積聚成痰，阻滯胞宮。因此，根據(jù)“治病求本”的原則，臨床治療應(yīng)以燥濕化痰為法。啟宮丸出自清代醫(yī)家汪昂《醫(yī)方集解》，組方以二陳為君藥加行氣活血藥而成，能治婦人體肥痰盛，脂膜閉塞子宮，不能孕育。臨床大量研究證明啟宮丸能夠降低PCOS患者體質(zhì)量、調(diào)節(jié)HPO軸激素分泌、促進(jìn)優(yōu)勢卵泡形成及排卵，改善PCOS患者的臨床癥狀[12-13]，但其治療機(jī)制尚待不明確。

PCOS的關(guān)鍵病理改變是卵泡發(fā)育障礙，表現(xiàn)為卵泡發(fā)育程中激素分泌異常，卵泡募集亢進(jìn)、閉鎖，GC凋亡異常增加，無優(yōu)勢卵泡形成及排卵等。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，模型組大鼠卵巢組織中可見明顯多囊樣擴(kuò)張卵泡，閉鎖卵泡增加，無成熟卵母細(xì)胞，黃體數(shù)目減少，GC排列紊亂，稀疏變薄退化。啟宮丸組大鼠卵巢組織鏡下可見各級卵泡形態(tài)正常，GC層數(shù)較模型組增多，可見少量黃體及白體，提示可能存在排卵。卵泡的發(fā)育受到激素的調(diào)控，與卵巢GC關(guān)系密切[14]。GC內(nèi)包含F(xiàn)SH、E、T相關(guān)激素受體，對FSH和LH刺激作出反應(yīng)，能增加P450arom(P450芳香酶)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)雄激素向雌激素轉(zhuǎn)化，刺激卵泡的生長和排卵[15]。同時GC還具備合成E2和P等類固醇的能力，增強(qiáng)LH排卵峰正反饋?zhàn)饔?，從而誘導(dǎo)排卵。與模型組相比，經(jīng)啟宮丸治療的大鼠FSH顯著升高，LH、LH/FSH明顯降低。T水平升高、E2、P水平降低。提示啟宮丸干預(yù)后能夠提升PCOS大鼠卵泡質(zhì)量，增加GC層數(shù)，糾正激素失衡狀態(tài)。表明啟宮丸對PCOS具有較好的治療作用。

近些年，研究發(fā)現(xiàn)GC的異常增殖凋亡可能是PCOS發(fā)病的病理基礎(chǔ)[16-18]。卵泡經(jīng)歷募集、選擇，形成優(yōu)勢卵泡后，其余卵泡發(fā)生閉鎖，卵泡的閉鎖取決于卵巢GC的凋亡機(jī)制。GC增殖和凋亡信號通路之間的平衡決定卵泡的命運(yùn)。本實(shí)驗(yàn)通過TUNEL法對比各組大鼠卵巢組織凋亡狀況，結(jié)果證明模型組大鼠卵巢組織凋亡率明顯增加，而經(jīng)過啟宮丸治療后PCOS大鼠凋亡率明顯降低。提示啟宮丸能抑制大鼠卵巢GC凋亡水平。Wnt/β-catenin信號通路在GC中表達(dá)，參與卵泡發(fā)育、排卵、增殖與凋亡過程，與 GC功能異常及PCOS 的發(fā)生密切相關(guān)。

Wnt/β-catenin通路通過調(diào)節(jié)下游分子核內(nèi)原癌基因c-Myc及細(xì)胞周期蛋白cyclinD1的表達(dá)，來調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、分化及遷移功能[19]。β-catenin是Wnt通路中的核心分子，非活化狀態(tài)下定位于細(xì)胞胞漿，正常情況下胞漿內(nèi)糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)復(fù)合體通過磷酸化、泛素化對β-catenin進(jìn)行降解，使得其濃度水平較低，無法介導(dǎo)下游信號。當(dāng)細(xì)胞被特定因素刺激時，Wnt與位于細(xì)胞膜表面的Frizzled受體結(jié)合，誘導(dǎo)GSK-3β復(fù)合體解離，解除了對β-catenin的抑制作用，激活下游靶基因。Wnt/β-catenin通路對卵巢發(fā)育的影響，一方面體現(xiàn)在Wnt/β-catenin與性激素受體通路存在多種方式的交互作用，是卵巢類固醇激素分泌重要的調(diào)控途徑；另一方面體現(xiàn)在決定細(xì)胞命運(yùn)走向，調(diào)控細(xì)胞的存活、增殖、分化和凋亡活動，與GC的增殖、排卵、黃體化和卵泡閉鎖等重要的卵巢發(fā)育事件緊密相連[20]。既往研究表明Wnt通路可以促進(jìn)卵泡GC雌激素的分泌，同時能夠調(diào)節(jié)FSH及LH激素分泌，對類固醇生成和及排卵有積極作用[21]。Wu等[22]發(fā)現(xiàn)PCOS患者β-catenin及其下游靶蛋白(Survivin、BMP4)的表達(dá)與凋亡因子Bax和Bcl-2的表達(dá)成反比，認(rèn)為WNT/β-catenin通路參與調(diào)控卵巢細(xì)胞凋亡，是PCOS形成的重要機(jī)制。專家學(xué)者逐漸認(rèn)識到Wnt/β-catenin或可成為PCOS新的治療靶點(diǎn)，但尚未有相關(guān)研究進(jìn)行驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組卵巢GC較正常組Wnt、β-catenin表達(dá)水平顯著降低，中藥啟宮丸組較模型組改善明顯。表明啟宮丸能提高wnt/β-catenin信號通路的表達(dá)，減少GC凋亡。

綜上所述，本研究表明啟宮丸可改善PCOS癥狀，促進(jìn)卵泡發(fā)育可排卵，其機(jī)制可能與激活Wnt/β-catenin信號通路，減少GC凋亡反應(yīng)，調(diào)節(jié)卵巢激素分泌，從而促進(jìn)卵泡發(fā)育與排卵有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)樣本量較小，未來需要進(jìn)行大量實(shí)驗(yàn)及臨床研究進(jìn)一步驗(yàn)證。