基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探討復(fù)方黃精大蜜丸對抗衰老的機(jī)制

陳高策，吳鑫雨，陳永，宋子樂，吳超，梁澤華*

1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院（杭州 311499）；2. 浙江民泰醫(yī)藥有限公司（杭州 311200）

黃精是常用的藥食同源中藥，有多種活性物質(zhì)。將黃精制成蜜丸最早記載于《太平圣惠方》[1]中。徐宇琳等[2]對黃精的藥食同源歷史進(jìn)行考究，考究發(fā)現(xiàn)黃精有補(bǔ)精髓、壯筋骨、延年益壽等補(bǔ)養(yǎng)之效。在現(xiàn)代藥理研究中，黃精有增強(qiáng)免疫[3]、調(diào)節(jié)血糖血脂[4]、改善記憶[5]、防治骨質(zhì)疏松[6]、抗癌[7-8]、抗衰老[9]、抗炎[10-11]等功效。而復(fù)方黃精大蜜丸是以黃精為主，輔以黃芪、人參、茯苓等藥物制成的具有一定保健功效的產(chǎn)品。

衰老是機(jī)體的組織器官受到各種因素的影響，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生不可逆的退行性變化。同時(shí)衰老會(huì)導(dǎo)致各類疾病如阿爾茨海默病、癌癥等的發(fā)生率指數(shù)級(jí)增長。老年人口基數(shù)和比重的不斷提高，給公共醫(yī)療衛(wèi)生和社會(huì)養(yǎng)老帶來極大挑戰(zhàn)。因此，延緩人類衰老速度具有極為重要的社會(huì)意義[12]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是新興學(xué)科，是一種基于疾病、藥物、有效成分、靶點(diǎn)基因、靶點(diǎn)蛋白相互作用的系統(tǒng)的分析方法[13]。近年來廣泛應(yīng)用于中醫(yī)藥研究中，試驗(yàn)借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，研究以被稱為“仙人余糧”的黃精作為主要成分的復(fù)方黃精大蜜丸，對抗衰老的潛在藥效成分、作用靶點(diǎn)及信號(hào)通路，為黃精的多樣化開發(fā)提供理論依據(jù)，開拓黃精作為保健食品的市場。

1 材料與方法

1.1 復(fù)方黃精大蜜丸的活性成分和靶點(diǎn)收集

運(yùn)用TCMSP數(shù)據(jù)庫（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）檢索復(fù)方黃精大蜜丸的十味中藥（黃精、黃芪、人參、茯苓、白芍、大棗、麻黃、生姜、松子仁、桂枝）的所有化學(xué)成分。接著根據(jù)口服生物利用度（OB）、類藥性（DL）對每個(gè)化學(xué)成分以O(shè)B≥30%，DL≥0.18為篩選條件進(jìn)行篩選。運(yùn)用TCMSP數(shù)據(jù)庫預(yù)測活性成分的作用靶點(diǎn)，借助Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/），限定基因來源為Homo sapiens且已驗(yàn)證，將收集到的靶點(diǎn)名稱轉(zhuǎn)化為規(guī)范的基因ID。運(yùn)用Cytoscape 3.9.1構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 衰老相關(guān)靶點(diǎn)收集

運(yùn)用Gene Cards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）以“aging”為檢索詞進(jìn)行檢索以獲得衰老相關(guān)靶點(diǎn)，Gene Cards數(shù)據(jù)庫中Score值的高低和靶點(diǎn)與疾病聯(lián)系的密切度呈正相關(guān)，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)最終篩選出Score值大于等于4.312 200 069的1 653個(gè)靶點(diǎn)納入試驗(yàn)，將所得的靶點(diǎn)信息進(jìn)行基因名和Uniprot ID的標(biāo)準(zhǔn)化，得到衰老的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 “有效成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖的繪制

將復(fù)方黃精大蜜丸活性成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)取交集，得到交集靶點(diǎn)，利用Cytoscape 3.7.2軟件繪制“有效成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)degree值篩選出主要有效成分。

1.4 交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將藥物與疾病交集靶點(diǎn)上傳到STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org）進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，限定物種為“Homo sapiens”，隱藏游離節(jié)點(diǎn)，參數(shù)均為默認(rèn)設(shè)置，得到PPI網(wǎng)絡(luò)文件，將其導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1作圖并美化。

1.5 交集靶點(diǎn)GO和KEGG富集分析

將交集靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入David平臺(tái)（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）限定物種為“Homo sapiens”分析其生物學(xué)過程與通路，將數(shù)據(jù)運(yùn)用微生信平臺(tái)（http：//www.bioinformatics.com.cn/）進(jìn)行可視化處理。

1.6 分子對接

將“有效成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖中degree較高的3個(gè)有效成分與PPI網(wǎng)絡(luò)中degree值最高的7個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接。從TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取有效成分的MOL2格式文件，從PDB數(shù)據(jù)庫（http：// www.rcsb.org/pdb）獲取核心蛋白質(zhì)的PDB格式文件。使用AutoDockTools 1.5.7和PyMOL4.6.0對核心蛋白質(zhì)進(jìn)行去除水分子、金屬離子，分離配體和受體，加氫，轉(zhuǎn)化文件格式等操作。對接過程使用AutoDock Vina 1.1.2執(zhí)行，將結(jié)果制成熱圖，并將結(jié)合能最低的模型運(yùn)用PyMOL4.6.0進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)方黃精大蜜丸的活性成分和靶點(diǎn)收集

從TCMSP數(shù)據(jù)庫中篩出藥物活性成分，其中白芍活性成分6個(gè)、大棗活性成分15個(gè)、茯苓活性成分3個(gè)、桂枝活性成分5個(gè)、黃精活性成分6個(gè)、黃芪活性成分11個(gè)、麻黃活性成分12個(gè)、人參活性成分10個(gè)、生姜活性成分3個(gè)、松子仁活性成分1個(gè)。篩選得到活性成分靶點(diǎn)分別有白芍79個(gè)、大棗188個(gè)、茯苓20個(gè)、桂枝42個(gè)、黃精75個(gè)、黃芪189個(gè)、麻黃203個(gè)、人參102個(gè)、生姜47個(gè)、松子仁19個(gè)。去除重復(fù)后，共得到活性成分26種，活性成分靶點(diǎn)259個(gè)。

2.2 衰老相關(guān)靶點(diǎn)收集

以“aging”為檢索詞在上述GeneCards數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，收集相關(guān)靶點(diǎn)，篩選得到相關(guān)靶點(diǎn)1 653個(gè)，將疾病靶點(diǎn)與活性成分靶點(diǎn)取交集，使用Venny2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）制作韋恩圖最終得交集靶點(diǎn)160個(gè)，見圖1。

圖1 復(fù)方黃精大蜜丸活性成分靶點(diǎn)與衰老相關(guān)靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 “有效成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖的繪制

使用Cytoscape 3.9.1對160個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行“有效成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖的繪制，見圖2。根據(jù)度值篩選較為重要的活性成分，其中，槲皮素、山奈酚、異鼠李素的度值明顯較高，這些成分可能是復(fù)方黃精大蜜丸抗衰老的核心成分，見表1。

圖2 “有效成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

表1 復(fù)方黃精大蜜丸主要的活性成分信息

圖2中，方形圖標(biāo)代表疾病與藥物的交集靶點(diǎn)，周圍的圓形圖標(biāo)代表藥物的各個(gè)組分。圖形的大小由degree值決定，degree值越大圖形越大。

2.4 交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將上述160個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，獲取PPI網(wǎng)絡(luò)圖，去除游離靶點(diǎn)后，導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1進(jìn)行直觀的拓?fù)浞治?，?jié)點(diǎn)的大小和顏色的變化根據(jù)degree值而設(shè)定，degree值越大節(jié)點(diǎn)面積越大，顏色越深，反之節(jié)點(diǎn)面積越小，顏色越淺；邊線條的粗細(xì)和顏色的變化由Combined Score值決定，Combined Score越高連線越粗，顏色越深，反之連線越細(xì)，顏色越淺，見圖3。將degree值排名前7的蛋白篩選出來，見表2，復(fù)方黃精大蜜丸可能主要通過這些靶點(diǎn)起抗衰老的作用，認(rèn)為這些靶點(diǎn)是復(fù)方黃精大蜜丸抗衰老的核心靶點(diǎn)。

圖3 復(fù)方黃精大蜜丸抗衰老靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

表2 PPI網(wǎng)絡(luò)中degree值排名前7的靶點(diǎn)

2.5 交集靶點(diǎn)GO和KEGG富集分析

運(yùn)用David數(shù)據(jù)庫對復(fù)方黃精大蜜丸抗衰老相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行信號(hào)通路分析。運(yùn)用微生信進(jìn)行可視化處理后，得到GO分析和KEGG分析圖，見圖4和圖5。可見“交集靶點(diǎn)”參與的生物學(xué)過程（BP）主要包括等RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控，基因表達(dá)的正向調(diào)控，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，對藥物的反應(yīng)，DNA模板轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控，細(xì)胞增殖的正調(diào)節(jié)以及凋亡過程的負(fù)調(diào)控等?！敖患悬c(diǎn)”細(xì)胞組分（CC）富集在質(zhì)膜、胞質(zhì)溶膠、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、核質(zhì)、膜的組成部分、細(xì)胞外空間，細(xì)胞外區(qū)等?！敖患悬c(diǎn)”主要分子功能（MF）富集在蛋白質(zhì)結(jié)合、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合、金屬離子結(jié)合、蛋白質(zhì)同二聚化活性等。

圖4 復(fù)方黃精大蜜丸抗衰老交集靶點(diǎn)的GO富集分析圖

圖5 復(fù)方黃精大蜜丸抗衰老交集靶點(diǎn)的KEGG富集分析圖

KEGG富集分析進(jìn)一步解釋復(fù)方黃精大蜜丸抗衰老的潛在機(jī)制，發(fā)現(xiàn)參與的通路主要有PI3K-Akt信號(hào)通路、化學(xué)致癌-受體激活、MAPK信號(hào)通路，這些通路可能是復(fù)方黃精大蜜丸抗衰老的關(guān)鍵通路。此外還有如癌癥通路、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化等通路，表明復(fù)方黃精大蜜丸可能參與相關(guān)疾病的調(diào)節(jié)。

2.6 分子對接

圖8 槲皮素與TNF分子對接結(jié)果

將復(fù)方黃精大蜜丸的核心成分槲皮素、山奈酚、異鼠李素和核心靶點(diǎn)AKT1（PDBID：3MV5）、TNF（PDBID：3L0V）、IL6（PDBID：2E43）、TP53（PDBID：5AB9）、IL1B（PDBID：4GAI）、CASP3（PDBID：1NMS）、VEGFA（PDBID：1VPP）進(jìn)行分子對接，計(jì)算核心成分和核心靶點(diǎn)之間的結(jié)合能，預(yù)測其的結(jié)合活性，見圖6。一般認(rèn)為結(jié)合能＜-5.0 kcal/mol表示具有較好的結(jié)合效果，所有的對接結(jié)果均小于0，且小于-5.0 kcal/mol，可見核心成分與核心靶點(diǎn)之間都能夠良好結(jié)合，證實(shí)復(fù)方黃精大蜜丸具有一定抗衰老功效。另外，核心成分槲皮素和核心靶點(diǎn)TNF結(jié)合能為-8.7 kcal/mol是所有對接結(jié)果中最小的結(jié)果，說明槲皮素也許能通過作用于TNF起到抗衰老的效果。對接結(jié)合能最小的3個(gè)模型運(yùn)用PyMOL4.6.0展示兩者間的相互作用，見圖7～圖9。其中，虛化部分為核心靶點(diǎn)，未虛化部分為核心成分。

圖6 分子對接結(jié)合能熱圖

圖7 槲皮素與AKT1分子對接結(jié)果

圖9 山奈酚與TNF分子對接結(jié)果

3 討論

衰老是人類無法避免的最終結(jié)果，但是能夠通過抗衰老延長人類壽命及提高晚年的生活質(zhì)量。同時(shí)抗衰老從社會(huì)層面上說，能夠緩解醫(yī)療衛(wèi)生的壓力，減輕年輕勞動(dòng)者的負(fù)擔(dān)。抗衰老藥物被分為化學(xué)藥物治療，生物治療及中藥治療?；瘜W(xué)藥物治療的藥物有阿司匹林、雷帕霉素、二甲雙胍和白藜蘆醇等藥物。但是在服用的同時(shí)有明顯的高血糖、高脂血癥、腎臟毒性、免疫抑制、惡心、嘔吐不適等不良反應(yīng)。生物治療包括干細(xì)胞移植、糞便微生物移植、激素替代療法、年輕血液置換等。但其實(shí)際應(yīng)用尚需克服諸多難點(diǎn)，如干細(xì)胞移植可能會(huì)產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)、出血和感染等風(fēng)險(xiǎn)；糞便微生物移植在實(shí)際情況中存在健康捐獻(xiàn)者糞便的篩選、移植方式及可能存在病原體傳播同時(shí)又缺乏標(biāo)準(zhǔn)化治療方案等問題。中藥治療主要通過清除自由基，提高抗氧化酶活性以及增強(qiáng)免疫功能的方式抗衰老[12]。中藥治療有著明顯優(yōu)勢，如部分藥物藥食同源，毒性小或無毒性，無明顯不良反應(yīng)，藥物的依順性較好可以長期服用。

中醫(yī)抗衰老理論主要集中于腎元?dú)馓撝滤フf、五臟虛損致衰說、陰陽失和致衰說、氣血失和致衰說以及氣虛、血虛、血瘀致衰說等。其中，腎元?dú)馓撝滤フf被廣為接受。腎為衰老之根，脾為衰老之源[14]。因此中醫(yī)理論上的抗衰老主要在于對腎和脾的補(bǔ)益作用。復(fù)方黃精大蜜丸，以黃精為主要成分，輔以黃芪、人參、茯苓等藥物。而黃精有補(bǔ)氣養(yǎng)陰，健脾，益腎的功效，被稱為“仙人余糧”，古書上記載“神仙餌黃精方，黃精十斤，洗凈，蒸令爛熟，白蜜三斤，件藥相和，搗一萬杵，圓如梧桐子大，每服以溫酒三十圓，日三服，久服神仙矣”。黃芪、人參、茯苓、白芍、大棗、生姜等均有不同程度的補(bǔ)脾健脾的功效?；ハ嗯湮槟軌蚱鸬健?+1＞2”的作用。復(fù)方黃精大蜜丸味甘甜，口感綿密，便于服用且依順性較為良好。本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接的方法，探討復(fù)方黃精大蜜丸抗衰老的可能機(jī)制，為復(fù)方黃精大蜜丸的進(jìn)一步開發(fā)提供基礎(chǔ)。

根據(jù)“有效成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖篩選出的3個(gè)有效成分槲皮素、山奈酚、異鼠李素均為黃酮類。有研究證明槲皮素可以增強(qiáng)線粒體生物發(fā)生與氧化磷酸化作用，并降低與線粒體相關(guān)的細(xì)胞凋亡達(dá)到延長老年低額溞壽命的作用[15]。異鼠李素可以通過減輕氧化應(yīng)激，延緩D-半乳糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞衰老[16]。但是山奈酚抗衰老的內(nèi)容較少，值得后續(xù)進(jìn)行研究。

通過藥物與疾病的交集靶點(diǎn)制得的PPI網(wǎng)絡(luò)圖篩選得到degree值最高的7個(gè)復(fù)方黃精大蜜丸抗衰老的核心靶點(diǎn)，分別為AKT1、TNF、IL6、TP53、IL1B、CASP3、VEGFA，其中AKT1的degree值最高，其可能是復(fù)方黃精大蜜丸抗衰老的關(guān)鍵靶點(diǎn)AKT1[17]，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的自噬從而抑制細(xì)胞的衰老。Figueira等[18]發(fā)現(xiàn)，年齡相關(guān)的炎癥因子如IL-6、TNF-α表達(dá)異常與衰老有關(guān)。腫瘤蛋白p53（TP53）是一種腫瘤抑制蛋白，其調(diào)控腫瘤發(fā)生與衰老進(jìn)程。相關(guān)試驗(yàn)表明，過表達(dá)TP53可誘導(dǎo)細(xì)胞衰老，在小鼠體內(nèi)異常激活p53可降低腫瘤發(fā)生率，但也導(dǎo)致小鼠衰老。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)且受到正常調(diào)控的p53在提高機(jī)體對腫瘤耐受性的同時(shí)，不會(huì)導(dǎo)致過早衰老和壽命縮短[19]。

GO分析與KEGG富集分析是分析基因功能的有效方法，GO分析表明復(fù)方黃精大蜜丸抗衰老涉及多個(gè)生物學(xué)過程，如RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控，基因表達(dá)的正向調(diào)控，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，對藥物的反應(yīng)，DNA模板轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控，細(xì)胞增殖的正調(diào)節(jié)及凋亡過程的負(fù)調(diào)控等。KEGG結(jié)果表明交集靶點(diǎn)主要富集在PI3K-Akt信號(hào)通路、化學(xué)致癌-受體激活、MAPK信號(hào)通路等上。這些通路可能是復(fù)方黃精大蜜丸抗衰老的主要通路。PI3K-Akt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的通路之一，參與調(diào)控細(xì)胞分化、增殖和凋亡等多種生理活動(dòng)，常與轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2共同作用，以調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激造成的細(xì)胞損傷，該通路被激活可延緩機(jī)體衰老[20]。賴文芳等[21]發(fā)現(xiàn)紅景天苷能夠改善MCAO大鼠的神經(jīng)功能損傷，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，主要是通過激活PI3K-AKT信號(hào)通路，促進(jìn)AKT的磷酸化，激活NRF2的核轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)HO-1的蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善神經(jīng)功能。Ali等[22]發(fā)現(xiàn)花青素通過激活PI3K-Akt-Nrf2信號(hào)通路降低ROS水平，減輕氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷及阿爾茨海默病小鼠的神經(jīng)退行性改變，從而延緩衰老。絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）是重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)酶，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖分化和衰老等[23]。楊曉露等[24]發(fā)現(xiàn)，甘草總黃酮能抑制細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)，下調(diào)激活MAPK信號(hào)通路中磷酸化的ERK（p-ERK）蛋白表達(dá)，通過調(diào)控ERK-MAPK通路發(fā)揮抗炎、抗氧化作用，延緩衰老。宋來新等[25]發(fā)現(xiàn)，淫羊藿總黃酮對自然衰老大鼠炎癥反應(yīng)具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是通過抑制MAPK信號(hào)通路的激活，從而抑制NF-κB的核易位及其下游炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，進(jìn)而延緩腦衰老。最后，3個(gè)核心成分與7個(gè)核心靶點(diǎn)的分子對接結(jié)果展示核心靶點(diǎn)與核心成分之間良好的結(jié)合活性，這也印證復(fù)方黃精大蜜丸抗衰老的科學(xué)性。

4 結(jié)語

試驗(yàn)運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，篩選出復(fù)方黃精大蜜丸抗衰老的3個(gè)主要活性成分，這些活性成分可能通過AKT1、TNF、IL6、TP53等關(guān)鍵靶點(diǎn)，參與PI3KAkt信號(hào)、MAPK信號(hào)等通路，發(fā)揮RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控，基因表達(dá)的正向調(diào)控，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，對藥物的反應(yīng)，DNA模板轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控，細(xì)胞增殖的正調(diào)節(jié)及凋亡過程的負(fù)調(diào)控等作用從而達(dá)到抗衰老目的，同時(shí)分子對接也驗(yàn)證了核心靶點(diǎn)與核心成分的高度結(jié)合活性。試驗(yàn)初步闡明復(fù)方黃精大蜜丸抗衰老的主要藥效成分及其可能的作用靶點(diǎn)和相關(guān)通路，為后續(xù)以黃精為主要成分的保健食品進(jìn)一步開發(fā)提供思路和方向。