一種抗生物污染的導電高分子葡萄糖傳感器

李小飛，周星銀，楊琴珪，張守燕，錢思昊，朱 波

(1.中電科芯片技術(集團)有限公司，重慶 401332；2.上海大學 材料科學與工程學院，上海 200444)

0 引 言

糖尿病是一個全球性的健康問題，可對心臟、腎臟和其他器官造成慢性損害。因此，監(jiān)測血液中葡萄糖(glucose,Glu)對糖尿病患者的臨床診斷和日常護理具有重要意義[1]。目前,對于糖尿病患者日常監(jiān)測血糖主要以刺破指尖取血測量為主，這種方式會帶來身體疼痛和心理壓力，還會增加外部感染的風險。隨著電化學生物傳感器的快速發(fā)展，電化學葡萄糖傳感器可簡單并迅速地測定血糖，成為一大研究熱點。傳感器可分為微侵入式和非侵入式兩種。微侵入式設備是將微針傳感頭埋入手臂或腹部皮下組織中，這種方式具有微創(chuàng)和相對安全的特點，引發(fā)的痛感較低。非侵入式葡萄糖傳感器的研究主要集中在人體汗液、淚液、唾液等體液監(jiān)測方面。其中，汗液中含有多種代謝產(chǎn)物，組成同血液基本一致，汗液中生化標記物(如葡萄糖、鈉鉀離子、乳酸等)的指標濃度，可以很好地反映出血液中生化指標變化。由于汗液存在于皮膚表面，方便獲得，可以做到對葡萄糖的實時監(jiān)測。因此，汗液可穿戴傳感器是無創(chuàng)傳感器中研究最為廣泛的，目前已取得了一些令人鼓舞的成果[2～4]。然而，復雜生物環(huán)境下的非特異性吸附和生物污染會導致生物傳感器靈敏度降低、響應時間延長、檢測誤差擴大，甚至使傳感器失效。因此，迫切需要開發(fā)能夠有效抵抗復雜生物樣品非特異性吸附的抗污染生物傳感器。

常用的抗污染策略主要通過加入防污聚合物,達到傳感器抗污的目的，聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)及其衍生物以及兩性離子物質(磷酸膽堿(phosphoryl choline，PC)、磺基甜菜堿(sulfo-betaine，SB)和羧基甜菜堿(carboxy-betaine，CB))是最廣泛使用的防污材料。相關研究表明，將兩性離子與導電聚合物共軛的防污材料可以提高電化學傳感器的靈敏度并彌補大多數(shù)防污分子的低導電性[5]，同時對于傳統(tǒng)的酶基傳感器，用兩性離子包封酶可提高酶的活性和穩(wěn)定性[6]。PC接枝的3,4—乙烯二氧噻吩(3,4-ethylenedioxythiophene，EDOT)與SB、CB接枝相比，EDOT-PC對細胞粘附以及蛋白質吸附具有最強的抗干擾性[7]。導電聚合物聚EDOT(poly-EDOT,PEDOT)因其高導電性、生物相容性和功能化可行性被應用于各種生物醫(yī)學領域，成為用于構建柔性傳感器的導電聚合物之一。PEDOT的衍生物羥基功能化的EDOT(EDOT-OH)與PEDOT性能類似，但與PEDOT相比，EDOT-OH對基材的附著力更強，這允許構建的傳感器在水溶液狀態(tài)下進行長期實驗。

目前，還未有基于PC功能化的導電高分子應用于葡萄糖傳感器復雜界面的研究。因此，本文利用EDOT-PC與一定比例的EDOT-OH共聚，同葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOx)電沉積到金(Au)片上，構建了基于GOx的電化學葡萄糖傳感器。GOx電沉積在導電高分子中，與導電聚合物直接接觸，當葡萄糖被氧化后產(chǎn)生的電子可以直接被導電聚合物捕獲，使得制備的葡萄糖傳感器在有著明顯抗蛋白粘附的效果上，進一步呈現(xiàn)出良好的葡萄糖檢測性能。

1 實驗部分

1.1 實驗試劑與儀器

電化學工作站(PGSTAT1128N，Netherlands)用于聚合物與酶的共沉積和循環(huán)伏安測試，計時—電流測試。石英晶體微天平(quartz crystal microbalance(QCM),Analyzer，瑞典百歐林科技有限公司)用于功能化導電聚合物表面的抗粘附性測試。EDOT-OH購于南京康瑞醫(yī)藥化工有限公司，牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)和多庫酯鈉(docusate sodium,DSS)購于Sigma-Aldrich，磷酸緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)與高氯酸鋰(LiClO4)購于Aladdin，鐵氰化鉀(K3[Fe(CN)6])與亞鐵氰化鉀(K4[Fe(CN)6])均購于安耐吉，GOx與葡萄糖購于探索平臺，EDOT-PC委托合成。所用試劑均為分析純，實驗用水為去離子水。

1.2 EDOT-PC單體與沉積溶液的制備

EDOT-PC單體由課題組其他成員合成制備，合成步驟可參考課題組之前的制備方法[8]。首先，以EDOT-OH為起始單體，與2—氯—2—氧—1,3,2—二氧磷雜環(huán)戊烷(COP)反應脫去氯化氫(HCl)，生成EDOT-COP，接著EDOT-COP在三甲胺存在的條件下開環(huán)加成，非結晶產(chǎn)物通過純化后，得到EDOT-PC單體。

分別將EDOT-PC單體(16.8 mg)和EDOT-OH單體(17.4 mg)溶于含有100 mmol/L LiClO4和50 mmol/L DSS的水溶液中，然后按照不同的物質的量比(90 % EDOT-PC，80 % EDOT-PC，70 % EDOT-PC，60 % EDOT-PC)分別混合成5 mL的混合溶液，從而制得相應的沉積溶液。

1.3 QCM樣品片與葡萄糖傳感器的制備

利用電化學沉積法將EDOT-PC-co-EDOT-OH聚合物沉積到QCM片上，用于抗蛋白粘附性能的探索，其沉積路徑如圖1所示。

圖1 EDOT-PC-co-EDOT-OH聚合物的電沉積路徑

將電解槽清洗干凈，用氮氣吹干，用移液槍吸取5 mL沉積液加入其中，取出準備好的QCM片，以QCM片為工作電極，鉑網(wǎng)作為對電極，水相電極為參比電極進行電化學聚合。掃描電勢范圍為-0.600～1.046 V，掃描圈數(shù)為15圈。聚合完成后，取出QCM片，并立即用去離子水快速輕輕沖洗，氮氣吹干，進行抗蛋白粘附性測試。

將GOx(10 g/L)分散于1.2節(jié)中制備出的沉積液中，用金片作為工作電極，進行電沉積，利用聚合物的包絡作用將GOx包裹于其中，構建出葡萄糖傳感器，如圖2所示。

圖2 葡萄糖傳感器制備

2 結果與討論

2.1 功能化導電聚合物表面的抗粘附性測試

將沉積后的QCM晶片進行表面抗粘附性測試。使用QCM儀器測試這些樣品表面對BSA的抗粘附性，并用空白的金片空白樣品進行對比。取沉積好的QCM晶片放入QCM儀器中，使用微型泵抽取PBS緩沖液，以30 μL/min的速率流動PBS緩沖液，直至晶片表面達到穩(wěn)態(tài)后(數(shù)據(jù)基線保持穩(wěn)定)，開始記錄數(shù)據(jù)，以相同速率流動PBS緩沖液900 s，接著換入含BSA(1 g/L)的PBS溶液保持相同流速至2 800 s，重新?lián)Q入PBS緩沖液，去除掉粘附不牢固的BSA，4 200 s后停止實驗，記錄數(shù)據(jù)。對照組空白金片亦重復相同流程。

EDOT-PC-co-EDOT-OH與對照組的抗蛋白粘附的測試結果如圖3所示(90 % EDOT-PC難以聚合到QCM片表面，因此不做討論)。

圖3 EDOT-PC-co-EDOT-OH與空白對照組的抗蛋白粘附性能測試

由圖3可知，與QCM沉積的導電聚合物的相比之下，純金片空白樣品的頻率下降了30 Hz左右，說明該樣品表面粘附了大量蛋白，隨著EDOT-PC單體的比例不斷升高，樣品下降的頻率越小，說明EDOT-PC-co-EDOT-OH抗蛋白粘附效果越來越好，并證明EDOT-PC具有良好的抗蛋白粘附作用，在EDOT-PC含量達到80 %時，樣品的頻率下降到達最小(低于5 Hz)，因此，在后續(xù)實驗中均采用了此共聚比例。

2.2 葡萄糖傳感器的電化學性能

由上述可知EDOT-PC含量達到80 %時聚合物的抗蛋白粘附性最好，因此，取含有比例為80 % EDOT-PC單體的沉積液與10 g/L的GOx共沉積在金片上，構建出葡萄糖傳感器。在-0.600～1.046 V電壓下，采用三電極體系，用循環(huán)伏安法進行電化學聚合，其聚合曲線如圖4(a)所示，從中選取了第1圈，第5圈，第10圈，第15圈的聚合曲線進行對比。隨著圈數(shù)的不斷增加，氧化電流也隨之升高，說明導電聚合物的厚度也在逐漸增加，而沉積在聚合物中的GOx也就更多。在0.75 V的電壓下，將不同聚合圈數(shù)的傳感器浸沒于同一葡萄糖濃度(5 mmol/L)的PBS溶液進行電化學檢測，結果如圖4(b)所示。隨著聚合圈數(shù)的增加，檢測到葡萄糖傳感器的電流變化強度也隨之增加，但是，當聚合圈數(shù)過多時，會導致聚合物不穩(wěn)定，容易從金片上脫落，因此，選擇了15圈作為最優(yōu)聚合圈數(shù)。

圖4 葡萄糖傳感器的電化學性能測試結果

2.3 葡萄糖傳感器的電化學響應

在最佳實驗條件下，用計時—電流法評估了葡萄糖傳感器對葡萄糖的響應。在0.75 V的電勢下，對傳感器進行不同葡萄糖濃度(0.05～21)mmol/L的檢測，其檢測結果如圖5所示。從圖5(a)中可以看出，葡萄糖濃度越高，EDOT-PC-co-EDOT-OH構建的葡萄糖傳感器的電流響應越大，且該傳感器有著較寬的線性范圍：(0.05～21)mmol/L。由圖5(b)可知，該傳感器對葡萄糖濃度響應的判定系數(shù)(R2)非常接近1，進一步說明傳感器對葡萄糖有著良好的響應。

圖5 葡萄糖傳感器對不同濃度葡萄糖的電化學響應

2.4 葡萄糖傳感器的抗蛋白粘附性能

在能夠成功檢測到不同濃度的葡萄糖信號基礎上，為了進一步說明該傳感器能夠用于實際汗液中葡萄糖的檢測，本文配制了含有1 g/L BSA的葡萄糖(10 mmol/L)PBS溶液作為檢測液，在0.75 V的電壓下，進行傳感器抗蛋白粘附性能的測試。同時，未含BSA的同濃度葡萄糖PBS溶液作為對照組，比較了葡萄糖傳感器對添加了BSA和未添加BSA的葡萄糖溶液的響應信號強度。響應結果如圖6所示，從圖中可以看出，在添加葡萄糖溶液后，傳感器在2種狀態(tài)下均有著明顯的信號響應，在界面穩(wěn)定之后，二者響應信號幾乎一致，說明傳感器具有良好的抗蛋白粘附性能。

圖6 葡萄糖傳感器抗蛋白粘附性能測試

3 結 論

本文利用共沉積法將葡萄糖氧化酶包裹在EDOT-PC-co-EDOT-OH的三維網(wǎng)絡里，共同沉積到金片上，構建出電化學葡萄糖傳感器。該方法能夠使得葡萄糖氧化酶和導電聚合物直接接觸，進行快速的電子傳遞。該傳感器不僅對葡萄糖有著良好的電化學響應(0.05～21)mmol/L，且當EDOT-PC與EDOT-OH單體物質的量比為 4︰1時，傳感器具有優(yōu)異的抗蛋白粘附效果。因此，該電化學葡萄糖傳感器可滿足在汗液中檢測葡萄糖的需求，并為柔性可穿戴汗液傳感器的構建提供了一定技術基礎。