長鏈非編碼RNA PCGEM1、microRNA-642a-5p表達與HPV陽性宮頸癌根治術(shù)術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系研究*

譚立鳳，趙萌，祝愿

（淄博市婦幼保健院 婦科，山東 淄博 255000）

宮頸癌是全球范圍內(nèi)高發(fā)婦科惡性腫瘤，全球每年約有10%的癌癥患者死于該病[1-2]。高危型人乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus,HPV）長期持續(xù)感染可導(dǎo)致癌變，其早期由于無明顯臨床癥狀，多數(shù)患者確診時已處于中晚期[3]。宮頸癌根治術(shù)是臨床治療宮頸癌的主要治療手段之一，可有效延長患者的生存時間，但仍有部分患者在術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)[4]。復(fù)發(fā)的宮頸癌患者病死率較高，因此對宮頸癌根治術(shù)術(shù)后復(fù)發(fā)進行預(yù)測，對改善患者預(yù)后具有重要意義，目前臨床中亟須尋找對宮頸癌根治術(shù)術(shù)后復(fù)發(fā)進行預(yù)測的理想標(biāo)志物。

長鏈非編碼核糖核酸（long non-coding ribonucleic acid,LncRNA）在調(diào)節(jié)細胞增殖、分化等過程中具有重要作用，其中LncRNA 前列腺癌基因表達標(biāo)記1（prostate cancer gene expression signature 1,PCGEM1）最早在人前列腺癌LNCaP 細胞中被發(fā)現(xiàn)過表達，并參與前列腺癌、胃癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5]，然而有關(guān)LncRNA PCGEM1 在宮頸癌患者中的表達目前尚罕見報道。MicroRNA-642a-5p（miR-642a-5p）是口腔鱗癌等多種惡性腫瘤的抑制因子，高表達的miR-642a-5p 能夠抑制癌細胞的生長、轉(zhuǎn)移，對腫瘤具有一定的抑制功能[6]。LncRNA PCGEM1、miR-642a-5p 兩者之間存在一定的聯(lián)系，相關(guān)研究[7]表明，LncRNA PCGEM1 表達降低時可通過調(diào)節(jié)miR-642a-5p/LGMN 軸抑制宮頸癌細胞的增殖、遷移及侵襲。目前宮頸癌組織LncRNA PCGEM1、miR-642a-5p 的表達與HPV 陽性宮頸癌根治術(shù)術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系尚不清楚，有待進一步探討。本研究通過回顧性分析行根治術(shù)的HPV 陽性宮頸癌患者的臨床資料，對上述問題進行研究探討，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料選取2018年2月—2020年4月淄博市婦幼保健院184 例HPV 陽性宮頸癌患者為研究對象?；颊吣挲g22～77 歲，平均（46.98±9.31）歲；體質(zhì)量指數(shù)（BMI）18.27~27.89 kg/m2，平均（22.81±2.61）kg/m2。

1.1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)①經(jīng)臨床病理確診為宮頸癌[8]；②反點雜交技術(shù)檢測結(jié)果為HPV 陽性[9]；③年齡>25 歲；④美國麻醉醫(yī)師協(xié)會分級Ⅰ、Ⅱ級；⑤臨床分期Ⅰ~Ⅲ期；⑥均行宮頸癌根治術(shù)治療。

1.1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)①凝血功能障礙者；②合并其他惡性腫瘤者；③肝腎等重要臟器嚴(yán)重損傷者；④先天性心臟病者；⑤精神疾病或認(rèn)知障礙者；⑥術(shù)前接受放、化療或生物免疫治療者；⑦手術(shù)切緣陽性者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)同意，患者簽署知情同意書。

1.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測LncRNA PCGEM1、miR-642a-5p表達

術(shù)中收集宮頸癌組織標(biāo)本，立即放入液氮中冷凍保存，后轉(zhuǎn)入-80℃超低溫冰箱中保存。qRTPCR 檢測宮頸癌組織LncRNA PCGEM1、miR-642a-5p mRNA 相對表達量。取宮頸癌組織，用TRIzol 法提取組織總RNA，檢測RNA 的質(zhì)量和濃度，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。總反應(yīng)體系20 μL：10 μL 2×SYBR Mix，10×cDNA 模板1 μL，正反向引物各1.0 μL，H2O 8 μL，每樣品3 個重復(fù)。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性12s、60℃退火32 s，72℃延伸3 min，共38 個循環(huán)。在PCR 儀（型號：RTQ-960，杭州艾康生物技術(shù)有限公司）上進行反應(yīng)，qRT-PCR 引物序列見表1。LncRNA PCGEM1以β-actin為內(nèi)參，miR-642a-5p以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 治療方法

所有研究對象均接受宮頸癌根治術(shù)（包含廣泛子宮切除術(shù)和盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)）治療，并依據(jù)患者情況在術(shù)后給予輔助治療，治療方式主要包括放療（常規(guī)放療、調(diào)強適形放療）、化療（順鉑、長春新堿聯(lián)合博來霉素；卡鉑聯(lián)合多西他賽；順鉑聯(lián)合紫杉醇；奈達鉑聯(lián)合紫杉醇；卡鉑聯(lián)合紫杉醇；順鉑聯(lián)合多西他賽等）及放化療（給予常規(guī)放療或調(diào)強適形放療的同時接受靜脈滴注順鉑或奈達鉑化療）。

1.4 隨訪及術(shù)后復(fù)發(fā)定義

隨訪2年，通過門診、電話等方式進行隨訪，每2 個月1 次，隨訪截止時間為2022年4月。以術(shù)后出現(xiàn)臨床、影像或組織學(xué)的疾病證據(jù)定義為復(fù)發(fā)，主要包括局部復(fù)發(fā)（陰道殘端和主動脈分叉以下的盆腔淋巴結(jié)區(qū)域出現(xiàn)復(fù)發(fā)腫塊）、遠處轉(zhuǎn)移（局部復(fù)發(fā)以外區(qū)域的疾病復(fù)發(fā)），以及局部復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移同時發(fā)生[10]。

1.5 觀察指標(biāo)

主要為可能影響HPV 陽性宮頸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的臨床資料，包括年齡、BMI、病理類型、臨床分期、分化程度、宮頸浸潤深度、是否存在盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤最大直徑、術(shù)后治療、總膽紅素、血肌酐、宮頸癌組織LncRNA PCGEM1、miR-642a-5p mRNA相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗或方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t法；計數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗；多因素Logistic逐步回歸分析影響HPV 陽性宮頸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的危險因素；繪制受試者工作特征（ROC）曲線。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同臨床分期HPV 陽性宮頸癌組織LncRNA PCGEM1、miR-642a-5pmRNA 相對表達量的比較

臨床分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期宮頸癌組織LncRNA PCGEM1 mRNA、miR-642a-5p mRNA 相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），Ⅲ期和Ⅱ期宮頸癌組織LncRNA PCGEM1 mRNA 相對表達量高于Ⅰ期（P<0.05），miR-642a-5p mRNA 相對表達量低于Ⅰ期（P<0.05），Ⅲ期宮頸癌組織LncRNA PCGEM1 mRNA 相對表達量高于Ⅱ期（P<0.05），miR-642a-5p mRNA 相對表達量低于Ⅱ期（P<0.05）。見表2。

表2 不同臨床分期宮頸癌組織LncRNA PCGEM1、miR-642a-5p mRNA相對表達量比較 （±s）

表2 不同臨床分期宮頸癌組織LncRNA PCGEM1、miR-642a-5p mRNA相對表達量比較 （±s）

注：①與Ⅰ期比較，P <0.05；②與Ⅱ期比較，P <0.05。

臨床分期Ⅰ期Ⅱ期Ⅲ期F 值P 值n 46 87 51 LncRNA PCGEM1 mRNA 0.59±0.08 0.81±0.07①1.21±0.26①②217.145 0.000 miR-642a-5p mRNA 1.21±0.18 1.07±0.12①0.69±0.14①②181.078 0.000

2.2 HPV陽性宮頸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)情況

本研究中184 例HPV 陽性宮頸癌患者經(jīng)宮頸癌根治術(shù)治療后共有28 例復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率為15.22%（28/184）。

2.3 復(fù)發(fā)組和未復(fù)發(fā)組患者臨床資料的比較

復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組患者年齡、BMI、病理類型、術(shù)后治療、總膽紅素及血肌酐比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組患者臨床分期、分化程度、宮頸浸潤深度、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤最大直徑，以及宮頸癌組織LncRNA PCGEM1、miR-642a-5p mRNA 相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），復(fù)發(fā)組宮頸癌組織LncRNA PCGEM1 mRNA 相對表達量高于未復(fù)發(fā)組（P<0.05），復(fù)發(fā)組miR-642a-5p mRNA 相對表達量低于未復(fù)發(fā)組（P<0.05）。見表3。

表3 兩組患者臨床資料的比較

2.4 影響HPV陽性宮頸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的多因素Logistic逐步回歸分析結(jié)果

以HPV 陽性宮頸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)為因變量（未復(fù)發(fā) = 0，復(fù)發(fā) = 1），以臨床分期（Ⅰ、Ⅱ期 = 0，Ⅲ期 =1）、分化程度（中/高分化 = 0，低分化 = 1）、宮頸浸潤深度（<1/2 = 0，≥ 1/2= 1）、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（否 = 0，是 =1）、腫瘤最大直徑（< 4 cm= 0，≥ 4 cm= 1）、宮頸癌組織LncRNA PCGEM1、miR-642a-5p 表達（均為連續(xù)變量）為自變量，進行多因素Logistic 逐步回歸分析（α入=0.05，α出=0.10），結(jié)果顯示：臨床分期Ⅲ期[O^R=2.815（95%CI：1.226，6.462）]、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[O^R=2.892（95% CI：1.202，6.968）]、宮頸癌組織LncRNA PCGEM1 表達[O^R=3.267（95% CI：1.642，8.754）]、miR-642a-5p 表達[O^R=3.337（95% CI：2.031，9.846）]均為影響HPV 陽性宮頸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的危險因素（P<0.05）。見表4。

表4 影響HPV陽性宮頸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的多因素逐步Logistic回歸分析參數(shù)

2.5 宮頸癌組織LncRNA PCGEM1、miR-642a-5p表達對HPV陽性宮頸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測價值

ROC 曲線分析結(jié)果顯示，宮頸癌組織LncRNA PCGEM1、miR-642a-5p 及兩者聯(lián)合對HPV 陽性宮頸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)預(yù)測的敏感性分別為75.00%（95% CI：0.548，0.886）、78.57%（95% CI：0.586，0.910）和75.00%（95% CI：0.548，0.886），特異性分別為78.21% （95% CI：0.708，0.842）、73.08%（95% CI：0.653，0.797）和96.15%（95% CI：0.914，0.984），AUC分別為0.724（95% CI：0.653，0.787）、0.796（95% CI：0.730，0.851）和0.856（95% CI：0.797，0.904）。見表5和圖1。

表5 LncRNA PCGEM1、miR-642a-5p表達及兩者聯(lián)合預(yù)測HPV陽性宮頸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的效能分析

圖1 LncRNA PCGEM1、miR-642a-5p表達及兩者聯(lián)合預(yù)測HPV陽性宮頸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的ROC曲線

3 討論

宮頸癌為臨床常見的生殖道惡性腫瘤，其病因目前尚不明確，可能與分娩次數(shù)、病毒感染、不良性行為等因素有關(guān)，隨著疾病的進展可能導(dǎo)致尿管梗阻、尿毒癥等疾病的發(fā)生，需及時進行治療[11-13]。目前臨床多采用宮頸癌根治術(shù)對宮頸癌患者進行治療，其治療效果確切，但術(shù)后復(fù)發(fā)率仍高達20% 左右，嚴(yán)重威脅著患者的生命健康[14-15]。通過對LncRNA PCGEM1、miR-642a-5p 表達與HPV 陽性宮頸癌根治術(shù)術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系進行探討，對臨床預(yù)測該類患者的預(yù)后具有重要意義。

本研究結(jié)果顯示，臨床分期Ⅲ期和Ⅱ期宮頸癌組織LncRNA PCGEM1 mRNA 相對表達量高于Ⅰ期，miR-642a-5p mRNA 相對表達量低于Ⅰ期；Ⅲ期宮頸癌組織LncRNA PCGEM1 mRNA 相對表達量高于Ⅱ期，miR-642a-5p mRNA 相對表達量低于Ⅱ期，提示隨著HPV 陽性宮頸癌的進展，宮頸癌組織LncRNA PCGEM1 表達異常升高，miR-642a-5p 表達異常降低。本研究中，HPV 陽性宮頸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)率為15.22%，提示HPV 陽性宮頸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，與既往陳煙培等[16]研究結(jié)果14.39%相接近。本研究結(jié)果表明，復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組患者臨床分期、分化程度、宮頸浸潤深度、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤最大直徑，以及宮頸癌組織LncRNA PCGEM1、miR-642a-5p mRNA 相對表達量比較有差異，復(fù)發(fā)組宮頸癌組織LncRNA PCGEM1 mRNA相對表達量高于未復(fù)發(fā)組，miR-642a-5p mRNA 相對表達量低于未復(fù)發(fā)組；多因素Logistic 逐步回歸分析結(jié)果顯示，臨床分期Ⅲ期、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、宮頸癌組織LncRNA PCGEM1、miR-642a-5p 表達均為影響HPV 陽性宮頸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的危險因素。分析原因可能為，臨床分期與惡性腫瘤的進展密切相關(guān)，可直接影響患者的預(yù)后，臨床分期越晚術(shù)后復(fù)發(fā)的發(fā)生風(fēng)險也就越大；存在盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，可在一定程度上增加腫瘤的負荷，故復(fù)發(fā)的危險相對較高[17]；LncRNA PCGEM1 表達與多種惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)，其高表達可促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展，有關(guān)報道[18-19]指出，LncRNA PCGEM1可通過RhoA 通路誘導(dǎo)卵巢癌腫瘤的發(fā)生、發(fā)展；LncRNA 和miR-642a-5p 均與惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)，且兩者存在一定的聯(lián)系，miR-642a-5p 表達降低時，可減少對LncRNA 的抑制作用，可促進腫瘤細胞的增殖、遷移等，進而有可能增加術(shù)后復(fù)發(fā)的發(fā)生風(fēng)險[20]。故在臨床中應(yīng)對以上影響HPV 陽性宮頸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的危險因素進行調(diào)控，以降低該類患者術(shù)后的復(fù)發(fā)率。

ROC 曲線分析結(jié)果顯示，宮頸癌組織LncRNA PCGEM1、miR-642a-5p 表達及兩者聯(lián)合預(yù)測HPV陽性宮頸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的敏感性分別為75.00%、78.57%和75.00%，特異性分別為78.21%、73.08%和96.15%，AUC 分別為0.724、0.796 和0.856，提示宮頸癌組織LncRNA PCGEM1、miR-642a-5p 表達與HPV 陽性宮頸癌患者根治術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)，且兩者聯(lián)合對宮頸癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測效能較高。分析其可能機制為：LncRNA PCGEM1 可通調(diào)控性激素受體表達，進而參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，可在一定程度上影響該類患者的預(yù)后。王勁等[21]研究報道，LncRNA PCGEM1 在結(jié)腸癌細胞中呈高表達，但其具體作用機制目前尚不清楚。miRNA 在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，可調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生相關(guān)過程（如細胞周期、炎癥、分化、凋亡及侵襲等），低表達miR-642a-5p 可通過調(diào)控下游細胞蛋白因子的表達，促進癌細胞的增殖、侵襲[22]，進而可影響HPV 陽性宮頸癌患者根治術(shù)后復(fù)發(fā)。

綜上所述，宮頸癌組織LncRNA PCGEM1、miR-642a-5p 表達與HPV 陽性宮頸癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)，且兩者聯(lián)合對宮頸癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測效能較高。建議在臨床中可通過檢測宮頸癌組織LncRNA PCGEM1、miR-642a-5p 表達對該類患者的預(yù)后進行評估，以更好地指導(dǎo)臨床制訂周密的治療防治及預(yù)后措施。