IL-18BP 對創(chuàng)傷性顱腦損傷大鼠焦慮樣行為的改善作用及其機制

李妍 齊曼曼 繳寶杰 李春雷 王春雷 常玉林

血腦屏障受損、灌注不足、炎癥因子釋放等原因均會造成創(chuàng)傷性顱腦損傷（TBI）患者預后不佳，存活患者相關神經功能的恢復是目前的治療難題［1］。研究顯示TBI 或不全腦缺血再灌注損傷后的大鼠會出現長期且嚴重的情緒障礙如焦慮、抑郁等［2-3］。IL-18 是IFN-γ 誘導因子，是一種多效性輔助性T 細胞1 型促炎因子［4］。大腦對IL-18 信號尤為敏感，因為中樞神經系統(tǒng)中多種類型的神經細胞表達IL-18 的受體，參與調節(jié)TBI 后的神經細胞焦亡［5-6］。IL-18 結合蛋白（IL-18BP）是IL-18 的天然抑制劑，在正常情況下，足夠的IL-18BP 使游離IL-18 保持低水平狀態(tài)［7］。但在某些炎癥性疾病中，IL-18 過量產生和釋放使IL-18 與IL-18BP 之間的平衡被破壞，導致病理性炎癥的發(fā)生［8］。但是IL-18BP 對TBI 后神經功能恢復的影響以及相關機制至今尚無定論。因此，本研究擬探究IL-18BP 在TBI 大鼠焦慮樣行為中的作用及機制，揭示TBI 對神經系統(tǒng)損傷的潛在機制和治療靶點，為臨床治療提供科學依據。

材料與方法

一、材 料

1.實驗動物

本研究實驗動物為7～8 周齡、體重250～300 g的清潔級雄性SD 大鼠72 只（遼寧長生生物技術股份有限公司）。本實驗均按照本院動物護理與使用委員會的標準進行。本研究經本院動物評審委員會批準［倫理批準文號：2021-072-02（z）］。

2.主要試劑

神經元核抗原抗體（NeuN）鼠抗單克隆抗體（英國Abcam 公司）、膠質纖維酸性蛋白（GFAP）鼠抗單克隆抗體（上海碧云天生物技術有限公司）、NOD 樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）兔抗多克隆抗體（北京索萊寶科技有限公司）、IL-18 兔抗多克隆抗體（上海碧云天生物技術有限公司）、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（cl-Caspase-1）兔抗多克隆抗體（英國Abcam公司）、消皮素D（GSDMD）兔抗多克隆抗體（美國Cell Singnaling 公司）、大鼠IL-18 ELISA 試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）。

二、方 法

1.動物分組及干預方法

將72 只大鼠按照隨機數字表法分為3 組各24只：假手術組（Sham 組）、TBI 組、TBI+IL-18BP組。TBI+IL-18BP 組大鼠在TBI 后即刻經鼠尾靜脈注射IL-18BP 1.5 mg/kg（溶于雙蒸水，批號：HYP7211，美國MCE 生物科技公司）。

2. TBI 模型建立

將大鼠麻醉后固定于裝有加溫裝置的操作臺上，將大鼠頭固定于腦立體定位儀（上海玉研科學儀器有限公司）上，頭顱皮膚消毒后，沿正中切開皮膚，剝離骨膜，暴露右頂骨。用牙科鉆在前囟點（雙眼連線與雙耳連線前1/3）后3.5 mm，中線右側2.5 mm 處鉆一直徑為6 mm 的骨窗，用20 g 砝碼于25 cm 高度墜落致大鼠TBI。TBI 組與TBI+IL-18BP 組按上述操作，Sham 組只開骨窗，不予砝碼打擊即進行縫合。

3.行為學檢測

3.1 曠場實驗

每組抽取12 只大鼠于模型制備后第30 日進行曠場實驗。將黑色正方形敞箱（60 cm× 60 cm×40 cm）分割成16 個相等的方格。實驗時將大鼠從敞箱的同一位置輕柔地放于箱內，適應1 min。記錄大鼠5 min 內的運動距離、中央區(qū)進入次數及中央區(qū)滯留時間。

3.2 高架十字迷宮檢測

大鼠在曠場實驗結束后休息2 h 再進行高架十字迷宮檢測，十字迷宮由2 個閉合臂（50 cm×10 cm×40 cm）和2 個同樣大小的開放臂組成，彼此夾角90°。記錄大鼠被放入高架十字迷宮5 min內的運動軌跡。統(tǒng)計每只大鼠在迷宮中運動總距離、開放臂進入次數百分比以及滯留時間百分比。開放臂進入次數百分比=開放臂進入次數/（開放臂進入次數+閉合臂進入次數）；開放臂滯留時間百分比=開放臂滯留時間/（開放臂滯留時間+閉合臂滯留時間）。

4. ELISA 檢測

模型制備后第30 日，檢測大鼠血清和腦脊液中IL-18 濃度，參照IL-18 ELISA 試劑盒（批號：EK0592，武漢博士德生物工程有限公司）說明書進行操作。

5.免疫熒光檢測

每組抽取6 只大鼠，于取血結束后取其腦組織，固定48 h 后制作石蠟切片。石蠟切片經過脫蠟、水化、抗原修復后封閉。在切片上滴加一抗NeuN（1∶200）、GFAP（1∶200）、NLRP3（1∶200）、IL-18（1∶200），切片至于4℃黑盒內過夜。次日，切片用磷酸鹽緩沖液洗滌。滴加Cy3 標記山羊抗鼠IgG （1∶500）和FITC 標記山羊抗兔IgG （1∶500）并于37℃孵育1 h。滴加一滴4,6-二脒基-2-苯基吲哚染液5 min，雙盲法熒光顯微鏡下觀察，每張切片觀察5 個視野，計算GFAP 和NeuN 的陽性細胞數，NLRP3/GFAP、IL-18/GFAP 雙陽性細胞百分比即星形膠質細胞焦亡的情況。

6.蛋白免疫印跡法檢測

每組抽取6 只大鼠，于取血結束后取下其杏仁核區(qū)。用蛋白印跡及IP 細胞裂解液提取杏仁核區(qū)的細胞總蛋白，用BCA 法測蛋白濃度。每泳道上樣30 μg 蛋白，分別用12%（cl-Caspase-1、N-GSDMD） 和8%（NLRP3） 的SDS- 聚 丙 烯酰胺凝膠恒流電泳，恒壓轉膜至聚偏二氟乙烯（PVDF） 膜 上。 加 入NLRP3（1∶1000）、cl-Caspase-1（1∶1000）、N-GSDMD（1∶1000）一 抗4℃孵育PVDF 膜過夜。次日，TBST 洗膜后加入山羊抗兔IgG 二抗（1∶1000）25℃孵育1 h。ECL 發(fā)光。應用Image-Pro Plus 6.0 分析各條帶的灰度值，以GAPDH 作為內參。目的蛋白與內參的灰度比值為目標蛋白的相對表達量。

三、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0 和GraphPad Prism 9.0 處理數據，實驗數據均符合正態(tài)分布，以表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P ＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、IL-18BP 對TBI 大鼠焦慮樣行為的影響

曠場實驗顯示，與Sham 組相比，TBI 組、TBI+IL-18BP 組大鼠中央區(qū)進入次數與中央區(qū)活動時間均減少（P 均＜ 0. 05）。與TBI 組相比，TBI+IL-18BP 組大鼠中央區(qū)進入次數與中央區(qū)活動時間均增加（P 均＜ 0.05）。見表1。

表1 大鼠術后第30 日曠場實驗結果（x±s）

高架十字迷宮實驗顯示，與Sham 組比較，TBI組、TBI+IL-18BP 組大鼠開放臂進入次數百分比與開放臂運動時間百分比均減少（P 均＜ 0. 05）。與TBI 組相比，TBI+IL-18BP 組大鼠開放臂進入次數百分比與時間百分比均增加（P 均＜ 0. 05）。見表2。

表2 大鼠術后第30 日高架十字迷宮結果（x±s）

二、大鼠杏仁核區(qū)神經元、星形膠質細胞數量變化

3 組大鼠TBI 后杏仁核區(qū)神經元的數量無明顯差異（F = 0.230，P = 0.950），但星形膠質細胞的激活（GFAP 陽性）差異有統(tǒng)計學意義（F =285.000，P ＜ 0.001）。 與Sham 組 相 比，TBI 組、TBI+IL-18BP 組大鼠星形膠質細胞的激活數量增加；與TBI 組相比，TBI+IL-18BP 組大鼠的星形膠質細胞激活數量減少（P 均＜ 0. 05）。見圖1～2。

圖1 大鼠術后第30 日杏仁核區(qū)神經元與活化的星形膠質細胞（免疫熒光染色）

三、大鼠血清、腦脊液中IL-18 的濃度

與Sham 組大鼠相比，TBI 組、TBI+IL-18BP組大鼠血清和腦脊液中IL-18 的濃度升高；與TBI組大鼠相比，TBI+IL-18BP 組大鼠的IL-18 濃度降低（P 均＜ 0. 05）。見表3。

表3 大鼠術后第30 日血清和腦脊液中的IL-18 濃度（x±s） 單位：ng/mL

四、大鼠杏仁核區(qū)NLRP3/GFAP、IL-18/GFAP雙陽性星形膠質細胞百分比

與Sham 組大鼠相比，TBI 組、TBI+IL-18BP組大鼠杏仁核區(qū)NLRP3/GFAP 和IL-18/GFAP 雙陽性星形膠質細胞數量均增加；與TBI 組相比，TBI+IL-18BP 組大鼠杏仁核區(qū)雙陽性星形膠質細胞數量減少（P 均＜ 0.05）。見圖3～4。

圖3 大鼠術后第30 日杏仁核區(qū)NLRP3/GFAP、IL-18/GFAP 雙陽性星形膠質細胞（免疫熒光染色）

五、杏仁核區(qū)焦亡相關指標的變化

3 組大鼠術后第30 日杏仁核區(qū)NLRP3、cl-Caspase-1、GSDMD 的表達量差異均具統(tǒng)計學意義（F 分 別 為1195.000、265.700、613.500，P 均＜0.050）。與Sham 組相比，TBI 組、TBI+IL-18BP 組杏 仁 核 區(qū)NLRP3、cl-Caspase-1、N-GSDMD 的 表達均上調；與TBI 組相比，TBI+IL-18BP 組杏仁核區(qū)NLRP3、cl-Caspase-1、GSDMD 的表達均下調（P 均＜ 0.05）。見圖5。

圖5 大鼠術后第30 日杏仁核區(qū)NLRP3、cl-Caspase-1、N-GSDMD 的相對表達量

討 論

圖2 大鼠術后第30 日杏仁核區(qū)神經元與星形膠質細胞數目統(tǒng)計圖

TBI 是世界范圍內致殘與致死的主要原因之一，給全球公共衛(wèi)生帶來了巨大的威脅，給社會造成了沉重的經濟負擔［9］。TBI 會導致長期的情緒紊亂，如抑郁和焦慮［10］。本研究結果顯示大鼠TBI后出現焦慮樣行為，與既往研究結果一致。

圖4 大鼠術后第30 日杏仁核區(qū)NLRP3、IL-18 陽性星形膠質細胞比例統(tǒng)計圖

TBI 后損傷相關分子模式（DAMP）等內源性介質在局部和全身釋放，被先天免疫系統(tǒng)識別后可激活NLRP3，隨后NLRP3 通過N 端的PYD 結構域募集前Caspase-1 分子，前Caspase-1 二聚體自我蛋白酶解，形成p10 或p20 片段的裂解碎片，激活前炎癥因子IL-1β 和IL-18，也可通過激活GSDMD 來誘發(fā)細胞焦亡［11-13］。細胞 焦 亡與TBI 的神經功能恢復有著緊密的關系［14-15］。本研究中TBI大鼠杏仁核區(qū)NLRP3、cl-Caspase-1、N-GSDMD 表達均上調，與既往研究結果一致。杏仁核是一種邊緣大腦結構，對情緒調控、學習記憶能力至關重要［16］。既往有研究證實TBI 后星形膠質細胞激活明顯增多［17-18］。本研究中TBI 大鼠杏仁核區(qū)星形膠質細胞激活增多，星形膠質細胞內NLRP3 與IL-18表達上調，提示TBI 可誘發(fā)杏仁核區(qū)星形膠質細胞焦亡，此病理改變可能與大鼠的焦慮樣行為相關。

有研究報道IL-18 參與調節(jié)TBI 后大腦神經細胞焦亡［7］。本研究中TBI 大鼠血清和腦脊液中IL-18 濃度上調，IL-18 陽性的星形膠質細胞表達亦上調。IL-18BP 為IL-18 特異性抑制劑，可減輕失血性休克小鼠的焦慮樣行為［19］。本研究中TBI大鼠注射IL-18BP 后焦慮樣行為改善，且IL-18BP減少了TBI 大鼠杏仁核區(qū)星形膠質細胞的激活，NLRP3、IL-18 陽性的星形膠質細胞數量減少，杏仁核區(qū)焦亡相關蛋白的表達也下調。

本研究的不足之處：只驗證了杏仁核區(qū)的變化，對于情緒控制相關的其他腦區(qū)如腹內側前額葉皮質、邊緣系統(tǒng)中邊緣皮層內的海馬和扣帶回、伏隔核等均未進行研究；在TBI 后誘發(fā)的炎性反應中只關注了星形膠質細胞的變化，缺少小膠質細胞、少突膠質細胞變化的研究。本研究團隊將在下一步實驗中進一步觀察。

綜上所述，IL-18BP 能一定程度減輕TBI 大鼠的焦慮樣行為，可能與減輕星形膠質細胞的焦亡密切相關。