基于指紋圖譜與多指標(biāo)含量測定的黔產(chǎn)香榧假種皮質(zhì)量控制研究

田 鑫，張 艷，余 明，曹泮相，張建永，段燦燦

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院藥物分析教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099；3.貴州務(wù)川萬年峰農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，貴州 遵義 564300)

香榧(TorreyagrandisFort.)，為中國原產(chǎn)樹種、國家二級保護(hù)植物，主產(chǎn)于江蘇南部、浙江等地，安徽、貴州也有引種。香榧假種皮為香榧種子殼外包被的肉質(zhì)組織，暫未被2020版《中國藥典》收錄。假種皮是香榧的重要非藥用部位，具有產(chǎn)量大、易獲得等特點(diǎn)，然而目前市場多將其丟棄?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)香榧假種皮的化學(xué)成分復(fù)雜，主要包括黃酮類[1-2]、木脂素類[3]、萜類和揮發(fā)油[4]、脂肪[5-6]等類型[7-8]。香榧假種皮具有抗菌[9]、驅(qū)蟲[10]、抗病毒及抗腫瘤[11-12]等多種藥理作用。目前關(guān)于假種皮的研究多集中于揮發(fā)油，且開發(fā)了相關(guān)日化產(chǎn)品，如香榧面膜、香榧精油皂和香榧洗發(fā)水等。關(guān)于其質(zhì)量控制項(xiàng)的研究較少，未能體現(xiàn)其品質(zhì)，影響了對假種皮的進(jìn)一步開發(fā)利用。

中藥指紋圖譜可以從多角度展現(xiàn)中藥多種成分的特征和質(zhì)量變化情況，對中藥的種屬、真?zhèn)魏蛢?yōu)劣進(jìn)行直觀鑒定，具有整體性和模糊性的特點(diǎn)，能夠?qū)χ兴幍囊恢滦院头€(wěn)定性給予科學(xué)評價(jià)[13]。中藥成分類型復(fù)雜多樣，僅用單一指標(biāo)性成分控制中藥質(zhì)量的方法明顯無法充分表明中藥整體質(zhì)量信息，也無法反映中藥有效性和安全性情況[14]。只有將中藥指紋圖譜技術(shù)和多指標(biāo)含量測定方法相結(jié)合，才能夠?yàn)橹兴幍钠焚|(zhì)保障提供有效手段。

貴州省目前引種香榧樹的面積已達(dá)到5.1萬畝，主要分布在遵義市，香榧的種子作為主要產(chǎn)品初步形成了產(chǎn)業(yè)鏈，而假種皮的利用相對不足，阻礙了對香榧資源的進(jìn)一步開發(fā)。因此，本研究擬建立黔產(chǎn)香榧假種皮高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜及多指標(biāo)含量測定方法，為黔產(chǎn)香榧假種皮的質(zhì)量控制和開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；超聲波清洗器(寧波新藝超聲設(shè)備有限公司)；沃特浦超純水設(shè)備(四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司)；十萬分之一電子天平、電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試劑 甲醇(色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，甲醇(分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司)，乙酸(色譜純，賽默飛世爾科技公司)，對照品苯甲酸(分析純，純度≥98%，批號3875，上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司)，異鼠李素(分析純，純度≥98%，批號AF20111816，成都埃法生物科技有限公司)，芹菜素(分析純，純度≥98%，批號AF9032008，成都普思生物科技股份有限公司)，金松雙黃酮(分析純，純度≥98%，批號DSTDJ005201，德思特生物技術(shù)有限公司)，異銀杏素(分析純，純度≥98%，批號DST200424-191，德思特生物技術(shù)有限公司)。

1.3 樣品信息 18批香榧假種皮采自貴州省遵義市務(wù)川縣石朝鄉(xiāng)，經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室張建永教授鑒定為紅豆杉科榧樹屬榧樹TorreyagrandisFort.的假種皮，具體樣品信息見表1。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC色譜條件 色譜柱為：Agilent Eclipse Plus C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相為：甲醇(A)-0.06%醋酸-水溶液(B)；采用梯度洗脫，具體洗脫程序如表2；檢測波長為：270 nm；流速為：1.0 mL/min；柱溫為：30 ℃；進(jìn)樣量為：5 μL。

表2 HPLC梯度洗脫表

2.2 HPLC指紋圖譜研究

2.2.1 供試品溶液的制備 香榧假種皮干燥后粉碎，稱取香榧假種皮粉末1.0 g于錐形瓶中，加入15 mL甲醇，用電子天平稱重后，搖勻，超聲60 min，冷卻至室溫，再次稱重，以甲醇補(bǔ)足損失的重量，搖勻后過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，備用。

2.2.2 黔產(chǎn)香榧假種皮指紋圖譜的方法學(xué)考察

(1)儀器精密度的試驗(yàn)：取香榧假種皮供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣6次，記錄18個(gè)共有峰的保留時(shí)間和峰面積，并分別計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值，考察色譜峰相似度的一致性。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(2012版本)，進(jìn)行相似度評價(jià)。結(jié)果顯示，6次測定的18個(gè)共有峰保留時(shí)間的RSD值不超過0.76%，各色譜峰的共有峰面積RSD值不超過3.40%，相似度為1.000，儀器的精密度良好。

(2)重復(fù)性的試驗(yàn)：稱取6份香榧假種皮粉末，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣分析，記錄18個(gè)共有峰的保留時(shí)間和峰面積，并分別計(jì)算它們間的 RSD 值，考察色譜峰相似度的一致性。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)，進(jìn)行相似度評價(jià)。結(jié)果顯示，6次測定的18個(gè)共有峰保留時(shí)間的RSD值不超過0.22%，各色譜峰的峰面積RSD值不超過2.51%，相似度達(dá)到1.000，方法重復(fù)性良好。

(3)穩(wěn)定性試驗(yàn)：取一份香榧假種皮粉末按“2.2.1”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，分別在0、4、8、12、16、20、24 h連續(xù)進(jìn)樣7次，記錄18個(gè)主要共有峰的保留時(shí)間和峰面積，并分別計(jì)算RSD 值，考察色譜峰相似度的一致性。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)，進(jìn)行相似度評價(jià)。結(jié)果顯示，18個(gè)共有峰保留時(shí)間的RSD值不超過0.30%，各色譜峰的峰面積RSD值不超過2.49%，相似度達(dá)到1.000，表明香榧假種皮樣品在24 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.2.3 黔產(chǎn)香榧假種皮樣品HPLC指紋圖譜的建立 取不同批次黔產(chǎn)香榧假種皮粉末，按上述方法制備供試品溶液，在色譜條件下進(jìn)樣分析。共選出了18個(gè)共有峰(18個(gè)共有峰的峰面積之和大于總峰面積的93.25%)，將S1作為對照圖譜，時(shí)間窗寬度是0.1，最終得到18批黔產(chǎn)香榧假種皮樣品重疊的HPLC指紋圖譜，如圖1～2。

峰4：芹菜素；峰15：金松雙黃酮。

圖2 18批黔產(chǎn)香榧假種皮樣品的HPLC指紋圖譜

2.2.4 黔產(chǎn)香榧假種皮樣品HPLC指紋圖譜相似度評價(jià) 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(2012版本)，用中位數(shù)矢量法計(jì)算18批黔產(chǎn)香榧假種皮的指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度，計(jì)算得到18批香榧假種皮相似度為0.995～1.000，結(jié)果見表3，顯示相似度良好。

表3 18批黔產(chǎn)香榧假種皮樣品指紋圖譜相似度的結(jié)果

2.3 香榧假種皮中5種化學(xué)成分的含量測定 采用HPLC-DAD對各對照品與香榧假種皮供試品溶液進(jìn)行全波長掃描，并對它們的色譜圖進(jìn)行比對后，定性了黔產(chǎn)香榧假種皮中可能存在苯甲酸、異鼠李素、芹菜素、金松雙黃酮和異銀杏素，本部分對黔產(chǎn)香榧假種皮中的這5種成分進(jìn)行定量分析。

2.3.1 溶液的配制 單一對照品溶液的配制：分別準(zhǔn)確稱取適量苯甲酸、異鼠李素、芹菜素、金松雙黃酮、異銀杏素于5個(gè)25 mL的容量瓶中，用甲醇定容，充分振搖，得到單一對照品貯備液，其濃度分別是0.169、0.764、0.246、0.088、0.142 mg/mL，過0.22 μm微孔濾膜，備用。

混合對照品溶液①的配制：取5個(gè)單一對照品溶液各2.0 mL于試管中，揮干溶劑，加入2.0 mL甲醇復(fù)溶，振蕩搖勻，即得混合對照品溶液①，過0.22 μm微孔濾膜，備用。

混合對照品溶液②的配制：取5個(gè)單一對照品溶液各1.0 mL于5 mL容量瓶中，混合搖勻，即得對照品溶液②，過0.22 μm微孔濾膜，備用。

供試品溶液的配制：同“2.2.1”項(xiàng)下方法。

2.3.2 色譜條件 檢測波長：230、255、270、330 nm，其余條件同“2.1”項(xiàng)下內(nèi)容。

2.3.3 專屬性的考察 分別將空白溶劑(甲醇)、苯甲酸對照品溶液、異鼠李素對照品溶液、芹菜素對照品溶液、金松雙黃酮對照品溶液、異銀杏素對照品溶液、供試品溶液按色譜條件進(jìn)樣測定。由圖3～6可知，香榧假種皮供試品溶液所測成分苯甲酸(230 nm、12.534 min)、異鼠李素(255 nm、20.109 min)、芹菜素(270 nm、20.097 min)、金松雙黃酮(270 nm、43.059 min)、異銀杏素(330 nm、36.915 min)色譜峰的保留時(shí)間和對照品溶液中測定的各成分保留時(shí)間相一致，溶劑和其他成分對測定均無干擾?？梢妼傩粤己谩?/p>

A：空白溶劑(甲醇)；B：苯甲酸；C：供試品溶液；1：苯甲酸;波長230 nm。

A：空白溶劑(甲醇)；B：異鼠李素；C：供試品溶液；2：異鼠李素;波長255 nm。

A：空白溶劑(甲醇)；B：芹菜素；C：金松雙黃酮；D：供試品溶液；3：芹菜素；4：金松雙黃酮;波長270 nm。

A：空白溶劑(甲醇)；B：異銀杏素；C：供試品溶液；5：異銀杏素;波長330 nm。

2.3.4 線性關(guān)系考察 將混合對照品溶液①按一定比例稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。用濃度作為橫坐標(biāo)(X)，峰面積作為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，并計(jì)算回歸方程和線性范圍等，結(jié)果如表4，表明苯甲酸、異鼠李素、芹菜素、金松雙黃酮、異銀杏素的對照品溶液在各自濃度范圍里有良好的線性關(guān)系，(S/N>10)。

表4 5種對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.5 精密度的考察 把混合對照品溶液②在上述色譜條件進(jìn)樣6次，記錄5種對照品的峰面積，分別計(jì)算它們的保留時(shí)間和峰面積的RSD值。結(jié)果苯甲酸、異鼠李素、芹菜素、金松雙黃酮和異銀杏素保留時(shí)間的RSD值分別為0.11%、0.31%、0.19%、0.13%、0.18%；峰面積的RSD值分別為0.67%、0.87%、0.60%、0.42%、0.74%。從結(jié)果可以看出儀器的精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性的考察 稱取同一批次的黔產(chǎn)香榧假種皮粉末，按“2.2.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，分別在0、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣，記錄5個(gè)對照品的峰面積，分別計(jì)算它們的保留時(shí)間和峰面積的RSD值。結(jié)果苯甲酸、異鼠李素、芹菜素、金松雙黃酮和異銀杏素保留時(shí)間的RSD值分別為0.12%、0.07%、0.15%、0.11%、0.08%；峰面積的RSD值分別為2.44%、2.93%、2.33%、2.49%、2.58%，可見香榧假種皮供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 重復(fù)性的考察 稱取6份同一批次的黔產(chǎn)香榧假種皮粉末，按上述方法制備供試品溶液，在色譜條件下進(jìn)樣，分別計(jì)算各色譜峰的保留時(shí)間和峰面積的RSD值。結(jié)果苯甲酸、異鼠李素、芹菜素、金松雙黃酮、異銀杏素保留時(shí)間的RSD值分別為0.09%、0.11%、0.09%、0.06%、0.08%；含量的RSD值分別為3.49%、1.87%、1.88%、1.82%、3.24%，從結(jié)果可以看出該方法的重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收率的試驗(yàn) 稱取9份已知含量的黔產(chǎn)香榧假種皮粉末，每份為0.5 g，依次按照80%、100%、120%的比例分別精密加入對應(yīng)體積的5種單一對照品溶液，按上述方法制備供試品溶液，在色譜條件下進(jìn)樣，記錄每種成分的峰面積，計(jì)算加樣回收率。加樣回收率=(實(shí)測質(zhì)量-樣品所含被測成分的質(zhì)量)/加入對照品質(zhì)量×100%。結(jié)果見表5，苯甲酸、異鼠李素、芹菜素、金松雙黃酮和異銀杏素的平均回收率在96.98%～101.08%，符合95%～105%的范圍、RSD≤1.57%，符合要求，可知該方法的加樣回收率良好。

表5 黔產(chǎn)香榧假種皮中5種化學(xué)成分加樣回收率的結(jié)果

續(xù)表

2.3.9 18批黔產(chǎn)香榧假種皮樣品中5種成分的含量測定結(jié)果 取18批黔產(chǎn)香榧假種皮樣品，依照上述方法制備供試品溶液，按色譜條件逐個(gè)進(jìn)樣，分別將苯甲酸、異鼠李素、芹菜素、金松雙黃酮和異銀杏素的峰面積代入線性回歸方程，計(jì)算其含量，結(jié)果見表6。其中，苯甲酸、異鼠李素、芹菜素、金松雙黃酮和異銀杏素含量最高的分別為S8(貴州省遵義市務(wù)川縣石朝鄉(xiāng)浪水村)、S18(貴州省遵義市務(wù)川縣石朝鄉(xiāng)沙坂村)、S6(貴州省遵義市務(wù)川縣石朝鄉(xiāng)浪水村)、S17(貴州省遵義市務(wù)川縣石朝鄉(xiāng)沙坂村)和S17，該5種化學(xué)成分總含量最高的為S18(貴州省遵義市務(wù)川縣石朝鄉(xiāng)沙坂村)。

表6 18批香榧假種皮中五類成分含量

2.3.10 聚類分析 采用Simca-P 14.1軟件，將共有峰的峰面積作為變量，進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果如圖7。18批香榧假種皮樣品被分為2類：Ⅰ類包括S16～S18號樣品，均在貴州省遵義市沙坂村采集；Ⅱ類包括S1～S15號樣品，此類樣品均在貴州省遵義市大漆村、浪水村、京竹村和高峰村采集。Ⅰ類和Ⅱ類樣品表明不同村子之間的樣品存在一定差異。

圖7 2 類樣品聚類分析結(jié)果

3 討論

3.1 方法的建立

3.1.1 HPLC色譜柱以及流動相的考察 本研究考察的色譜柱類型有：Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)和Agilent Eclipse XDB C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)的柱效更優(yōu)。并且考察了不同流動相體系：水-甲醇、水-乙腈、醋酸水-甲醇和醋酸水-乙腈等，結(jié)果顯示，采用0.06%醋酸水-甲醇流動相的體系時(shí)，色譜峰保留時(shí)間更佳，特征峰的分離度符合范圍，色譜圖的基線較平穩(wěn)，色譜峰有較好的對稱性。

3.1.2 檢測波長的選擇 采用HPLC-DAD對各對照品以及香榧假種皮供試品溶液進(jìn)行全波長掃描，苯甲酸、異鼠李素、芹菜素、金松雙黃酮和異銀杏素的紫外最大吸收波長分別在230 nm、255 nm與370 nm、270 nm與340 nm、270 nm與330 nm、270 nm與330 nm。結(jié)合香榧假種皮供試品溶液各個(gè)波長的色譜圖分析，最終分別以230 nm作為苯甲酸的檢測波長，以255 nm作為異鼠李素的檢測波長，以270 nm作為芹菜素、金松雙黃酮的檢測波長，以330 nm作為異銀杏素的檢測波長。

3.1.3 香榧假種皮樣品處理方法的考察 保持其他條件不變的前提下，本實(shí)驗(yàn)考察了40%、70%、100%甲醇提取香榧假種皮，根據(jù)5個(gè)對照品對應(yīng)峰的峰形和峰面積選擇最優(yōu)提取溶劑百分比。再以100%乙醇同法操作，測定結(jié)果與100%甲醇比較，結(jié)果顯示以100%甲醇作為提取溶劑時(shí)，香榧假種皮供試品溶液的峰形較好，5個(gè)對照品對應(yīng)的峰總面積最大。

保持其他條件不變的前提下，實(shí)驗(yàn)考察了超聲30、60、90 min后的香榧假種皮提取情況。發(fā)現(xiàn)提取90 min時(shí)，香榧假種皮中5個(gè)對照品對應(yīng)的峰總面積僅略微高于提取60 min時(shí)的峰總面積，從節(jié)能減排方面考慮，選擇提取60 min。

保持其他條件不變的前提下，實(shí)驗(yàn)中分別考察了以超聲、冷浸、水浴回流60 min后對香榧假種皮的提取情況。發(fā)現(xiàn)超聲提取時(shí)香榧假種皮的5個(gè)對照品峰總面積最大。因此，本研究選擇超聲方法提取香榧假種皮。

保持其他條件不變的前提下，實(shí)驗(yàn)中考察了料液比1∶10、1∶15、1∶20時(shí)的香榧假種皮提取情況。發(fā)現(xiàn)料液比1∶15時(shí)香榧假種皮的5個(gè)對照品總含量最高，因此選擇料液比1∶15。

香榧假種皮樣品處理方法最終篩選結(jié)果為：以100%甲醇提取香榧假種皮，料液比為1∶15，超聲60 min。

3.2 香榧假種皮質(zhì)量分析 本實(shí)驗(yàn)的18批香榧假種皮樣品采自貴州省遵義市務(wù)川縣石朝鄉(xiāng)的5個(gè)不同村子，樣品批次多，具有一定的代表性。測定結(jié)果表明，18批不同村子香榧假種皮指紋圖譜與對照指紋圖譜相似度為0.995～1.000，相似度均較高，表明引種后，貴州省遵義市務(wù)川縣石朝鄉(xiāng)樣品之間的指紋圖譜具有較好的一致性。18批香榧假種皮的苯甲酸、異鼠李素、芹菜素、金松雙黃酮和異銀杏素含量分別為(56.49～110.91、183.14～418.64、69.81～104.91、105.59～197.17、270.36～400.22)μg/g，5種成分總含量平均值為884.85 μg/g，總含量最高的為沙坂村的S18(1127.14 μg/g)，總含量最低的為浪水村的S5(754.71 μg/g)，采自沙坂村的S16～S18總含量排在前三位。說明不同村子香榧假種皮5種成分含量有所差異，差異原因有待進(jìn)一步研究，有望為黔產(chǎn)香榧栽培提供理論指導(dǎo)。

綜上所述，本研究首次建立了黔產(chǎn)香榧假種皮的指紋圖譜；首次建立同時(shí)測定香榧假種皮中的苯甲酸、異鼠李素、芹菜素、金松雙黃酮和異銀杏素5種化學(xué)成分含量的HPLC分析方法，為黔產(chǎn)香榧假種皮資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)，更多具有藥理活性的化學(xué)成分有待后續(xù)進(jìn)一步研究。