miR-183-5p/mTOR 信號軸介導有氧糖酵解促進胃癌細胞增殖

王溪，馮利，楊文淵，盧洪勝，姜知財，黃桔秀

1.臺州市中心醫(yī)院（臺州學院附屬醫(yī)院）全科醫(yī)學科，浙江臺州 318000；2.浙江省臺州醫(yī)院內分泌科，浙江臺州 318000；3.臺州市中心醫(yī)院（臺州學院附屬醫(yī)院）消化內科，浙江臺州 318000；4.浙江省椒江區(qū)白云街道社區(qū)衛(wèi)生服務中心全科醫(yī)學科，浙江臺州 318000

胃癌是一種常見的惡性腫瘤，目前其發(fā)病機制尚未被完全闡明，抑制腫瘤細胞增殖和促進腫瘤細胞凋亡是治療胃癌的重要方法。microRNA（miRNA）是細胞生長發(fā)育的重要調節(jié)因子，有報道稱miRNA對胃癌細胞的傳導有重要影響[1-2]。多項研究表明miR-183-5p 在肝癌[3]、結直腸癌[4]等癌細胞中表達上調。本研究旨在探討miR-183-5p 對胃癌細胞有氧糖酵解過程及細胞增殖的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與細胞

胃癌細胞株MGC-803 購自中國科學院上海細胞庫；胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基、轉染試劑盒購自Gibco；0.25%胰蛋白酶購自新賽美有限公司；RNA提取試劑盒購自翌圣生物科技有限公司；葡萄糖、乳酸、腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）檢測試劑盒購自賽默飛有限公司；一抗GLUT1（ab115730）、LDHA（ab52488），二抗山羊抗兔IgG H&L（HRP）（ab6721）購自abcam 公司。本研究經臺州市中心醫(yī)院倫理委員會批準（倫理審批號：2021L-06-18）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、轉染 胃癌細胞株MGC-803 采用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中，每天更換培養(yǎng)基。轉染：選取對數(shù)生長期的細胞，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，接種于6孔板中，嚴格按轉染試劑說明書進行轉染。

1.2.2 定量聚合酶鏈反應（quantitative polymerase chain reaction，q-PCR）檢測胃癌細胞中miR-183-5p的表達水平 總RNA 提?。菏褂肦NA 提取試劑盒提取細胞總 RNA（貨號：19221ES50），使用Nanodrop 儀器檢測RNA 濃度和純度。RNA 逆轉錄：以1μg 總RNA 為模板，按照miRNA 逆轉錄試劑盒（貨號：31028）說明書加入逆轉錄反應體系，在MyCycler Thermal CyclerPCR 擴增儀中逆轉錄。熒光定量PCR：LightCycler 480 實時熒光定量PCR儀進行DNA 擴增。

1.2.3 MGC-803細胞內葡萄糖、乳酸及ATP測定 取轉染成功后培養(yǎng)24h 的MGC-803 細胞上清液，按葡萄糖檢測試劑盒和乳酸檢測試劑盒說明書操作，使用酶標儀分別在505nm 和530nm 測定細胞上清液吸光度值[5]。取轉染成功后培養(yǎng)24h 的MGC-803 細胞，用細胞破碎儀將細胞制成勻漿，取細胞懸液，將底物和緩沖液混勻配制成檢測液，在細胞中加入檢測液混勻，使細胞充分裂解，使用可檢測化學發(fā)光的多功能酶標儀在636nm 處測定吸光度[6]。

1.2.4 WB 測定雷帕霉素機械靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，mTOR）和有氧糖酵解相關蛋白表達 取轉染48h 后的MGC-803 細胞，加入白裂解液（radio-immunoprecipitation assay，RIPA）提取細胞總蛋白。根據(jù)BCA 法將蛋白定量到相同濃度，加入等體積蛋白上樣緩沖液。100℃加熱10min 使蛋白變性，蛋白樣品保存于-80℃冰箱備用。按每孔30μg 蛋白樣品上樣，80V 條件下電泳、電壓100V 100min 條件下轉膜、使用5%脫脂奶進行封閉、孵一抗過夜、孵二抗后顯影和圖像分析。

1.2.5 MTT 法檢測MGC-803 細胞的增殖能力 將miR-183-5p和陰性對照轉染的MGC-803 細胞以每孔5000 個細胞接種于96 孔板中，分別于0h、24h、48h、72h 加入MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h 后，加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，dMSO）混勻，使用酶標儀于570nm 處測定吸光度值。

1.3 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 25.0 統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)（百分率）[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細胞轉染效果

與inhibitor NC 組（1.003±0.100）相比，miR-183-5p inhibitor 組細胞中的miR-183-5p 水平（0.310±0.020）顯著降低（P<0.001）；與 mimics NC 組（0.310±0.020）相比，miR-183-5p mimics 組細胞中的miR-183-5p（8.067±0.569）水平顯著升高（P<0.0001），說明轉染成功。

2.2 miR-183-5p 表達變化對MGC-803 細胞有氧糖酵解的影響

2.2.1 miR-183-5p 對MGC-803 細胞葡萄糖、乳酸、ATP 水平的影響 與inhibitor NC 對照組相比，抑制miR-183-5p 表達后MGC-803 胃癌細胞葡萄糖水平顯著升高（P<0.01），乳酸水平和ATP 水平顯著降低；與mimics NC 相比，過表達miR-183-5p 可使MGC-803 胃癌細胞葡萄糖顯著降低，乳酸和ATP 水平顯著升高，說明過表達miR-183-5p 可促進MGC-803 胃癌細胞對葡萄糖的消耗，生成更多的乳酸和ATP，見表1。

表1 miR-183-5P 表達變化對MGC-803 細胞葡萄糖、乳酸、ATP 水平的影響（）

表1 miR-183-5P 表達變化對MGC-803 細胞葡萄糖、乳酸、ATP 水平的影響（）

2.2.2 miR-183-5p 對MGC-803 細胞內糖酵解相關酶及蛋白的影響 抑制miR-183-5p 表達時，糖酵解關鍵酶LDHA及糖酵解關鍵蛋白GLUT1的蛋白相對表達量均明顯降低（P<0.01）。過表達miR-183-5p 使LDHA 和GLUT1 的蛋白表達顯著升高（P<0.01），以上結果表明miR-183-5p 參與MGC-803 胃癌細胞的糖酵解過程，可能通過調控LDHA和GLUT1蛋白表達，從而影響葡萄糖消耗及乳酸生成，見圖1。

圖1 轉染后胃癌細胞LDHA 和GLUT1 蛋白表達水平變化

2.3 miR-183-5p 對MGC-803 細胞mTOR 表達的影響

抑制miR-183-5p 表達時，mTOR mRNA 相對表達量顯著降低（P<0.001），過表達miR-183-5p 時，mTOR mRNA 相對表達量顯著升高（P<0.001），miR-183-5p可能通過激活mTOR 通路影響MGC-803胃癌細胞的發(fā)生、發(fā)展。

2.4 miR-183-5p 表達變化對MGC-803 細胞增殖的影響

24h 和48h 時，與inhibitor NC 組相比，miR-183-5p inhibitor 組胃癌細胞活力顯著降低（P<0.05）；與mimics NC 組相比，miR-183-5p mimics 組胃癌細胞活力顯著升高，以上結果說明過表達miR-183-5p 可促進MGC-803 胃癌細胞增殖，見圖2。

圖2 轉染后不同時間點胃癌細胞增殖情況

3 討論

有氧糖酵解被認為是細胞在缺氧條件下為滿足細胞能量需求而進行的一種特殊代謝形式。但現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞在有氧條件下也會啟動有氧糖酵解產生乳酸，而乳酸會反過來促進腫瘤細胞增殖[7-8]。GLUT1 表達升高可增加葡萄糖攝取代謝和糖酵解[9]，之前已有研究發(fā)現(xiàn)癌細胞通過PI3K/Akt/mTOR 通路促進GLUT1 質膜定位，從而促進有氧糖酵解[10]。多種糖酵解酶在癌癥中上調，并與不良預后相關。如乳酸脫氫酶A 在不同癌癥中過表達，而抑制LDHA 已被證明可影響腫瘤發(fā)生和腫瘤生長[11]。LDHA 是有氧糖酵解的限速酶，抑制LDHA 可減少乳酸的分泌，研究發(fā)現(xiàn)抑制LDHA 可通過一系列信號通路最終導致mTOR 激活，聯(lián)合使用LDHA 抑制劑和mTOR 抑制劑可影響黑色素瘤細胞增殖[12]。

miRNA 是一種非編碼RNA，現(xiàn)在越來越多的研究表明，miRNA 在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、凋亡、轉移和血管生成等過程中發(fā)揮調控作用[13]。作為miRNAs的一員，miR-183-5p 也被報道在結腸癌、肝癌和胃癌中表達升高，LI 等[14]發(fā)現(xiàn)miR-183-5p 可通過直接靶向PDCD4 從而調控胃癌細胞增殖。另一項生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，miR-183-5p 通過mTOR 通路參與胃癌的發(fā)生發(fā)展[15]。由于有氧糖酵解是癌細胞提供能量的主要方式[16]，本研究發(fā)現(xiàn)miR-183-5p 表達升高時，胃癌細胞葡萄糖消耗量增加，生成更多的乳酸和ATP。另一方面觀察到過表達miR-183-5p 使LDHA和GLUT1 的蛋白表達顯著升高。GLUT1 是位于細胞膜上的葡萄糖轉運體，其表達量升高可滿足癌細胞對能量的需求，從而達到快速生長增殖的目的[17]。丙酮酸在LDHA 的催化下轉換為乳酸，因此LDHA有利于維持糖酵解代謝。大量研究表明，LDHA 在胃癌、乳腺癌、肺癌、結腸癌及胰腺癌中高表達[16]。LDHA 和GLUT1 均是糖酵解過程中的關鍵蛋白，以上結果表明miR-183-5p 參與胃癌細胞的有氧糖酵解過程，促進癌細胞能量消耗。

mTOR 信號通路參與多種癌癥的調控[18]，是多種藥物的熱門治療靶點。本實驗中為驗證miR-183-5p 是否也通過mTOR 信號通路調節(jié)有氧糖酵解，使用Q-PCR 法檢測轉染后胃癌細胞中mTOR 表達情況，結果發(fā)現(xiàn)，與inhibitor NC 組相比，miR-183-5p inhibitor 組mTOR mRNA 表達水平顯著降低，而與mimics 組相比，miR-183-5p mimics 組mTOR mRNA表達水平顯著升高。通過MTT 實驗，發(fā)現(xiàn)miR-183-5p 高表達有利于胃癌細胞增殖，以上結果表明，在胃癌細胞中，miR-183-5p 可能通過靶向mTOR 信號通路促進有氧糖酵解。

綜上所述，miR-183-5p/mTOR 信號軸可能通過有氧糖酵解途徑促進胃癌細胞增殖，其機制可能是miR-183-5p 通過靶向mTOR 信號通路，促進有氧糖酵解關鍵酶GLUT1 和LDHA 表達，增加胃癌細胞對葡萄糖的攝取和消耗，生成更多的乳酸和ATP，滿足胃癌細胞快速生長增殖的需求。本研究為胃癌的治療提供新靶點，miR-183-5p 可能成為胃癌治療藥物的新靶標，通過抑制miR-183-5p 抑制胃癌細胞有氧糖酵解，從而達到抑制胃癌細胞增殖的目的。