HL-J6抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌基因轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究*

段 浩，劉婧怡，曹 宇，張珊珊，李海波，馬 雷

（1.佳木斯大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)與檢驗醫(yī)學(xué)系微生物與生化藥學(xué)教研室，重慶 400038；3.重慶市沙坪壩區(qū)陳家橋醫(yī)院檢驗科，重慶 400038；4.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154007）

金黃色葡萄球菌為葡萄串狀的革蘭陽性菌，敗血癥、膿毒血癥、壞死性筋膜炎等多種臨床疾病都可能由金黃色葡萄球菌感染所致[1］。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）是臨床常見的耐藥菌，其造成的感染已成為世界三大難治感染性疾病之一[2］。近年來，抗生素濫用導(dǎo)致其對金黃色葡萄球菌的療效逐漸變差，耐藥問題變得十分嚴重[3］。萬古霉素治療MRSA不僅會產(chǎn)生耐藥性，還會導(dǎo)致低血壓、中性粒細胞減少等不良反應(yīng)，劑量不足和治療時間延長還會升高最低抑菌濃度（MIC），從而導(dǎo)致療效欠佳或治療失敗等情況[4］，故常與利福平聯(lián)用，然而耐利福平金黃色葡萄球菌分離株出現(xiàn)的頻率逐年升高，有研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌對利福平產(chǎn)生耐藥性可能與rpoB基因的突變相關(guān)[5］。通過基因轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）技術(shù)可了解化合物作用于金黃色葡萄球菌后發(fā)生了相應(yīng)變化的基因，再通過基因本體論（GO）富集分析、京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析可了解其功能，從而揭示特定生物學(xué)過程及疾病發(fā)生過程的分子機理。與其他技術(shù)相比，RNA-seq有靈敏度高、高通量、高分辨率、成本相對較低等顯著優(yōu)勢[6］。近年來，新型吲哚苯醌類藥物HL-J6被認為具備高MRSA抑制性能。該藥物對MRSA有抗菌活性，具備一定的臨床應(yīng)用價值，有望為臨床防治MRSA提供新思路、新途徑。但其抗菌的具體機制尚未明晰。因此，本研究中采用RNA-seq技術(shù)對經(jīng)藥物處理和未經(jīng)處理MRSA菌株的基因轉(zhuǎn)錄組水平進行分析后，根據(jù)NCBI，UniProt等網(wǎng)站的功能注釋，對表達產(chǎn)生變化的基因進行研究，從而探討HL-J6抑制MRSA可能的機制?，F(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 儀器、試藥與菌株

儀器：HFSAFE-1500型生物安全柜（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）；ZWY-211C型恒溫培養(yǎng)振搖器（上海智城分析儀器制造有限公司）；CFX96 Touch型熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀（百樂科技有限公司）。

試藥：苯唑西林（北京索萊寶生物科技有限公司，批號為O8350）；頭孢唑林（上海吉至生化科技有限公司，批號為C29510）；氨芐西林（上海生工生物工程股份有限公司，批號為A610028-0025）；萬古霉素（上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司，批號為1404-93-9）；利奈唑胺（批號為L830356）、莫匹羅星（批號為M812891），均購自上海麥克林生化科技有限公司；HL-J6（四川大學(xué)華西藥學(xué)院何菱教授團隊合成）；MHB培養(yǎng)基（北京索萊寶科技有限公司，批號為M8556）。

菌株：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA252；甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌（MSSA）標準菌株ATCC25923，均購于美國菌種保藏中心（ATCC）。

1.2 方法

菌株培養(yǎng)：從-80℃冰箱中取出甘油保種凍存的MRSA252和ATCC25923，分別接種至MHB固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，隨后挑取單菌落接種至MHB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，取200μL菌液至20 mL培養(yǎng)基中，37℃搖動培養(yǎng)5～6 h（此時細菌活力最強），備用。

MIC和最低殺菌濃度（MBC）測定：采用微量肉湯稀釋法檢測苯唑西林、頭孢唑林、氨芐西林、萬古霉素、莫匹羅星、利奈唑胺、HL-J6對上述2種菌株的MIC。將2種菌株菌液稀釋至105cfu/mL，取196μL于96孔板中，隨后加入4μL上述各藥液稀釋，使其最終質(zhì)量濃度為128.0，64.0，32.0，16.0，8.0，4.0，2.0，1.0，0.5μg/mL。37℃培養(yǎng)24 h后，肉眼觀察MHB培養(yǎng)基的渾濁度，無渾濁時的藥液最低質(zhì)量濃度即為該藥物的MIC[7］。吸取肉眼觀察無細菌生長的96孔板中的液體100μL，接種至MHB培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)過夜，觀察培養(yǎng)皿上的菌落數(shù)[7］，以無細菌生長固體培養(yǎng)基對應(yīng)的藥液質(zhì)量濃度為MBC。

細菌樣本制備及RNA-seq：首先，挑取三段劃線法接種的MRSA252單菌落，接種至MHB液體培養(yǎng)基中活化后，取200μL菌液加入20 mL培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)5～6 h。隨后分別取4 mL菌液，各依次加入0.5，0.625，0.75，0.875，1倍MIC的HL-J6，37℃振搖培養(yǎng)3 h，由于0.75倍MIC是不抑制細菌生長的最高藥物質(zhì)量濃度，故取加入0.75倍MIC的菌液2 mL作為實驗組放入保種管中急凍，并與對照組（未經(jīng)任何藥物處理的菌液）一起交由諾禾致源公司進行RNA-seq。為保證分析數(shù)據(jù)質(zhì)量，首先篩選數(shù)據(jù)，即過濾原始數(shù)據(jù)中低質(zhì)量的讀數(shù)，使clean reads所占比例不低于80%。測定并計算鳥嘌呤（G）和胞嘧啶（C）含量以檢測有無A（腺嘌呤）和T（胸腺嘧啶）、GC分離現(xiàn)象（該現(xiàn)象可能由測序或建庫造成，且會影響后續(xù)的定量分析），GC含量＞65%或＜35%時均會增加測序難度。測序錯誤率可反映數(shù)據(jù)質(zhì)量，通常Q20＞90%，Q30＞85%為正常情況。

富集分析：包括GO富集和KEGG通路富集分析。其中GO富集分析包括生物過程、細胞組成、分子功能3個部分。通過對差異基因的分析，可了解經(jīng)HL-J6處理的MRSA在遺傳水平上的變化；通過KEGG通路富集分析可了解經(jīng)HL-J6處理后差異基因所富集的通路，根據(jù)通路中各基因表達的變化從而推測出該藥物對MRSA產(chǎn)生的影響以及藥物對MRSA作用的方式。

實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（real-time RT-PCR）：該方法對基因的相對表達量進行評估以驗證RNAseq數(shù)據(jù)。首先用RNAprep pure Cell/bacteria Kit RNAprep pure來提取MRSA252的總RNA，再用TaKaRa primeScriptTMRT Reagent Kit將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后，使用TaKaRa SYBR Premix Ex Taq進行real-time RT-PCR。所用基因及引物見表1。

表1 基因及引物Tab.1 Gene and primer sequences

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析，Graphpad Prism 9.0軟件作圖。兩組間比較行t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MIC和MBC

前述7種藥物對ATCC25923的MIC分別為2，2，32，1，0.5，1，4μg/mL，MBC分別為4，4，32，2，0.5，1，8μg/mL；對MRSA252的MIC分別為＞128，＞128，128，0.5，1，0.5，2μg/mL，MBC分別為＞128，＞128，128，1，1，1，8μg/mL。說明HL-J6不僅可抑制MSSA，還可抑制MRSA的生長，雖然其MIC高于萬古霉素、利奈唑胺等臨床一線藥物，但仍有較強的抑菌效果。

2.2 轉(zhuǎn)錄組譜的一般特征

本研究中，對照組（樣本編號a，b，c）和實驗組（樣本編號d，e，f）的cDNA文庫中分別得到了24，150，404和24，70，982個clean reads。

2.3 GC含量和測序錯誤率情況

結(jié)果見表2。

表2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量情況Tab.2 Quality of sequencing data

2.4 MRSA中的差異表達基因

為明確HL-J6處理前后MRSA252中基因表達的變化，｜log2（fold change）｜＞0.264（即｜fold change｜＞1.2008）且P＜0.05為有差異的基因。結(jié)果差異基因共630個，其中包括288個表達上調(diào)基因，342個下調(diào)基因。在差異表達的基因中，｜log2（fold change）｜＞2的差異基因共25個，其中14個表達顯著上調(diào)，11個顯著下調(diào)，見圖1 A。

2.5 差異基因聚類分析

聚類分析用以衡量基因或樣本之間表達是否有相似性，分析結(jié)果見圖1B，表達模式相近的基因或樣本會被聚在一起，這些基因可能參與了共同的信號通路，也可能有相同功能。在聚類圖中，橫坐標代表樣本的聚類，每列都代表1個樣本，樣本中基因表達越相似，則會越靠近?？v坐標代表基因聚類，每行代表1個基因，同樣，表達越相似，越靠近。

圖1 差異基因的特征A.Volcano map B.Cluster mapFig.1 Characteristics of differential genes

2.6 富集分析

差異基因GO富集分析結(jié)果見圖2A（圖中展示了較顯著的30個條目）。KEGG通路富集中，實驗組共富集到62條通路，其中較顯著的20條通路見圖2B。與MRSA生長有關(guān)的通路如下。

圖2 差異基因富集分析A.GO enrichment B.KEGG pathway enrichmentFig.2 Enrichment analysis of differential genes

HL-J6影響肽聚糖生物合成相關(guān)通路：結(jié)果見圖3。金黃色葡萄球菌的細胞壁是由肽聚糖和磷壁酸組成的，某些抗生素，例如磷霉素可通過干擾肽聚糖的生物合成來抑制MRSA的生長。在經(jīng)過HL-J6處理后，發(fā)現(xiàn)肽聚糖生物合成相關(guān)基因發(fā)生了變化。其中，UDP-N-乙酰氨基葡糖烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)移酶（MurA）下調(diào)1.77倍，MurD下調(diào)1.28倍，MraY和MurG分別下調(diào)1.27倍和1.35倍。說明HL-J6可能通過干擾細胞壁合成而抑制MRSA的生長。

圖3 HL-J6影響的肽聚糖生物合成相關(guān)通路Fig.3 Peptidoglycan biosynthesis-related pathways affected by HL-J6

HL-J6影響葉酸生物合成途徑：葉酸在合成代謝中起到了不可或缺的作用，其可為核苷酸和氨基酸的生物合成提供不同氧化水平的單碳單位[8］。其中，二氫葉酸還原酶（DHFR）是一種催化二氫葉酸（DHF）為四氫葉酸（THF）的酶，它在葉酸合成和DNA復(fù)制中是必需的，也是常見的抗生素靶點[9］。如圖4A所示，dfrB編碼DHFR，該基因與對照組相比表達下調(diào)1.70倍，由此推斷，HL-J6可能通過抑制DHFR從而抑制葉酸的合成，進而對MRSA產(chǎn)生殺傷作用。

HL-J6影響甘油磷脂代謝：磷脂酰甘油（PG）是存在于細菌以及動植物中的關(guān)鍵陰離子，在金黃色葡萄球菌中的含量十分豐富，同樣也是金黃色葡萄球菌細胞膜的主要成分。磷脂酰甘油磷酸合酶（pgsA）定位于細胞膜上，是PG合成的關(guān)鍵酶，從圖4B中可知，pgsA表達下調(diào)1.33倍。

圖4 HL-J6影響的KEGG通路A.Folic acid biosynthesis pathway B.Glycerolipid metabolismFig.4 KEGG pathway affected by HL-J6

HL-J6影響ABC轉(zhuǎn)運途徑：ABC家族幾乎存在于所有生物中，參與細胞內(nèi)外物質(zhì)的轉(zhuǎn)運，各種各樣的ABC轉(zhuǎn)運蛋白有助于細菌運輸對自己有利的物質(zhì)而排出對自己不利的物質(zhì)[10］。MntC為金屬結(jié)合蛋白，與細菌必需的金屬離子Mn2+相結(jié)合。由圖5A可知，與對照組相比MntC表達下調(diào)1.48倍。同時，SAOUHSC_01991、SAOUHSC_01990分別下調(diào)8.69，9.09倍。

HL-J6影響細菌分泌系統(tǒng)：Sec依賴性蛋白轉(zhuǎn)位酶由SecYEG和SecDF·YajC作為膜蛋白的寡聚體復(fù)合物組成，而SecA作為ATP酶發(fā)揮作用，它是一種定位于細胞質(zhì)和細胞膜上的可溶性蛋白質(zhì)[11］，為Sec依賴性蛋白轉(zhuǎn)位提供能量[12-13］。結(jié)果見圖5B，其中SecA表達下調(diào)l.62倍。

圖5 HL-J6影響的KEGG通路A.ABC transport route B.Bacterial secretory system C.Ribosomal pathwayFig.5 KEGG pathway affected by HL-J6

HL-J6影響核糖體途徑：核糖體在細菌中負責(zé)蛋白質(zhì)合成，它由亞基50S和30S組成，其中50S亞基為大亞基，由23s和5sRNA以及其他蛋白質(zhì)組成；而30S亞基為小亞基，由16sRNA和另外20個蛋白質(zhì)組成。假如細菌蛋白質(zhì)的合成過程被打斷，其生長就會受到相應(yīng)影響，所以細菌的核糖體就顯得尤為重要。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，實驗組核糖體合成相關(guān)基因rpsD，rpmI，rplT等分別下調(diào)1.23，1.68，1.64倍，提示HL-J6可能通過作用于細菌蛋白質(zhì)合成相關(guān)的基因來殺滅細菌，如圖5C所示。

2.7 real-time RT-PCR驗證

經(jīng)驗證后，0.5倍MIC組與對照組相比，細胞壁相關(guān)基因MurA和MurD表達均顯著下調(diào)，說明化合物HL-J6可通過抑制MRSA細胞壁的生長而抑制該細菌活力。詳見圖6。

圖6 Mur A、MurD的相對表達量Fig.6 Relative expression quantity of MurA and MurD

3 討論

金黃色葡萄球菌嚴重危害人類健康[14］，可定殖于人體各部位，且對多藥具有耐藥性，這也是目前其感染后久治不愈的原因，故被稱為“超級細菌”。目前，公認對其療效較好的藥物為萬古霉素，但近年來耐萬古霉素的菌株不斷出現(xiàn)，傳統(tǒng)抗生素或已不能滿足臨床治療需求。

本研究中發(fā)現(xiàn)，HL-J6對MRSA的確存在良好的抑菌效果，驗證實驗結(jié)果表明，與對照組相比，0.5倍MIC組的MurA、MurD基因表達下調(diào)，與RNA-seq結(jié)果一致。并重點討論了差異基因經(jīng)KEGG富集分析所得通路。

細菌細胞壁的主要成分為肽聚糖[15］，是由短肽聚合而成的多層網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，又稱球囊。球囊既可參與細菌的生長和分裂，又可保護細菌形態(tài)的完整性；且有研究發(fā)現(xiàn)，肽聚糖的生物合成途徑可作為抗生素的靶點之一。MurA是肽聚糖進行生物合成第一步反應(yīng)的催化酶，它可催化UDP-N-乙酰氨基葡萄糖（UDP-GlcNAc）與磷酸烯醇丙酮酸（PEP）反應(yīng)生成UDP-N-乙酰氨基葡萄糖烯醇丙酮酸鹽[16］。CHABáN等[17］研究發(fā)現(xiàn)化合物鼠尾草酚、鼠尾草酸20-甲基、鼠尾草酸-γ-內(nèi)酯對金黃色葡萄球菌的抗菌作用與MurA有關(guān)，因此MurA可能成為研發(fā)新型抗生素的一個良好藥物靶點。在本研究中，HL-J6作用于MRSA后，MurA表達也呈下調(diào)趨勢，說明HL-J6有可能通過抑制MurA來阻斷MRSA的生長。另外，MraY通過催化磷酸-MurNAc-五肽從UDP-MurNAc-五肽轉(zhuǎn)移和附著到脂質(zhì)載體十一碳烯磷酸酯上，從而形成UMP和十一碳二烯二磷酸-MurNAc-五肽，說明在肽聚糖的生物合成過程中，MraY對細菌生存也存在重要影響，是目前抗菌藥物的候選靶點之一[18］。KWAK等通過制備基于環(huán)戊烷的莫雷霉素類似物發(fā)現(xiàn)類似物20（JH-MR-23）可有效抑制MraY，對金黃色葡萄球菌有抑制作用。該研究通過對類似物的SAR分析表明，親脂性側(cè)鏈對于抑制MraY和抗菌有十分重要的作用[19］。根據(jù)RNA-seq的結(jié)果，MRSA生存相關(guān)肽聚糖合成基因MraY與對照組相比下調(diào)達1.27倍。因此HL-J6很可能通過干擾細胞壁的合成從而影響MRSA生存。但具體是何結(jié)構(gòu)導(dǎo)致了MraY，MurA的下調(diào)，將在后續(xù)實驗中進一步探討。

除細胞壁合成相關(guān)基因外，葉酸合成相關(guān)基因也有所下調(diào)。葉酸是所有細菌生長所必需的一種重要物質(zhì)，因此參與細菌葉酸合成的關(guān)鍵酶可能成為抗菌藥物作用的靶點之一[20］。已有研究發(fā)現(xiàn)，甲氧芐啶（TMP）和磺胺甲噁唑均可抑制細菌葉酸合成，然而，ZANDER等[21］發(fā)現(xiàn)，上述抗生素對葉酸的抑制可因細菌對胸苷的利用而產(chǎn)生拮抗作用，從而導(dǎo)致治療失敗。只有與核苷類似物聯(lián)用并在胸苷存在的情況下，才有殺菌活性。根據(jù)NCBI可知dfrB編碼DHFR，該基因在本次實驗中下調(diào)1.70倍。在后續(xù)實驗中，將會繼續(xù)探究胸苷在本藥物抑制葉酸中是否存在影響，若產(chǎn)生了影響，則會考慮與其他藥物聯(lián)用以克服這種影響。

腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白（ABC轉(zhuǎn)運蛋白）是一組跨膜糖蛋白，在許多生理生化過程中扮演重要角色[22］。MntC即為ABC轉(zhuǎn)運蛋白系統(tǒng)成分之一，由309個氨基酸組成，分子質(zhì)量為34.7 kDa，是一種表面蛋白，具有錳轉(zhuǎn)運蛋白和黏附素活性[23］。HANDKE等[24］通過測定甲基紫精（一種可產(chǎn)生胞內(nèi)超氧自由基的化合物）的MIC來評估MntC對金黃色葡萄球菌氧化應(yīng)激的抵抗力，該實驗表明，MntC的失活導(dǎo)致兩種金黃色葡萄球菌株對甲基紫精的敏感性增加，而MntC未失活的菌株都表現(xiàn)出對甲基紫精的抵抗性。AHUJA等[25］利用工程抗體片段抑制MntC的活性，發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌對氧化應(yīng)激的敏感性同樣有所增加，這更加說明HL-J6可能通過ABC轉(zhuǎn)運途徑阻礙金黃色葡萄球菌生長。

金黃色葡萄球菌細胞膜由PG、賴氨酸磷脂酰甘油以及心磷脂等多種脂質(zhì)組成[26］。雖然未發(fā)現(xiàn)賴氨酸磷脂酰甘油、心磷脂相關(guān)基因的變化，但PG相關(guān)基因PgsA發(fā)生了下調(diào)。其中，pgsA位于細菌的細胞膜上，是PG合成的關(guān)鍵酶，位于胞膜和胞質(zhì)之間，可將胞苷二磷酸-二?；视停–DP-DAG）轉(zhuǎn)化為磷脂酰甘油磷酸（PGP），PGP被磷酸酶去磷酸化，去除末端磷酸基團從而產(chǎn)生PG[27］。LU等[28］通過蛋白質(zhì)譜、轉(zhuǎn)錄譜發(fā)現(xiàn)己苯乙烯酸（CSA）類似物化合物5b正是以pgsA為靶點，對細菌膜產(chǎn)生影響從而產(chǎn)生抗菌活性。因此，pgsA可能為HL-J6的靶點。

除上述基因的下調(diào)外，本研究中還發(fā)現(xiàn)SecA也有一定程度的下調(diào)。SecA負責(zé)分泌一些重要的蛋白質(zhì)，在細菌中高度保守，對細菌的生長有重要影響[29］。CUI等[30］的研究表明，孟加拉玫紅或二碘曙紅（RB）類似物是SecA的抑制劑，對N315，Mu3，Mu50 3種金黃色葡萄球菌株均有良好的抑菌作用。而另一種SecA抑制劑SCA-50的MIC為4μg/mL，也有良好的抑菌作用。因此，SecA是非常有效的的MRSA抗菌靶點。在我們的研究中，SecA同樣有所下調(diào)，說明HL-J6可能為SecA的抑制劑。

此外，負責(zé)核糖體合成的相關(guān)基因rpsD，rpmI，rplT也發(fā)生了下調(diào)，說明本次藥物的作用靶點還可能有rpsD、rpmI、rplT。細菌的細胞內(nèi)存在許多核糖體，它們負責(zé)細菌蛋白質(zhì)的生物合成[31］，在細菌中，50S和30S亞基一起組成了70S核糖體，30S亞基結(jié)合mRNA并促進解碼，而50S亞基的作用為催化肽基轉(zhuǎn)移中心（PTC）處的肽鍵形成[32］。有研究表明，利奈唑胺是針對金黃色葡萄球菌的有效藥物，該藥物的靶點即為50S和30S亞基，它可通過影響氨酰-tRNA與50S亞基的結(jié)合來殺滅金黃色葡萄球菌[33］。因此，HL-J6對MRSA的抑制作用可能與核糖體合成的相關(guān)基因rpsD，rpmI，rplT的下調(diào)有關(guān)。

另外，在本研究中還發(fā)現(xiàn)了上調(diào)基因SAOUHSC_00202及SAOUHSC_02258，下調(diào)基因SAOUHSC_02925，SAOUHSC_02426，SAOUHSC_00718，SAOUHSC_01292

等基因編碼假設(shè)蛋白。其功能目前尚未確定，它們在HL-J6抑制金黃色葡萄球菌過程中所起的作用還有待深入研究。

綜上所述，新型吲哚苯醌類藥物HL-J6可以較低質(zhì)量濃度對金黃色葡萄球菌產(chǎn)生殺傷作用。推測該藥物的機制可能是通過干擾細胞壁的合成、影響DHFR的合成、影響蛋白質(zhì)的合成和影響細菌細胞膜重要組分的合成來抑制MRSA生長。