蘋果炭疽葉枯菌毒素鈍化藥劑的篩選

于 鑫，劉志揚，劉煥星，張清明，練 森，李保華，李平亮*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山東青島 266109；2.山東省高校植物病蟲害綠色防控工程研究中心，山東青島266109）

蘋果炭疽葉枯?。╝pple Glomerella leaf spot）是由炭疽葉枯病菌（Glomerella cingulata）侵染引起，可快速引起葉片大范圍發(fā)黃、干枯與非正常落葉，果實出現(xiàn)褐色壞死斑，嚴(yán)重降低了嘎啦、金冠等蘋果品種的產(chǎn)量和質(zhì)量[1-2]。蘋果炭疽葉枯病的潛育期很短，果樹染病后，尚無真正的特效藥劑阻止病害的蔓延，目前防治手段主要是發(fā)病前（雨季前）連續(xù)進行保護性施藥，藥劑主要有吡唑醚菌酯、戊唑醇、甲基硫菌靈、代森錳鋅、波爾多液等[3-4]。然而，為持續(xù)防控蘋果炭疽葉枯病，每個生育周期需要噴施藥劑最多達15次，由此帶來的蘋果膳食風(fēng)險和環(huán)境污染問題難以忽視。鑒于此，目前對其防控新技術(shù)的需求較為迫切。

在病原真菌入侵寄主植物的過程中，可產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶、毒素、激素等物質(zhì)，破壞植物的組織結(jié)構(gòu)，干擾植物的代謝過程，降低植物的免疫能力。其中，毒素被認(rèn)為是與病程關(guān)系密切、誘發(fā)植物病害的重要致病因子[5-6]。因此，對蘋果炭疽葉枯病的防治，應(yīng)充分重視致病毒素這一重要因子，推進以病菌毒素為靶標(biāo)的藥劑的相關(guān)研究。鈍化、抑制或中和植物病原真菌毒素，干擾植物病原菌與寄主之間的聯(lián)系，可為病害的高質(zhì)量防控提供新的思路和途徑，但目前尚未有采用毒素鈍化方式防治蘋果炭疽葉枯病的相關(guān)研究報道。

對于毒素鈍化藥劑的研究目前已取得一些進展：①代森錳鋅、硫酸鋅、麥芽糖等可鈍化玉米大斑病菌毒素[7]；②鉬酸鈉、檸檬酸、L-脯氨酸、L-色氨酸等化合物可以鈍化煙草赤星病菌毒素[8-9]；③硫酸銅、硫酸錳、煙酸等可鈍化瓜類枯萎病菌毒素[10]；④高錳酸鉀、碳酸鈉可鈍化番茄灰霉病菌毒素[11]。蒲麗冰[12]采用毒素鈍化劑（Fe2SO4·7H2O+EDTA·Na2）處理栽種香蕉苗的土壤，結(jié)果顯示土壤中香蕉枯萎病菌毒素含量明顯降低，病情指數(shù)也顯著低于對照。史祥鵬等[13]以嘎啦葉片為材料，采用針刺接種法對蘋果炭疽葉枯病菌產(chǎn)生毒素條件進行了研究，結(jié)果表明：①改良的Richard液體培養(yǎng)基中產(chǎn)生的毒素活性最高。②粗毒素多數(shù)成分易溶于水相，極性較強。③乙醇或甲醇沉淀處理后，上清液對葉片具有毒害作用，而接種沉淀未產(chǎn)生明顯癥狀，表明毒素屬于小分子化合物。④添加外源物質(zhì)可改變蘋果炭疽葉枯病的發(fā)病進程。因蘋果炭疽葉枯病菌侵染引起的快速落葉與葉片中乙烯的過量產(chǎn)生有關(guān)，乙烯生物合成抑制劑氨基乙氧基乙烯甘氨酸的特定劑量處理可明顯減少病菌侵染引起的葉片脫落[14]。

基于已有的研究成果，本文以炭疽葉枯病菌粗毒素和嘎啦蘋果葉片為生測材料，選取9種植物生長調(diào)節(jié)劑（或植物激素）和19種鹽作為候選毒素鈍化藥劑，通過毒素單獨處理、毒素-鈍化劑混合處理葉片的方式，篩選出可用于鈍化炭疽葉枯病菌毒素的藥劑，并探討了鈍化劑的病害防治效果，研究成果可為病菌毒素靶標(biāo)藥劑的開發(fā)提供參考。

1 試驗材料

（1）供試菌株：病菌菌株分離自青島農(nóng)業(yè)大學(xué)膠州基地自建蘋果園發(fā)病的嘎啦蘋果葉片，經(jīng)單孢分離、純化后，鑒定為炭疽葉枯病菌，菌株編號為WT 030206。

（2）生測材料：健康嘎啦葉片取自青島農(nóng)業(yè)大學(xué)自建蘋果園，葉片摘取后立即進行生測試驗。

（3）候選的鈍化藥劑：9種植物生長調(diào)節(jié)劑（吲哚丁酸、吲哚乙酸、噻苯隆、α萘乙酸、蕓苔素內(nèi)酯、2，4-D、6-BA、赤霉素、復(fù)硝酚鈉），19種鹽（碳酸氫鈉、檸檬酸鈉、丙酸鈉、氯化鐵、硫酸亞鐵、鉬酸鈉、檸檬酸、硝酸鈉、硫酸鋅、高錳酸鉀、碘化鉀、硫酸銅、硫酸鈣、硫酸錳、氯化鎂、碳酸鈉、氯化鈉、檸檬酸鐵、苯甲酸鈉），均為分析純試劑或農(nóng)藥原藥，分別購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司、上海麥克林生化科技股份有限公司、上海源葉生物科技有限公司、北京索萊寶科技有限公司等。將28種物質(zhì)分別配制成質(zhì)量濃度為5 000 mg/L的水溶液，水溶性差的植物生長調(diào)節(jié)劑先用少量甲醇溶解再溶于水，必要時滴加表面活性劑吐溫80，但甲醇和吐溫80體積占比需小于0.5%。

2 試驗方法及討論

2.1 粗毒素的制備方法

粗毒素的制備是鈍化劑篩選試驗的前提。本文以Richard病菌培養(yǎng)液作為粗毒素的來源，經(jīng)紗布過濾、高速離心、液液萃?。ㄒ宜嵋阴?、正丁醇溶劑）與濃縮后，對葉片的致病活性進行測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種溶劑濃縮后的溶液活性遠(yuǎn)低于發(fā)酵濾液本身，猜測是提取過程中未能將一些致病物質(zhì)提取完全，失去了部分重要的致病物質(zhì)，或改變了關(guān)鍵成分的化學(xué)性質(zhì)，因而難以采用該方法提取粗毒素。

理論上病菌培養(yǎng)液直接使用活性最高，但培養(yǎng)液含有病菌菌絲與孢子，無法分辨癥狀是病菌侵染導(dǎo)致還是毒素物質(zhì)誘發(fā)。進一步地，經(jīng)高速離心（4℃，12 000 r/min，20 min）、微生物過濾器（0.22 μm微孔濾膜）過濾兩步處理后進行顯微觀察，結(jié)果顯示濾液中不含病菌的菌絲、孢子；將濾液涂抹于PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂）培養(yǎng)基，培養(yǎng)5 d后未發(fā)現(xiàn)生長的病菌，因此認(rèn)為該處理手段可以排除病菌對粗毒素活性的干擾?？紤]制備過程的簡易性、濾液的活性及其干擾因素，最終采用培養(yǎng)10 d的Richard病菌培養(yǎng)液濾液作為粗毒素。

制備濾液需經(jīng)過3個步驟：紗布過濾、高速離心和0.22 μm微孔濾膜過濾。即將炭疽葉枯病菌接種于PDA培養(yǎng)基后，在25℃和黑暗條件下培養(yǎng)至菌落直徑達培養(yǎng)皿直徑的3/4（約3 d）。借助打孔器（直徑5 mm）在菌落邊緣取菌餅10個，接種于含有改良Richard液體培養(yǎng)基的三角瓶，以空白培養(yǎng)液加入空白PDA培養(yǎng)基菌塊作為對照。將接入菌餅的三角瓶放置于搖床，在溫度為25℃、轉(zhuǎn)速150 r/min、無光照的條件下培養(yǎng)10 d。用4層紗布過濾培養(yǎng)液中的菌絲球，濾液在4℃、12 000 r/min條件下離心20 min。取上清液分別采用微生物過濾器（0.22 μm微孔濾膜）過濾，以濾液作為病菌的粗毒素，裝入玻璃容器，置于4℃冰箱保存。

2.2 鈍化劑的篩選方法及結(jié)果

2.2.1 篩選方法

采用離體葉片-針刺處理法篩選病菌毒素的鈍化劑。選取無傷痕的健康嘎啦蘋果葉片，先用酒精擦拭消毒，之后在葉脈兩側(cè)用大頭針造傷形成針眼。造傷后迅速將2片濾紙片（直徑3 mm）貼至造傷口處，使針眼處于中心位置。接著使用移液槍在濾紙片上緩慢滴加20 μL的粗毒素溶液。葉片轉(zhuǎn)移至含水保濕的培養(yǎng)盒，并放置于溫度為25℃的培養(yǎng)箱，進行黑暗培養(yǎng)。等待毒素處理12 h 后，同樣借助移液槍將候選鈍化藥劑溶液20 μL緩慢滴加至濾紙片。待毒素顯癥后（3 d）觀察并拍照，用刻度尺量取病斑直徑（cm），每個處理設(shè)置3個重復(fù)。根據(jù)文獻報道[10-12]以及植物激素的作用特點，鈍化藥劑質(zhì)量濃度設(shè)置為：植物激素類物質(zhì)為10和100 mg/L，鹽類物質(zhì)為200和1 000 mg/L。采用添加鈍化劑前后毒素處理病斑直徑的抑制率來表示鈍化藥劑的效果：

2.2.2 篩選結(jié)果

28種候選藥劑進行鈍化劑篩選后，各藥劑對毒素病斑的抑制率如表1所示。由表1可見：①各植物生長調(diào)節(jié)劑具有一定的毒素鈍化活性，除吲哚丁酸、吲哚乙酸外，一般均為較高質(zhì)量濃度（100 mg/L）鈍化劑的病斑抑制率較高；②多數(shù)鹽也具有一定的毒素鈍化活性，能夠抑制毒素造成的病斑，僅苯甲酸鈉可增加病斑直徑；③相比較而言，復(fù)硝酚鈉和丙酸鈉在植物生長調(diào)節(jié)劑、鹽兩個類別中的表現(xiàn)較為優(yōu)異，低質(zhì)量濃度（10 mg/L）和高質(zhì)量濃度（100 mg/L）處理均可顯著鈍化毒素活性，較高質(zhì)量濃度時的抑制率分別為77.6%和88.7%。因此，復(fù)硝酚鈉、丙酸鈉可作為最優(yōu)鈍化劑的候選。兩種藥劑對對粗毒素鈍化效果的代表性照片見圖1。

圖1 復(fù)硝酚鈉和丙酸鈉對炭疽葉枯病菌粗毒素的鈍化效果

表1 28 種候選藥劑對炭疽葉枯菌粗毒素病斑的抑制率

根據(jù)趙光耀等[7]的研究，藥劑對植物病原菌毒素鈍化的主要機理是通過中和、抵消病菌毒素造成的毒性效應(yīng)，而起到對植物的解毒、恢復(fù)作用，但對復(fù)硝酚鈉和丙酸鈉鈍化作用的研究還缺乏相應(yīng)的報道，只能根據(jù)其特點進行推測：①兩種藥劑從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看均無較強的氧化、還原和絡(luò)合等作用，因而直接作用于毒素分子結(jié)構(gòu)的可能性不大；②作為5-硝基愈創(chuàng)木酚鈉、鄰硝基苯酚鈉、對硝基苯酚鈉混合而成的植物生長調(diào)節(jié)劑，復(fù)硝酚鈉具有很強的植物滲透和細(xì)胞賦活作用[15]，因而其鈍化作用可能來自其對毒素-植物互作過程的干擾，使毒素?zé)o法產(chǎn)生正常的致病效應(yīng)；③丙酸鈉是一種可用作食品防腐劑、分子結(jié)構(gòu)簡單的鹽，目前還未有其與植物互作的相關(guān)報道，鈍化的機理尚無法推測。

由于蘋果炭疽葉枯病在6—9月均可能流行，而該期間溫度變化較大，可能影響鈍化藥劑的適用性。采用離體葉片-針刺處理法測定質(zhì)量濃度分別為100和1 000 mg/L時，不同溫度（15、25、30和35℃）復(fù)硝酚鈉、丙酸鈉的鈍化效果，見圖2。由圖2可知：①15℃條件下兩種物質(zhì)的鈍化效果無明顯區(qū)別，葉片均沒有產(chǎn)生壞死斑；②在25、30和35℃條件下，復(fù)硝酚鈉對粗毒素的鈍化作用強于丙酸鈉，猜測可能是毒素活性隨著溫度的升高而增強，造成兩種物質(zhì)的鈍化效果變?nèi)?。由此可見，?fù)硝酚鈉的鈍化效果相對穩(wěn)定。此外，復(fù)硝酚鈉是常見的植物生長調(diào)節(jié)劑，已在農(nóng)業(yè)上廣泛使用，且價格便宜，更適于田間實際應(yīng)用。因此，最終以復(fù)硝酚鈉作為最優(yōu)的炭疽葉枯病菌毒素鈍化藥劑。

圖2 不同溫度條件下復(fù)硝酚鈉和丙酸鈉對炭疽葉枯病菌粗毒素的鈍化作用

2.3 鈍化藥劑的病害防效測定

選取健康無病的嘎啦蘋果果樹，將之移到果園溫室隔離并單獨接菌，防止病菌傳染至其他果樹。選取長有6～10片健康無病斑葉片的枝條若干，分成兩部分，一部分進行保護作用的藥效試驗，一部分進行治療作用的藥效試驗，掛牌標(biāo)記。用作混配的殺菌劑選用山東康喬生物科技有限公司提供的25%吡唑醚菌酯懸浮劑，用蒸餾水配制成溶液。

保護性施藥：先用小型噴壺噴灑10 mg/L的復(fù)硝酚鈉水溶液、100 mg/L的復(fù)硝酚鈉水溶液、100 mg/L復(fù)硝酚鈉和100 mg/L的吡唑醚菌酯混合水溶液，至葉片液體成滴流下為止；12 h后，噴灑濃度為1.0×105CFU/mL的炭疽葉枯病菌孢子懸浮液，至葉片液體成滴流下為止。用塑料袋包裹枝條，保濕培養(yǎng)以利發(fā)病，3 d后觀察。隨機選擇6個葉片進行病斑數(shù)的統(tǒng)計和拍照。

治療性施藥：先用小型噴壺噴灑濃度為1.0×105CFU/mL的炭疽葉枯病菌孢子懸浮液，至葉片液體成滴流下為止，用塑料袋包裹枝條；12 h后取下塑料袋，分別噴施10 mg/L的復(fù)硝酚鈉水溶、100 mg/L的復(fù)硝酚鈉水溶液、100 mg/L復(fù)硝酚鈉和100 mg/L吡唑醚菌酯混合水溶液，至葉片液體成滴流下為止。用塑料袋重新包裹枝條，3 d后觀察。隨機選擇6個葉片進行病斑數(shù)的統(tǒng)計和拍照。

以上藥效試驗，以僅噴灑蒸餾水的枝條作為空白對照，以僅噴灑炭疽葉枯病菌孢子懸浮液的枝條作為發(fā)病對照，每組處理均設(shè)置3個重復(fù)。藥劑的防效計算公式為

2.4 鈍化劑對病菌生長的影響測定

2.4.1 菌絲生長速率法

將供試的炭疽葉枯病菌菌株接種于PDA平板上，25℃恒溫培養(yǎng)5 d作為菌源。用無菌水將復(fù)硝酚鈉配制成系列濃度，混入融化的PDA培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基中復(fù)硝酚鈉質(zhì)量濃度分別為3.125、6.25、12.5、25、50和100 mg/L，快速搖勻，將其倒入直徑為6 cm的培養(yǎng)皿，每個質(zhì)量濃度設(shè)置3個重復(fù)皿。待PDA凝固后，用5 mm打孔器在菌落邊緣打取菌餅，并接種PDA培養(yǎng)基，以加無菌水的PDA培養(yǎng)基為對照組。將培養(yǎng)基置于無光照的25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，采用十字交叉法測量各處理組菌落的直徑。

2.4.2 孢子萌發(fā)法

在超凈工作臺內(nèi)，將復(fù)硝酚鈉溶液加入10 mL融化的水瓊脂培養(yǎng)基，使其質(zhì)量濃度分別為3.125、6.25、12.5、25、50和100 mg/L，以不加藥劑的處理作為對照。將培養(yǎng)基倒于直徑為70 mm的培養(yǎng)皿，待其凝固后，用移液槍吸取70 μL炭疽葉枯病菌孢子懸浮液（濃度為3×106CFU/mL）在培養(yǎng)皿上均勻涂布，每組設(shè)置3個重復(fù)。25℃黑暗條件下培養(yǎng)4 h后，在顯微鏡下觀察，芽管長于孢子囊直徑則視為萌發(fā)。每個培養(yǎng)皿隨機選取顯微鏡下的5個視野，進行觀察、計數(shù)，并計算各處理組的孢子萌發(fā)率：

2.5 鈍化劑的安全性

為了驗證鈍化藥劑施用的安全性，配制5 L質(zhì)量濃度為100 mg/L的復(fù)硝酚鈉水溶液，在無風(fēng)的下午，借助小型電動噴霧器，對3棵長勢相近的健康嘎啦蘋果樹進行噴灑，至液體成滴流下時止。以噴灑純水的3棵鄰近果樹作為對照。用隔板和塑料袋隔離包括對照組在內(nèi)的其他果樹。施藥后第3天、第7天和第14天分別觀察果樹的長勢以及枝條、葉片的狀態(tài)，以確定該濃度的藥劑噴施是否引起果樹藥害。

3 結(jié)果與討論

3.1 復(fù)硝酚鈉對病害防治效果

將復(fù)硝酚鈉應(yīng)用于蘋果炭疽葉枯病的防治中，測定其保護、治療性施藥的防效。根據(jù)病斑統(tǒng)計結(jié)果：①保護性施藥3 d后，發(fā)病對照組病斑數(shù)分別為14.6±2.7，復(fù)硝酚鈉10 mg/L組、復(fù)硝酚鈉100 mg/L組、復(fù)硝酚鈉100 mg/L＋吡唑醚菌酯100 mg/L組的病斑數(shù)分別為5.2±1.8、0和0，三者的防效分別為（64.2±11.7）%、100%和100%；②治療性施藥3 d后，發(fā)病對照組病斑數(shù)分別為16.5±4.5，復(fù)硝酚鈉10 mg/L 組、復(fù)硝酚鈉100 mg/L 組、復(fù)硝酚鈉100 mg/L＋吡唑醚菌酯100 mg/L組的病斑數(shù)分別為4.0±2.4、0.3±0.5和0.2±0.4，三者的防效分別為（76.5±13.9）%、（98.0±3.0）%和（99.0±2.4）%。以上結(jié)果表明：①質(zhì)量濃度為10 mg/L的復(fù)硝酚鈉水溶液具有一定的保護和治療效果，但不能完全抑制病害的發(fā)生；②質(zhì)量濃度增加至100 mg/L時，保護和治療防效均接近100%，防效相對理想；③100 mg/L的復(fù)硝酚鈉水溶液加入質(zhì)量濃度為100 mg/L的吡唑醚菌酯，防效保持在100%左右，顯示兩者可以混用。三者處理防效的照片見圖3。由于本文采用炭疽葉枯病菌孢子懸浮液噴灑，在理想環(huán)境條件下控制葉片發(fā)病，與田間病害發(fā)病過程可能有所區(qū)別，所以復(fù)硝酚鈉在果園中的實際防效需要進一步驗證。

圖3 各質(zhì)量濃度復(fù)硝酚鈉噴施對蘋果炭疽葉枯病的保護和治療效果

由于復(fù)硝酚鈉主要作用于病菌毒素，無法抑制病菌本身，故在實際病害防治中復(fù)硝酚鈉適宜于與殺菌劑混用，分別負(fù)責(zé)鈍化毒素和抑制病菌繁殖，協(xié)同保護蘋果葉片。可以認(rèn)為，預(yù)防或治療蘋果炭疽葉枯病可使用質(zhì)量濃度為100 mg/L的復(fù)硝酚鈉，而加入質(zhì)量濃度為100 mg/L的殺菌劑吡唑醚菌酯時防效更有保證。植物生長調(diào)節(jié)劑因其對作物的誘導(dǎo)抗逆能力，常用來輔助防控植物病害，如杧果采收前噴施復(fù)硝酚鈉可以有效降低炭疽病和蒂腐病的發(fā)生[16]。因此，本文篩選的復(fù)硝酚鈉在蘋果炭疽葉枯病的防治方面具有一定的理論基礎(chǔ)、實際應(yīng)用潛力與可拓展價值。

3.2 復(fù)硝酚鈉對病菌生長發(fā)育的影響

鑒于復(fù)硝酚鈉有可能直接對炭疽葉枯病菌發(fā)生作用，故無法確定其是否通過鈍化毒素的方式防治蘋果炭疽葉枯病。對此，本文研究了復(fù)硝酚鈉對炭疽葉枯病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響，結(jié)果見表2。由表2可知，與對照組相比，復(fù)硝酚鈉各個質(zhì)量濃度對炭疽葉枯病菌菌絲的生長和孢子萌發(fā)均無顯著抑制作用，甚至低質(zhì)量濃度條件下還能輕微促進病菌的孢子萌發(fā)。由此可知，復(fù)硝酚鈉對病菌本身的生長并無抑制作用，對病害的防治可能主要因為藥劑對毒素的鈍化、解毒等作用，從而降低了病菌的侵染致病能力。

表2 復(fù)硝酚鈉對病菌菌落直徑、孢子萌發(fā)率的影響

3.3 復(fù)硝酚鈉的施用安全性

對施藥后第3天、第7天和第14天的蘋果樹進行了觀察，結(jié)果顯示：①藥劑施用組果樹的樹干、枝條、葉，與對照組第3天未見明顯差異；②第7天、第14天，藥劑施用組果樹的樹干、枝條與對照組無明顯差異，但葉片顏色更加翠綠、明亮，生長旺盛，可以認(rèn)為，復(fù)硝酚鈉對蘋果樹的生長無明顯藥害，且可調(diào)節(jié)、改善蘋果葉片的生理狀態(tài)，因此，初步認(rèn)為復(fù)硝酚鈉噴施對蘋果樹是安全的。然而，由于試驗未包括復(fù)硝酚鈉在蘋果果實中的殘留消解、膳食攝入風(fēng)險等，還需進一步研究其使用的安全性。

4 結(jié)論

蘋果炭疽葉枯病潛育期短、病情發(fā)展快，能快速造成大量的早期落葉，嚴(yán)重威脅蘋果的產(chǎn)量和質(zhì)量。蘋果樹染病前需要連續(xù)施用殺菌劑進行保護性施藥，染病后則難以防治，因此對其防控新技術(shù)的需求較為迫切。鈍化、抑制植物病原真菌毒素，干擾植物病原菌與寄主之間的聯(lián)系，可為蘋果炭疽葉枯病的防控提供新的途徑。本文以炭疽葉枯病菌產(chǎn)生的粗毒素以及嘎啦蘋果葉片為生測材料，測定了28種物質(zhì)對其粗毒素的鈍化活性。篩選結(jié)果表明，復(fù)硝酚鈉對粗毒素的鈍化作用較為理想，且在不同溫度條件下其鈍化效果相對穩(wěn)定。進一步研究表明，復(fù)硝酚鈉噴施對蘋果炭疽葉枯病具有一定的保護和治療防效，但藥劑本身對炭疽葉枯病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)無顯著影響，對蘋果樹的生長無明顯藥害，且可調(diào)節(jié)、改善蘋果葉片的生理狀態(tài)。因此，推測復(fù)硝酚鈉是一種可以通過鈍化病菌毒素方式防治蘋果炭疽葉枯病的藥劑，可單獨使用或輔助殺菌劑使用。