• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于SSR的廣西同色兜蘭和帶葉兜蘭遺傳多樣性分析*

    2023-03-01 05:01:10朱顯亮朱舒靖唐健民羅亞進(jìn)
    廣西科學(xué) 2023年6期
    關(guān)鍵詞:兜蘭同色種群

    朱顯亮,朱舒靖,2,鄒 蓉,唐健民,羅亞進(jìn),韋 霄**

    (1.廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所,廣西植物功能物質(zhì)研究與資源持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西桂林 541006;2.廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,廣西桂林 541006;3.廣西雅長蘭科植物國家級自然保護(hù)區(qū)管理中心,廣西百色 533209)

    兜蘭是蘭科(Orchidaceae)兜蘭屬(Paphiopedilum)植物的統(tǒng)稱,以其花唇瓣呈兜狀聞名,又因酷似舊時(shí)歐洲女子拖鞋,亦被稱為“拖鞋蘭”和“仙履蘭”。兜蘭屬共包括109個(gè)物種,其中有27個(gè)分布在中國[1]。該屬花形奇特,并且在生長習(xí)性(地生型、石上附生型和樹上附生型)、開花時(shí)間(春季開花型、夏季開花型、秋冬季開花型和四季開花型等)和開花類型(單花、雙花或多花)等方面呈現(xiàn)豐富的多樣性[2]。因此,兜蘭是具有高觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的花卉植物。然而,由于過度采集和非法貿(mào)易,大多數(shù)野生兜蘭的棲息地人為破壞嚴(yán)重,因此其種群和個(gè)體數(shù)量都在不斷減少,瀕臨滅絕。

    同色兜蘭(P.concolor)是兜蘭屬中罕見的四季開花型物種,曾自然分布于廣西、云南和貴州的部分地區(qū)[3],但近期的全國專項(xiàng)調(diào)查顯示僅在廣西西南地區(qū)一帶見其自然分布[4]。帶葉兜蘭(P.hirsutissimum)是春季開花型兜蘭,花期在4-5月,主要分布在廣西西部至北部、貴州西南部和云南東南部一帶[5]。在2021年版《國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄》中,同色兜蘭和帶葉兜蘭分別被列為國家一級和二級重點(diǎn)保護(hù)野生植物。對于瀕危植物而言,了解它們的遺傳多樣性、種群結(jié)構(gòu)、種群遺傳分化等信息對物種保育具有重要意義[6-8]。為了有效保護(hù)和利用帶葉兜蘭,先前已經(jīng)開展了一些保護(hù)遺傳學(xué)方面的研究:高麗霞等[9]基于SRAP標(biāo)記評估了廣西木論國家級自然保護(hù)區(qū)40份野生帶葉兜蘭資源的遺傳多樣性;徐言等[10]基于SSR標(biāo)記對中國西南地區(qū)190份帶葉兜蘭資源(其中13份來自廣西木論國家級自然保護(hù)區(qū),39份來自廣西雅長蘭科植物國家級自然保護(hù)區(qū))進(jìn)行了遺傳多樣性、種群結(jié)構(gòu)和表型多樣性分析。廣西是蘭科植物的天然分布中心之一,擁有相對豐富的蘭科植物資源,然而先前對廣西帶葉兜蘭資源的遺傳多樣性評估都集中在自然保護(hù)區(qū)中的就地保護(hù)種群,可能難以反映存活在自然保護(hù)區(qū)之外的帶葉兜蘭野生種群的遺傳多樣性。迄今為止,還未有關(guān)于同色兜蘭遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)方面的報(bào)道。此外,對于這兩種不同開花習(xí)性的兜蘭屬物種的遺傳分化程度也缺少研究。

    因此,本研究通過實(shí)地調(diào)查,廣泛收集了分布于廣西的231份同色兜蘭和帶葉兜蘭樣品,并利用SSR標(biāo)記開展保護(hù)遺傳學(xué)研究,重點(diǎn)探究不同開花習(xí)性的同色兜蘭和帶葉兜蘭的遺傳多樣性水平、種群結(jié)構(gòu)及其遺傳分化。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    在廣西采集了同色兜蘭5個(gè)自然種群的80個(gè)樣品以及帶葉兜蘭7個(gè)自然種群的151個(gè)樣品(表1)。為了探究同色兜蘭和帶葉兜蘭的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,還采集了同屬的其他3個(gè)近緣種,分別為長瓣兜蘭(P.dianthum)、麻栗坡兜蘭(P.malipoense)和硬葉兜蘭(P.micranthum),每個(gè)近緣種各采集3個(gè)樣品。由于部分兜蘭屬物種具有叢生特點(diǎn),為了避免采集到同一株植株,所有采集植株之間至少間隔10 m。使用變色硅膠分別采集各植株的新鮮葉片樣品。

    表1 樣品采集信息

    1.2 DNA提取和SSR分型

    使用改良CTAB(Cetyltrimethylammonium Bromide)法[11]提取了240個(gè)樣品的DNA,并利用1.2%瓊脂糖電泳(120 V,20 min)進(jìn)行質(zhì)檢。使用NanoDROP 8000超微量分光光度計(jì)(賽默飛世爾科技公司)檢測DNA的濃度和純度(A260/A280=1.8-2.0,濃度≥30 ng/μL)。利用10對高多態(tài)性SSR引物(表2)對240個(gè)樣品進(jìn)行分型。10對高多態(tài)性SSR引物篩選自Xu等[12]在亨利兜蘭(P.henryanum)中開發(fā)的34對EST-SSR引物,該研究已證明34對引物在7種兜蘭屬(包括同色兜蘭和帶葉兜蘭)植物中均有較好的擴(kuò)增效果。PCR擴(kuò)增體系:2×Taq PCR Master Mix 5.0 μL,DNA 1.0 μL(~20 ng),上、下游引物各0.5 μL(濃度均為10 pmol/μL),ddH2O 3.0 μL。PCR擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,62-52 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,反應(yīng)循環(huán)10次;95 ℃變性30 s,52 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,反應(yīng)循環(huán)25次;72 ℃末端延伸20 min;4 ℃保溫。使用GeneMapper v4.1軟件在ABI 3730xl DNA分析儀上讀取SSR基因型。

    表2 SSR引物信息以及多態(tài)性分析

    1.3 方法

    1.3.1 遺傳多樣性和瓶頸效應(yīng)分析

    使用GenAlEx v6.5.1[13]計(jì)算位點(diǎn)和群體的遺傳多樣性指標(biāo),包括觀測等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、香農(nóng)信息指數(shù)(I)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和固定系數(shù)(F)等。利用R語言對同色兜蘭和帶葉兜蘭間各群體的遺傳多樣性指標(biāo)差異進(jìn)行t檢驗(yàn)。利用分子方差分析(AMOVA)評估種群間、個(gè)體間和個(gè)體內(nèi)的總遺傳變異。采用BOTTLENECK v1.2.02[14]軟件對各種群進(jìn)行瓶頸效應(yīng)分析。根據(jù)Piry等[14]的建議使用更適合SSR標(biāo)記的兩相混合模型(TPM)進(jìn)行檢驗(yàn),并設(shè)置方差(Variance)為12,步移式突變(SMM)占模型檢測的比例為95%,以及迭代次數(shù)為1 000。由于同色兜蘭TS-PR種群的采樣數(shù)量低于Bottleneck軟件的最低使用標(biāo)準(zhǔn),因此在瓶頸效應(yīng)檢驗(yàn)中排除該種群。

    1.3.2 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和遺傳結(jié)構(gòu)分析

    為了更準(zhǔn)確評估同色兜蘭和帶葉兜蘭間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,在分析中加入了長瓣兜蘭、麻栗坡兜蘭和硬葉兜蘭共9個(gè)樣品的數(shù)據(jù),然后利用MEGA v6.0[15]的非加權(quán)平均(UPGMA)法和鄰接(NJ)法分別構(gòu)建群體水平和個(gè)體水平的系統(tǒng)發(fā)育樹。

    采用不同分析方法檢測群體間的遺傳結(jié)構(gòu)。首先,通過GeneAlEx v6.5.1計(jì)算個(gè)體間Nei氏遺傳距離矩陣,隨后使用主坐標(biāo)分析(PCoA)來計(jì)算樣品主坐標(biāo)成分,并通過主坐標(biāo)成分來說明個(gè)體間遺傳聚類。使用STRUCTURE[16]對全部個(gè)體進(jìn)行貝葉斯聚類分析,設(shè)置假定分群數(shù)(K)為1-10,Burn-in周期為10 000,MCMC(Markov Chain Monte Carlo)設(shè)為100 000,每個(gè)K值重復(fù)運(yùn)行10次,再利用在線工具Structure Harvester,根據(jù)DeltaK的最大值確定最佳分群數(shù)[17]。

    1.3.3 遺傳分化、距離隔離(IBD)和環(huán)境隔離(IBE)分析

    利用Arlequin v3.5.2.2[18]計(jì)算同色兜蘭和帶葉兜蘭群體間的遺傳分化系數(shù)(FST)。根據(jù)12個(gè)種群的地理坐標(biāo)信息,利用R語言計(jì)算種群間的地理距離,并在WorldClim數(shù)據(jù)庫(http://worldclim.org/)中下載了19個(gè)氣候變量信息,在國家青藏高原數(shù)據(jù)中心(https://data.tpdc.ac.cn/)的Harmonized World Soil Database v1.1中下載了16個(gè)表土理化特性信息作為土壤變量。通過計(jì)算35個(gè)變量間的Spearman相關(guān)性系數(shù)(R)來去除冗余變量,當(dāng)兩兩變量間的相關(guān)性絕對值大于0.8時(shí),僅保留其中1個(gè)變量,最終確定了12個(gè)代表性環(huán)境變量:年平均氣溫(BIO1)、晝夜溫差月均值(BIO2)、等溫性(BIO3)、溫度季節(jié)性變化標(biāo)準(zhǔn)差(BIO4)、最干月降水量(BIO14)、降水量變異系數(shù)(BIO15)、表土含礫量(T_GRAVEL)、表土黏土分?jǐn)?shù)(T_CLAY)、表土USDA質(zhì)地分類(T_USDA_TEX)、表土水pH值(T_PH_H2O)、表土陽離子交換量(T_CEC_CLAY)、表土鹽度(T_ECE)。最后,分別對遺傳分化系數(shù)、地理距離以及12個(gè)代表性環(huán)境變量進(jìn)行Mantel檢驗(yàn),計(jì)算Spearman相關(guān)性系數(shù),并進(jìn)行9 999次置換檢驗(yàn)顯著性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 遺傳多樣性和種群瓶頸

    在231個(gè)同色兜蘭和帶葉兜蘭樣品中,10個(gè)SSR位點(diǎn)檢測的平均Na為2.4,平均Ne為1.6。其中,I最高的是位點(diǎn)DL21(1.093),最低的是DL23(0.147)。Ho和He分別為0.029-0.629和0.081-0.571。各位點(diǎn)的平均F值為0.081 (表2)。

    通過比較物種間的平均遺傳多樣性水平發(fā)現(xiàn),帶葉兜蘭的I(0.619)約為同色兜蘭(0.290)的2倍,并且其Ho(0.335)和He(0.354)均極顯著(P<0.001)高于同色兜蘭(Ho=0.136,He=0.159)。在所有種群中,檢測到的平均Na和Ne分別為0.9-3.2和0.8-2.0。從固定系數(shù)上看,除DY-XKR和TS-JH種群外,其余種群均表現(xiàn)出雜合缺失(F>0)。此外,瓶頸效應(yīng)結(jié)果顯示,同色兜蘭的TS-HG和TS-MQ種群存在顯著瓶頸效應(yīng)(P<0.05),而帶葉兜蘭所有種群均不存在顯著瓶頸效應(yīng)(P>0.05,表3)。

    表3 同色兜蘭和帶葉兜蘭種群的遺傳多樣性和瓶頸效應(yīng)

    AMOVA分析(表4)顯示,帶葉兜蘭的遺傳變異主要來自個(gè)體內(nèi)(77.5%),同色兜蘭個(gè)體間(45.9%)和個(gè)體內(nèi)(40.5%)的遺傳變異相當(dāng),兩個(gè)物種來自種群間的變異都較少,帶葉兜蘭僅7.4%,同色兜蘭僅13.6%。

    表4 同色兜蘭和帶葉兜蘭的AMOVA分析

    2.2 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及遺傳結(jié)構(gòu)

    群體水平的UPGMA樹和個(gè)體水平的NJ樹均顯示同色兜蘭和帶葉兜蘭各自聚為1支[圖1(a)、(b)],但相比于長瓣兜蘭、麻栗坡兜蘭和硬葉兜蘭,帶葉兜蘭與同色兜蘭的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系更為接近。在UPGMA樹中發(fā)現(xiàn),同色兜蘭的TS-JH和TS-WP遺傳距離最近,而帶葉兜蘭中DY-JX和DY-PJ,以及DY-XKR和DY-TL的遺傳距離都較近[圖1(a)]。PCoA的結(jié)果與NJ樹分析的結(jié)果基本一致,可以較好地區(qū)分帶葉兜蘭與同色兜蘭個(gè)體,其中,第1和第2主坐標(biāo)成分對總變量的解釋率分別為54.8%和12.2% [圖1(c)]。

    圖1 系統(tǒng)發(fā)育分析和主坐標(biāo)分析

    對兩個(gè)物種的Structure分析顯示K=2的分群結(jié)果最佳,此時(shí)兩個(gè)物種的個(gè)體被明顯分開[圖2(a)、(b)]。同色兜蘭和帶葉兜蘭的獨(dú)立Structure分析顯示,兩個(gè)物種都進(jìn)一步檢測到兩種不同的遺傳成分[圖2(c)、(d)]。

    2.3 遺傳分化、IBD和IBE的檢驗(yàn)

    遺傳分化分析結(jié)果[圖3(a)]顯示,帶葉兜蘭兩兩種群間的平均FST為0.077,同色兜蘭兩兩種群間的平均FST為0.237,而兩個(gè)物種的種群間的平均FST為0.572,達(dá)到了較高的分化水平。為探究遺傳分化的驅(qū)動因子,分別進(jìn)行IBD檢驗(yàn)[圖3(b)]和IBE檢驗(yàn)[圖3(c)]。其中,IBD檢驗(yàn)顯示12個(gè)種群間的地理距離與遺傳距離呈現(xiàn)顯著正相關(guān)(R=0.300,P<0.05),表明地理隔離可能促進(jìn)兩個(gè)物種間的遺傳分化。然而,FST與12個(gè)代表性環(huán)境因子間的Mantle檢驗(yàn)均不顯著,表明IBE模式在驅(qū)動帶葉兜蘭和同色兜蘭的種群分化過程中的作用可能不太明顯。

    NS,*,**,and *** represent the significance of P>0.05,P<0.05,P<0.01,respectively.

    3 討論

    本研究利用10個(gè)多態(tài)性EST-SSR位點(diǎn)比較了四季開花型同色兜蘭和春季開花型帶葉兜蘭的遺傳多樣性水平,并發(fā)現(xiàn)前者的遺傳多樣性水平顯著低于后者。物種的遺傳多樣性可能受到分布范圍的影響,許多狹窄分布的瀕危物種的遺傳多樣性水平都較低[19,20]。張央等[4]對全國蘭科兜蘭屬寬瓣亞屬(PaphiopediumSubgen.Brachypelalum)植物的一項(xiàng)專項(xiàng)調(diào)查研究結(jié)果顯示,目前野生同色兜蘭的自然分布區(qū)域已經(jīng)縮小到廣西西南地區(qū),因此更狹窄的自然分布范圍和更小的有效種群數(shù)量可能解釋了同色兜蘭更低的遺傳多樣性。帶葉兜蘭的高遺傳多樣性可能與其個(gè)體間豐富的遺傳變異有關(guān),AMOVA結(jié)果顯示,帶葉兜蘭中來自個(gè)體內(nèi)的遺傳變異達(dá)77.5%,這與徐言等[10]的研究結(jié)果類似;而同色兜蘭中來自個(gè)體內(nèi)的遺傳變異僅為40.5%。此外,物種的遺傳多樣性水平還可能受到多樣化的種群進(jìn)化歷史的影響[21-23]。例如,孫藝琦等[21]發(fā)現(xiàn)單葉蔓荊(Vitexrotundifolia)與蔓荊(V.trifolia)的種群曾經(jīng)歷過瓶頸效應(yīng),并導(dǎo)致了兩者較低的遺傳多樣性。種群瓶頸的原因主要包括兩方面:一是人工選擇壓力,二是奠基者效應(yīng)[24]。通常,野生植物種群的瓶頸效應(yīng)主要是由奠基者效應(yīng)引起的。本研究在同色兜蘭的部分種群中檢測到了顯著的瓶頸效應(yīng),但在帶葉兜蘭中未檢測到,表明在種群形成歷史中曾遭遇的瓶頸效應(yīng)可能導(dǎo)致同色兜蘭喪失部分的遺傳多樣性。

    本研究中帶葉兜蘭的DY-YC種群和DY-XKR種群分別與徐言等[10]研究中的GYC和GML種群來源一致,但本研究評估的兩個(gè)就地保護(hù)種群的遺傳多樣性略低于徐言等[10]的評估結(jié)果。本研究使用了兼顧兩個(gè)物種(帶葉兜蘭和同色兜蘭)多態(tài)性的SSR位點(diǎn),因此這些位點(diǎn)在單一物種中的變異可能相對保守,從而低估了種群雜合度。此外,不同的采樣個(gè)體和采樣數(shù)量也可能影響對種群雜合度的評估。對自然保護(hù)區(qū)內(nèi)外的帶葉兜蘭種群的遺傳多樣性的比較結(jié)果表明,3個(gè)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)的就地保護(hù)種群的多態(tài)性指數(shù)(DY-XKR,I=0.597;DY-YC,I=0.578;DY-LX,I=0.634)符合野生種群的標(biāo)準(zhǔn)(I=0.555-0.722),就地保護(hù)可以較好地保護(hù)野生帶葉兜蘭的遺傳多樣性。然而,位于廣西崇左白頭葉猴國家級自然保護(hù)區(qū)的同色兜蘭種群(TS-PR,I=0.109)遺傳多樣性則低于其他4個(gè)野生同色兜蘭種群。因此,為了更好地保護(hù)同色兜蘭的野生資源,建議進(jìn)一步擴(kuò)大自然保護(hù)區(qū)的范圍或者結(jié)合遷地保護(hù)措施。

    AMOVA和遺傳分化分析的結(jié)果均顯示,同色兜蘭種群的分化程度要高于帶葉兜蘭種群。較高的遺傳分化通常意味著基因流受限[25,26]。兜蘭屬物種大多采用欺詐性授粉的策略[27],這種傳粉策略風(fēng)險(xiǎn)很高,通常嚴(yán)重依賴專一的傳粉者;并且自然環(huán)境中的兜蘭屬物種還普遍存在種子萌發(fā)困難[28]的現(xiàn)象,這些都可能導(dǎo)致由花粉或者種子介導(dǎo)的基因流受限。與同色兜蘭不同,帶葉兜蘭具有非常強(qiáng)的營養(yǎng)繁殖能力,還可以通過走莖進(jìn)行營養(yǎng)繁殖[5],這種繁殖方式可以有效促進(jìn)種群規(guī)模的擴(kuò)大,并有可能增加種群間基因流的機(jī)會。

    基因流受限可能是由地理隔離或者環(huán)境隔離導(dǎo)致的,這與許多瀕?;蛱赜兄参锏奶幘愁愃?如地中海高山植物Sileneciliate[29]、中國北方瀕危的野薔薇(Rosarugosa)[30]、中國南方特有的篦子三尖杉(Cephalotaxusoliveri)[31]等。IBD和IBE的結(jié)果表明,地理隔離是影響同色兜蘭和帶葉兜蘭種群遺傳分化的主要因素,而環(huán)境隔離的影響較小。盡管此前一些研究模擬和分析了中國境內(nèi)兜蘭屬植物的地理分布格局,發(fā)現(xiàn)一些環(huán)境變量如晝夜溫差、年平均氣溫變化范圍、最暖季度平均氣溫、太陽輻射、水蒸氣壓等對兜蘭屬植物的自然地理分布格局具有重要影響[4,32],但是本研究并未發(fā)現(xiàn)環(huán)境變量對同色兜蘭和帶葉兜蘭種群分化具有顯著影響。一方面,人為因素的存在可能會削弱IBE的影響,特別是考慮到帶葉兜蘭和同色兜蘭野生植株經(jīng)常遭受非法采摘;另一方面,由于本研究的采樣范圍局限于廣西,在相對小的尺度下IBE的作用可能并不明顯。因此,對IBE模式在兜蘭屬物種種群分化過程中的作用的進(jìn)一步探究需要結(jié)合更大范圍的采樣。

    同色兜蘭是兜蘭屬中罕見的四季開花型物種,但分布較狹窄。與同色兜蘭相比,盡管帶葉兜蘭花期短,但是其自然分布面積較廣,適生區(qū)范圍較大。因此,通過開展兩個(gè)物種之間的雜交有望從中選育出一些花期長且適應(yīng)性強(qiáng)的優(yōu)良品種,以滿足日益增長的市場需求,并且能更好地保護(hù)野生兜蘭資源。此前對兜蘭屬物種的雜交研究發(fā)現(xiàn),在帶葉兜蘭、杏黃兜蘭(P.armeniacum)、硬葉兜蘭和同色兜蘭的16種雜交及自交組合類型中,同色兜蘭×帶葉兜蘭的雜交結(jié)實(shí)率最高,達(dá)93.1%[33]。一般而言,蘭科物種間的親緣關(guān)系越近則雜交親和性越高[34]。而本研究的NJ樹和UPGMA樹的結(jié)果顯示,在5個(gè)兜蘭屬物種中,同色兜蘭與帶葉兜蘭間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近,因此,該結(jié)果為同色兜蘭和帶葉兜蘭間的高雜交率提供了有力的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)證據(jù)支持。此外,這些系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系信息還可以用于指導(dǎo)今后兜蘭屬的優(yōu)良品種選育,例如,在UPGMA樹中發(fā)現(xiàn)同色兜蘭的TS-JH和TS-WP種群與帶葉兜蘭的DY-HJ種群的遺傳距離均較為接近,因此,這些種群可以優(yōu)先作為開展雜交試驗(yàn)的材料。然而鑒于SSR位點(diǎn)提供的遺傳信息有限,對于兜蘭屬物種間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的進(jìn)一步闡明還需要借助更全面的基因組信息,如簡化基因組或全基因組數(shù)據(jù)。

    猜你喜歡
    兜蘭同色種群
    邢氏水蕨成功繁衍并建立種群 等
    兜蘭兜蘭你像啥
    給你看我的小兜兜
    配襪子
    山西省發(fā)現(xiàn)刺五加種群分布
    3種兜蘭屬植物光合特性的比較研究*
    卷首語
    首屆世界兜蘭大會在夏威夷舉行
    花卉(2015年7期)2015-10-22 06:12:34
    大與奇
    剪不斷的手絹
    亚洲综合精品二区| 成人国产麻豆网| h日本视频在线播放| 成人午夜精彩视频在线观看| 另类亚洲欧美激情| 亚洲精品456在线播放app| 久久久久性生活片| 综合色丁香网| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 国产成人免费观看mmmm| 国产精品成人在线| 精品国产露脸久久av麻豆| 成人毛片a级毛片在线播放| 免费看a级黄色片| 日韩制服骚丝袜av| 在线观看国产h片| 国精品久久久久久国模美| 久久久久九九精品影院| 国产精品久久久久久精品古装| 午夜免费男女啪啪视频观看| 大陆偷拍与自拍| 亚洲精品视频女| 精品国产乱码久久久久久小说| 高清av免费在线| 91在线精品国自产拍蜜月| 男人爽女人下面视频在线观看| 欧美3d第一页| 一级爰片在线观看| 熟女电影av网| 哪个播放器可以免费观看大片| 国产男人的电影天堂91| av国产久精品久网站免费入址| 毛片女人毛片| 乱系列少妇在线播放| 成年人午夜在线观看视频| 成年人午夜在线观看视频| 国产一级毛片在线| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 十八禁网站网址无遮挡 | 中文在线观看免费www的网站| 成人亚洲精品av一区二区| 免费黄色在线免费观看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲精品一区蜜桃| av线在线观看网站| 全区人妻精品视频| 一区二区av电影网| 欧美激情在线99| 男人和女人高潮做爰伦理| 亚洲精品456在线播放app| 亚洲美女搞黄在线观看| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 中文欧美无线码| 精品人妻视频免费看| 午夜福利在线在线| 中文字幕av成人在线电影| 国产免费一级a男人的天堂| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 黄色配什么色好看| 日韩成人伦理影院| 国产成人午夜福利电影在线观看| 成人一区二区视频在线观看| 亚洲在线观看片| 伊人久久国产一区二区| 国产午夜精品一二区理论片| 男人舔奶头视频| 最近最新中文字幕免费大全7| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 亚洲国产精品成人久久小说| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 久久女婷五月综合色啪小说 | 国产国拍精品亚洲av在线观看| 在线观看免费高清a一片| 韩国av在线不卡| 亚洲人成网站高清观看| 在线天堂最新版资源| 亚洲伊人久久精品综合| 好男人视频免费观看在线| 成人鲁丝片一二三区免费| 青春草视频在线免费观看| 亚洲av二区三区四区| 亚洲av国产av综合av卡| 美女主播在线视频| 午夜福利视频精品| 亚洲美女搞黄在线观看| 三级经典国产精品| 国产精品久久久久久精品电影| av国产久精品久网站免费入址| 日韩强制内射视频| 亚洲va在线va天堂va国产| 极品教师在线视频| 99re6热这里在线精品视频| 男的添女的下面高潮视频| 99热网站在线观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 简卡轻食公司| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲色图av天堂| 日本与韩国留学比较| 97在线视频观看| 一本一本综合久久| 别揉我奶头 嗯啊视频| 国产探花极品一区二区| 亚洲av中文av极速乱| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 97热精品久久久久久| 国产乱来视频区| 真实男女啪啪啪动态图| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产成人免费观看mmmm| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 亚洲精品影视一区二区三区av| 性色av一级| 午夜免费男女啪啪视频观看| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 麻豆国产97在线/欧美| 熟女人妻精品中文字幕| 免费av观看视频| 日韩欧美 国产精品| 99久久中文字幕三级久久日本| 国精品久久久久久国模美| 少妇 在线观看| 国产伦理片在线播放av一区| 哪个播放器可以免费观看大片| 99九九线精品视频在线观看视频| 美女高潮的动态| 成年女人在线观看亚洲视频 | 卡戴珊不雅视频在线播放| 三级国产精品片| 久久久精品免费免费高清| 欧美xxⅹ黑人| 国产亚洲91精品色在线| 午夜老司机福利剧场| 久久久久久久大尺度免费视频| 欧美人与善性xxx| 亚洲av国产av综合av卡| 色视频在线一区二区三区| 久久人人爽人人片av| 久久久精品免费免费高清| 亚洲欧美日韩东京热| 亚洲国产高清在线一区二区三| 日韩伦理黄色片| 丝袜美腿在线中文| 亚洲av在线观看美女高潮| 秋霞伦理黄片| 欧美人与善性xxx| av天堂中文字幕网| av网站免费在线观看视频| 亚州av有码| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲国产精品国产精品| 精品熟女少妇av免费看| 久久久国产一区二区| 97精品久久久久久久久久精品| 秋霞伦理黄片| 寂寞人妻少妇视频99o| 一区二区三区精品91| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 日韩av免费高清视频| 久久国内精品自在自线图片| 国产 一区 欧美 日韩| 国产成人精品福利久久| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产黄色视频一区二区在线观看| 成人欧美大片| 久久精品人妻少妇| 精品久久久久久久末码| 国产日韩欧美在线精品| 亚洲精品自拍成人| 搡老乐熟女国产| 成人亚洲精品av一区二区| 成年版毛片免费区| av免费在线看不卡| 精品一区二区三区视频在线| 成人欧美大片| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 久久久精品94久久精品| 少妇 在线观看| 成人欧美大片| 少妇人妻久久综合中文| 麻豆成人午夜福利视频| 中文资源天堂在线| 成人免费观看视频高清| 国国产精品蜜臀av免费| 国产乱来视频区| 伦精品一区二区三区| 男人舔奶头视频| 日日摸夜夜添夜夜爱| 高清毛片免费看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 精品一区二区免费观看| 老司机影院成人| 日韩成人伦理影院| 美女主播在线视频| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| videos熟女内射| 99视频精品全部免费 在线| 高清日韩中文字幕在线| 男人和女人高潮做爰伦理| 99re6热这里在线精品视频| 美女主播在线视频| 大香蕉97超碰在线| 人人妻人人看人人澡| 亚洲av中文av极速乱| 亚洲精品国产成人久久av| 99热6这里只有精品| kizo精华| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 久久6这里有精品| 女人被狂操c到高潮| 黄色配什么色好看| 精品午夜福利在线看| 久久久久网色| 18+在线观看网站| 国产精品久久久久久精品电影| 婷婷色综合www| 联通29元200g的流量卡| 久久国产乱子免费精品| 国产成人午夜福利电影在线观看| 亚洲自偷自拍三级| 国产美女午夜福利| 99久久九九国产精品国产免费| 搡女人真爽免费视频火全软件| 久久6这里有精品| 国产大屁股一区二区在线视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲精品国产成人久久av| 欧美3d第一页| 日本免费在线观看一区| 91久久精品国产一区二区成人| 精品人妻一区二区三区麻豆| 在线看a的网站| 亚洲精品国产色婷婷电影| 成人二区视频| 免费av不卡在线播放| 国产精品爽爽va在线观看网站| 免费看日本二区| 网址你懂的国产日韩在线| 我的女老师完整版在线观看| 亚洲av免费高清在线观看| 亚洲最大成人中文| 亚洲精品色激情综合| 亚洲人与动物交配视频| 国产一区二区三区综合在线观看 | 国产极品天堂在线| 亚洲精品影视一区二区三区av| 亚洲人成网站在线播| 午夜福利网站1000一区二区三区| 日本爱情动作片www.在线观看| 内地一区二区视频在线| 久久久亚洲精品成人影院| 色视频在线一区二区三区| 日本三级黄在线观看| av天堂中文字幕网| 亚洲国产欧美人成| videos熟女内射| 亚洲精品视频女| 免费观看无遮挡的男女| 免费人成在线观看视频色| av在线观看视频网站免费| 69人妻影院| 国产 一区 欧美 日韩| 日韩人妻高清精品专区| 免费观看性生交大片5| 黄色欧美视频在线观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 能在线免费看毛片的网站| 秋霞伦理黄片| 草草在线视频免费看| 精品久久久精品久久久| 国产伦精品一区二区三区四那| 日日撸夜夜添| 国产 精品1| 日本熟妇午夜| 午夜激情久久久久久久| 特大巨黑吊av在线直播| 永久免费av网站大全| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 亚洲精品,欧美精品| 99久国产av精品国产电影| 白带黄色成豆腐渣| 91在线精品国自产拍蜜月| 午夜免费男女啪啪视频观看| 久久精品综合一区二区三区| 日韩一区二区视频免费看| 97超视频在线观看视频| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| eeuss影院久久| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 五月天丁香电影| 在线a可以看的网站| 亚洲,一卡二卡三卡| 久热这里只有精品99| 精品国产三级普通话版| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产黄片美女视频| 亚洲四区av| 一区二区三区精品91| 亚洲高清免费不卡视频| 亚洲经典国产精华液单| av卡一久久| 欧美+日韩+精品| 国国产精品蜜臀av免费| 免费少妇av软件| 久久久久久伊人网av| 18禁动态无遮挡网站| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产淫片久久久久久久久| 国产毛片a区久久久久| 精品午夜福利在线看| 热re99久久精品国产66热6| 欧美区成人在线视频| 精品午夜福利在线看| a级毛色黄片| 色综合色国产| 国产成年人精品一区二区| 色婷婷久久久亚洲欧美| 久热这里只有精品99| 免费观看a级毛片全部| 一二三四中文在线观看免费高清| 欧美高清性xxxxhd video| 在线看a的网站| 国产视频首页在线观看| 免费看av在线观看网站| 国产伦在线观看视频一区| 少妇被粗大猛烈的视频| 欧美一区二区亚洲| 国产69精品久久久久777片| 亚洲色图av天堂| 国产精品福利在线免费观看| 久久久久久久午夜电影| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 男插女下体视频免费在线播放| 国产久久久一区二区三区| 国产黄片美女视频| 国产视频首页在线观看| 乱码一卡2卡4卡精品| 日韩av在线免费看完整版不卡| 69av精品久久久久久| 观看免费一级毛片| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 毛片一级片免费看久久久久| av专区在线播放| 又大又黄又爽视频免费| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲精品一二三| 只有这里有精品99| 毛片女人毛片| 在线精品无人区一区二区三 | 熟女av电影| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 午夜爱爱视频在线播放| 亚洲成色77777| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 秋霞在线观看毛片| 免费观看av网站的网址| 69av精品久久久久久| 国产伦精品一区二区三区四那| 精品久久久久久久久亚洲| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲性久久影院| 七月丁香在线播放| 六月丁香七月| 欧美+日韩+精品| 男的添女的下面高潮视频| 午夜激情久久久久久久| 亚洲精品日本国产第一区| 高清毛片免费看| 免费av不卡在线播放| 亚洲美女视频黄频| 一个人观看的视频www高清免费观看| 夜夜爽夜夜爽视频| 日韩一本色道免费dvd| av国产久精品久网站免费入址| 欧美日本视频| 国产精品人妻久久久影院| 男女那种视频在线观看| 婷婷色综合大香蕉| 极品教师在线视频| 午夜福利在线在线| 嫩草影院精品99| 色5月婷婷丁香| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产高潮美女av| 校园人妻丝袜中文字幕| 精品久久久噜噜| 日韩精品有码人妻一区| 一本一本综合久久| 午夜精品国产一区二区电影 | 白带黄色成豆腐渣| 日韩伦理黄色片| 毛片一级片免费看久久久久| 亚洲美女搞黄在线观看| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 不卡视频在线观看欧美| 国产亚洲91精品色在线| 高清在线视频一区二区三区| 五月伊人婷婷丁香| 熟女人妻精品中文字幕| 欧美xxⅹ黑人| 日韩欧美精品免费久久| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 免费大片18禁| 联通29元200g的流量卡| 久久久久久国产a免费观看| 男女那种视频在线观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 99热全是精品| 成年女人看的毛片在线观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| kizo精华| 男女边吃奶边做爰视频| 国产成人a区在线观看| 亚洲天堂av无毛| 97精品久久久久久久久久精品| 欧美三级亚洲精品| 欧美激情在线99| 欧美日本视频| 免费看a级黄色片| 看非洲黑人一级黄片| 成人二区视频| www.av在线官网国产| 少妇被粗大猛烈的视频| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 最后的刺客免费高清国语| 国产69精品久久久久777片| 永久网站在线| 亚洲,一卡二卡三卡| 国产伦在线观看视频一区| 激情五月婷婷亚洲| 国产综合懂色| 亚洲欧美精品自产自拍| 少妇人妻久久综合中文| av国产精品久久久久影院| tube8黄色片| 国产精品久久久久久精品电影| 特大巨黑吊av在线直播| 免费看a级黄色片| 五月天丁香电影| 一个人看的www免费观看视频| 国产黄a三级三级三级人| tube8黄色片| 国产男女超爽视频在线观看| 日韩亚洲欧美综合| 午夜福利在线在线| 久久久久久久国产电影| 成人毛片a级毛片在线播放| 99热6这里只有精品| 国产精品一区二区在线观看99| 日本爱情动作片www.在线观看| 熟女av电影| 国产一区亚洲一区在线观看| av国产精品久久久久影院| 在线精品无人区一区二区三 | 亚洲天堂av无毛| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 亚洲国产色片| 日韩欧美一区视频在线观看 | 午夜激情久久久久久久| 黄色欧美视频在线观看| 日韩一本色道免费dvd| 亚洲精品456在线播放app| 蜜臀久久99精品久久宅男| 一二三四中文在线观看免费高清| 岛国毛片在线播放| 亚洲国产欧美人成| 国产欧美亚洲国产| 国产精品熟女久久久久浪| 亚洲精品亚洲一区二区| 国产91av在线免费观看| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 久久亚洲国产成人精品v| 在线观看免费高清a一片| 亚洲欧美精品自产自拍| 性色av一级| 少妇人妻久久综合中文| 欧美变态另类bdsm刘玥| 一个人观看的视频www高清免费观看| 欧美xxⅹ黑人| 啦啦啦啦在线视频资源| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 可以在线观看毛片的网站| 天美传媒精品一区二区| av.在线天堂| 国产中年淑女户外野战色| 最新中文字幕久久久久| 成人一区二区视频在线观看| 亚洲色图综合在线观看| 寂寞人妻少妇视频99o| 天堂俺去俺来也www色官网| 日本wwww免费看| 成人欧美大片| 91久久精品国产一区二区成人| 大话2 男鬼变身卡| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲精品色激情综合| 色5月婷婷丁香| 日韩欧美精品免费久久| 国产精品国产三级专区第一集| 中文字幕免费在线视频6| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲精品国产av成人精品| 日日啪夜夜撸| 别揉我奶头 嗯啊视频| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 国精品久久久久久国模美| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲av男天堂| 免费看不卡的av| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 中文字幕制服av| 国产av不卡久久| 久久久久国产网址| 老司机影院成人| 免费观看a级毛片全部| 国产成人精品一,二区| 亚洲av一区综合| 精品国产露脸久久av麻豆| 国产精品国产三级国产专区5o| 美女国产视频在线观看| 中文资源天堂在线| 日本一二三区视频观看| 深夜a级毛片| av在线老鸭窝| 色视频在线一区二区三区| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 免费看av在线观看网站| 国产男人的电影天堂91| 岛国毛片在线播放| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产精品av视频在线免费观看| 国产在线男女| 97热精品久久久久久| 免费高清在线观看视频在线观看| 老女人水多毛片| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 精品久久久久久电影网| 欧美高清成人免费视频www| 亚洲国产最新在线播放| av播播在线观看一区| 一级爰片在线观看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 制服丝袜香蕉在线| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 九草在线视频观看| 国产精品一区www在线观看| eeuss影院久久| 人妻 亚洲 视频| 男男h啪啪无遮挡| freevideosex欧美| 国产色爽女视频免费观看| 欧美一区二区亚洲| av在线蜜桃| 特大巨黑吊av在线直播| 夫妻午夜视频| 最近中文字幕2019免费版| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 日本午夜av视频| 亚洲丝袜综合中文字幕| 精品久久久久久久末码| 久久99精品国语久久久| 国产成人精品一,二区| 久久6这里有精品| 男女啪啪激烈高潮av片| 高清在线视频一区二区三区| 一级毛片久久久久久久久女| 国产免费福利视频在线观看| 国产91av在线免费观看| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 人体艺术视频欧美日本| 亚洲成人一二三区av| 九色成人免费人妻av| 三级经典国产精品| 99热这里只有是精品在线观看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 免费看光身美女| 亚洲人与动物交配视频| 日韩大片免费观看网站| 亚洲国产日韩一区二区| 国产 精品1| av免费在线看不卡| 日本熟妇午夜| 少妇人妻精品综合一区二区| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 啦啦啦在线观看免费高清www| 成年版毛片免费区| 国产视频内射| av又黄又爽大尺度在线免费看| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲国产精品成人久久小说| 亚洲国产精品专区欧美| 人妻一区二区av| 国产人妻一区二区三区在| 亚洲综合色惰| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 久久久久国产精品人妻一区二区| 少妇人妻久久综合中文| 国产探花极品一区二区| 51国产日韩欧美| 色吧在线观看| 国产毛片a区久久久久| 国产乱来视频区| 国产av不卡久久| 欧美日韩综合久久久久久| 欧美成人精品欧美一级黄|