基于動物實驗和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究艾納香對急性肝損傷保護作用機制

關(guān)寧寧，黃涌澤，陳玥，白宏羽，宋彬彬，黃火強

（中央民族大學(xué)藥學(xué)院，民族醫(yī)藥教育部重點實驗室，北京 100081）

肝臟是人類重要的代謝和解毒器官，急性肝損傷（ALI）以患者的功能性肝細(xì)胞迅速損害為特征，藥物中毒、病毒感染、免疫反應(yīng)和代謝紊亂等多種因素均可引發(fā)肝臟的病變[1]，但是目前臨床治療手段和干預(yù)效果較差，病死率較高[2]。近年來中藥在治療ALI方面取得一定成果，其主要作用機制包括抑制體內(nèi)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)及肝細(xì)胞纖維化和肝細(xì)胞凋亡[3]。

艾納香[Blumea balsamifera（L）DC．]是菊科艾納香屬多年生草本植物，歸肝、脾經(jīng)，具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕、活血消腫、消炎鎮(zhèn)痛等功效，是中國常用中藥和民族藥，在少數(shù)民族地區(qū)有著悠久的入藥歷史。彝族人民常用其治療頭風(fēng)頭痛、風(fēng)濕痹??；藏族稱其治一切熱?。换Z族用其根葉治療肝炎?，F(xiàn)代研究表明艾納香具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、消炎等多種藥理活性[4]，能夠抑制脂質(zhì)過氧化、清除自由基，有明顯的抗氧化作用，對于肝損傷具有保護作用[5-6]，但是其作用機制不清楚、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確，有待深入研究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為藥理學(xué)的分支學(xué)科，其通過建立藥物與病證的關(guān)聯(lián)機制，為中醫(yī)藥的研究提供了系統(tǒng)性的思路和方法。研究基于動物實驗和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)驗證艾納香對ALI的保護作用，探討艾納香對于ALI的保護機制和藥效關(guān)鍵成分，以期為艾納香治療ALI的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 昆明小鼠，SPF級，雄性，8周齡，體質(zhì)量（22±2）g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK（京）2019-0010。通過中央民族大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)，飼養(yǎng)于中央民族大學(xué)藥學(xué)院實驗動物中心。每日12 h照明，環(huán)境溫度為（25±2）℃。實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，自由飲食水。

1.2 藥品、試劑與儀器 艾納香藥材購買自河北安國藥材市場，陽性藥水飛薊賓（批號D0916A）購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT，批號 20211223），谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST，批號 20211222）試劑盒購自南京建成生物工程有限公司；四氯化碳（CCl4分析純，批號20211120）購自利安隆博華（天津）醫(yī)藥化學(xué)有限公司，使用時用花生油配制成0.2%的花生油溶液。Epoch Biotek全波長酶標(biāo)儀（美國Biotek公司），ST 16R高速離心機（美國Thermo Fisher公司）。

1.3 數(shù)據(jù)庫及軟件 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以及分子對接涉及的主要數(shù)據(jù)庫及軟件有 TCMSP（https：//www.tcmsp-e.com/）、Uniport數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）、PubChem 數(shù) 據(jù) 庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、SwissADME平臺（http：//www.swissadme.ch/）、GeneCards（http：//www.genecards.org/）、OMMI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）、String 數(shù)據(jù)庫（https：//www.string-db.org/）、PDB 數(shù) 據(jù) 庫（http：//www.rcsb.org/）和 Metascape 平臺（https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1）、Cytoscape3.8.2 軟件、Autodock4.2軟件、Pymol 2.5軟件。

2 方法

2.1 動物分組、給藥及造模 健康雄性小鼠隨機分為對照組、模型組、陽性藥組（100 mg/kg）、水提物組和醇物提組（生藥14.32 g/kg）。各組按照體質(zhì)量灌胃給藥，連續(xù)12 d。第12次給藥2 h后，除對照組腹腔注射花生油外，其余各組腹腔注射0.2%CCl4花生油溶液（10 mL/kg）建立急性肝損傷模型，12 h禁食不禁水。24 h后稱量體質(zhì)量，摘除眼球取血，頸椎脫臼處死，剝離肝臟用生理鹽水洗凈，濾紙吸干水分后稱質(zhì)量并計算肝臟指數(shù)。

2.2 指標(biāo)檢測 血清室溫靜置1 h后，4 500 r/min離心10 min，離心半徑為6.75 cm，吸取上清液，按照生化試劑盒說明書分別對血清中ALT、AST水平進(jìn)行檢測。

2.3 艾納香活性成分篩選和靶點預(yù)測 通過TCMSP、HERB數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)檢索獲得艾納香的化學(xué)成分，通過PubChem化學(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nl-m.nih.gov/）確認(rèn)檢索所得化合物相關(guān)信息。借助SwissADME平臺（http：//www.swissadme.ch/）進(jìn)行篩選，選取胃腸吸收（Pharmacokinetics-GIabsorption）為“High”且成藥性（Druglikeness）至少滿足兩個“Yes”的成分作為潛在活性成分。利用潛在活性成分的SMILES號在SwissTargetPrediction 平臺（http：//swisstargetprediction.ch/）進(jìn)行檢索，獲得活性成分相關(guān)基因靶點。

2.4 ALI相關(guān)靶點的篩選 以“acute liver injury”、“acute liver damage”“acute hepatotoxicity”為關(guān)鍵詞在GeneCards（http：//www.genecards.org/）、OMIM 數(shù)據(jù)庫（http：//www.omim.org）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，獲得疾病相關(guān)基因，對所獲得的靶點信息進(jìn)行合并去重，獲得ALI相關(guān)靶點。

2.5 艾納香治療ALI潛在靶點預(yù)測 將活性成分靶點和疾病靶點導(dǎo)入 Venny 2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）中進(jìn)行可視化處理，得到交集靶點即為艾納香治療ALI的潛在靶點。

2.6 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將所得的交集靶點導(dǎo)入 String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），隱藏其中的游離節(jié)點，獲得蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，借助Cytoscape3.9.1軟件進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)的可視化處理。使用Cytoscape3.9.1軟件中的CytoHubba插件對數(shù)據(jù)進(jìn)行拓?fù)浞治霁@得hub基因，即核心靶點基因。

2.7 “藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將艾納香活性成分和疾病靶點導(dǎo)入Cytoscape軟件中構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中活性成分和靶點用節(jié)點表示，節(jié)點之間的相互作用用邊表示。結(jié)合所得核心基因根據(jù)網(wǎng)絡(luò)度值分析篩選艾納香發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵成分。

2.8 GO和KEGG通路富集分析 借助Metascape平臺（https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1），對交集靶點進(jìn)行基因本體（GO）分析，包括生物過程（BP）、分子功能（MF）、細(xì)胞組成（CC），以及京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析。

2.9 分子對接 將篩選所得關(guān)鍵成分和核心靶點進(jìn)行分子對接。通過RCSB數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）和Pubchem數(shù)據(jù)庫檢索獲得核心靶點和關(guān)鍵成分的三維蛋白結(jié)構(gòu)。借助AutoDock1.5.7軟件，進(jìn)行分子對接，結(jié)果選取結(jié)合能最低且構(gòu)象較好的結(jié)合方式，通過PyMOL軟件進(jìn)行可視化。

2.10 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Graph Pad Prism8軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組數(shù)據(jù)間的兩兩比較采用單因素方差分析和LSD方法，兩組間的比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 艾納香對ALI小鼠肝臟指數(shù)及血清ALT、AST活性的影響 與正常組相比，模型組小鼠肝臟指數(shù)和血清ALT、AST活性顯著升高，表明其肝臟組織發(fā)生病變；與模型組相比，艾納香水提物組和醇提物組均可降低肝臟指數(shù)及ALT、AST的水平，其中水提物組對于肝臟指數(shù)和ALT水平的影響較醇提物顯著。見圖1。

圖1 艾納香提取物對小鼠肝臟指數(shù)（A）、ALT（B）、AST（C）的影響Fig.1 Effect of Blumea balsamifera extract on liver index(A)，ALT(B)，AST(C)in mice

3.2 艾納香活性成分篩選 通過數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)檢索共獲得85種化合物，經(jīng)SwissADME篩選后獲得36種活性成分。見表1。

表1 艾納香活性成分Tab.1 Active compounds of Blumea balsamifera

3.3 艾納香治療ALI潛在靶點預(yù)測 活性成分于SwissTargetPrediction平臺進(jìn)行靶點預(yù)測，獲得活性成分靶點445個，GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫檢索得到疾病靶點1 761個。繪制韋恩圖，得到171個艾納香潛在治療靶點。見圖2。

圖2 艾納香治療ALI潛在靶點Fig.2 Potential targets of Blumea balsamifera in the treatment of ALI

3.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析 PPI圖中節(jié)點表示各個靶點，連線表示互相作用，涉及170個節(jié)點，2 773條邊，節(jié)點越大，顏色越深，度值越大，即該靶點的相互作用越強，在網(wǎng)絡(luò)中的作用越關(guān)鍵。以CytoHubba插件中的Degree值作為條件對PPI中的靶點進(jìn)行篩選，選取排名前十的基因為絲氨酸/蘇氨酸激酶（AKT1）、血管內(nèi)皮生長因子 A（VEGFA）、表皮生長因子受體（EGFR）、雌激素受體（ESR1）、半胱氨酸蛋白酶（CASP3）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、為熱休克蛋白90α家族A級成員1（HSP90AA1）、缺氧誘導(dǎo)因子 1（HIF1A）、絲裂原活化蛋白激酶 3（MAPK3）、原癌基因酪氨酸激酶（SRC）作為本次研究的核心基因。見圖3。

圖3 交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network of intersection targets

3.5 “藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將交集靶點導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)屬性可知其中和核心靶點相關(guān)且度值排名前十的化合物為羥基芫花素（3-hydroxygenkwanin）、木犀草素（Luteolin）、山奈酚（Kaempferol）、芫花素（5，4'dihydroxy-7-methoxyflavone）、華良姜素（kumatakenin）、槲皮素-3，3＇-二甲醚 （Quercetin 3，3'-dimethyl etheh）、金圣草素（Chrysoeriol）、香葉木素（Diosmetin）、圣草酚（Eriodictyol）、5，3'-二羥基-7，4'-二甲氧基黃酮（Pilloin），表示此10種成分在治療ALI中發(fā)揮重要作用。見圖4。

圖4 藥物-活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Drug-component-traget-disease network

3.6 GO和KEGG富集分析 借助Metascape平臺對作用靶點進(jìn)行GO功能分析和KEGG通路富集。根據(jù)富集程度的P值由小到大選取排名前二十的條目分別進(jìn)行分析。GO功能富集顯示靶點的催化主要涉及蛋白磷酸化、氮化合物的細(xì)胞反應(yīng)、細(xì)胞遷移的正向調(diào)節(jié)、激酶活性的調(diào)節(jié)等生物過程。這些靶點主要影響膜筏、核周圍胞漿、受體復(fù)合物等細(xì)胞組分。并且影響蛋白激酶活性、蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、磷酸轉(zhuǎn)移酶活性等分子功能。KEGG富集氣泡圖顯示艾納香主要影響癌癥通路、PI3K-Akt信號通路、癌癥中的微小RNA、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、絲裂原活化蛋白激酶信號通路，表明艾納香治療ALI的信號通路主要與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)相關(guān)。見圖5、圖6。

圖5 艾納香治療ALI的GO功能分析Fig.5 GO function analysis of Blumea balsamifera in the treatment of ALI

圖6 KEGG通路富集分析Fig.6 KEGG pathway of Blumea balsamifera in the treatment of ALI

3.7 分子對接驗證 分子對接結(jié)果顯示，關(guān)鍵成分和核心靶點均能有效結(jié)合。其中核心靶點AKT1與其部分關(guān)鍵成分的對接結(jié)果，見圖7。

圖7 AKT1與關(guān)鍵成分分子對接模式圖Fig.7 Docking mode between traget AKT1 and key components

4 討論

CCl4誘導(dǎo)的ALI模型已廣泛用于肝保護藥物的研究中[7]，其主要是通過CCl4代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的自由基引起氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致肝細(xì)胞膜被破壞。在肝損傷發(fā)生過程中，血清中ALT和AST的活性會升高，因此，血清ALT和AST活性被用作肝損傷的生化標(biāo)志物[8]。研究中動物實驗結(jié)果表明，與模型組相比，艾納香提取物能夠降低小鼠血清中ALT、AST活性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），提示艾納香能夠有效保護肝細(xì)胞，治療CCl4引起的急性肝損傷。

“藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)表明羥基芫花素、木犀草素、山奈酚、芫花素、華良姜素、槲皮素-3，3＇-二甲醚、金圣草素、香葉木素、圣草酚、5，3'-二羥基-7，4'-二甲氧基黃酮等10種化合物是艾納香治療ALI的關(guān)鍵成分。研究表明羥基芫花素、華良姜素、圣草酚可抑制肝癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡[9-11]。木犀草素、山奈酚、槲皮素-3，3＇-二甲醚、金圣草素能夠提高抗氧化酶的活性，清除自由基，減輕脂質(zhì)過氧化，對肝組織產(chǎn)生保護作用[12-15]；芫花素和5，3'-二羥基-7，4'-二甲氧基黃酮能顯著降低炎癥介質(zhì)的水平[16]；香葉木素能夠抑制肝臟脂肪生成和炎癥反應(yīng)[17]。

根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)圖得到10個核心靶點AKT1、VEGFA、EGFR、ESR1、CASP3、IL1B、HSP90AA1、HIF1A、MAPK3、SRC。研究發(fā)現(xiàn)AKT1是肝癌發(fā)生的重要靶點，慢病毒介導(dǎo)Akt1 shRNA載體可抑制HepG2細(xì)胞增殖和侵襲，并促進(jìn)其凋亡，可作為肝癌的潛在治療靶點[18]；VEGFA在肝細(xì)胞再生和酒精性肝損傷、肝炎的治療中發(fā)揮重要作用[19]；EGFR通過激活后的p-EGFR調(diào)控ERK/MAPK下游信號通路，進(jìn)而調(diào)控人肝癌細(xì)胞的增殖[20]。ESR1通過下調(diào)mt的轉(zhuǎn)錄水平抑制人肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲[21]；研究表明可通過對CASP3的抑制來減輕酒精性肝損傷[22]；IL1B是一種高效促炎細(xì)胞因子，可介導(dǎo)炎癥疾病的發(fā)生[23]，參與許多炎癥反應(yīng)，如心肌梗塞、酒精性脂肪肝、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等；HSP90AA1具有抗肝纖維化作用和潛在的保肝作用[24]；HIF1A與肝組織中的氧化應(yīng)激密切相關(guān)，且可通過激活PPAR-αangptl4信號通路參與非酒精性脂肪肝病中的脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)[25]；MAPK3可促使炎癥因子IL-13表達(dá)，進(jìn)而加劇炎癥反應(yīng)，且相關(guān)研究表明可通過靶向MAPK信號通路抑制人肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[26]；Src家族蛋白激酶在生長、增殖、免疫調(diào)節(jié)等多種細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用[27]。分子對接結(jié)果顯示，核心靶點與關(guān)鍵成分均可自發(fā)結(jié)合，其中AKT1與關(guān)鍵成分的關(guān)聯(lián)程度最高，提示AKT1在艾納香治療ALI過程中的作用尤為重要。

KEGG富集主要涉及的通路有癌癥通路、PI3K-Akt信號通路、癌癥中的miRNA、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、MAPK信號通路等。其中PI3K-Akt通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、凋亡、代謝和血管生成，研究表明PI3K-Akt信號通路在ALI的防治中具有重要意義，如張華等[28]研究發(fā)現(xiàn)AcO-BOA可以抑制AKT的磷酸化，抑制PI3K-Akt信號通路，降低LPS所引起的炎癥反應(yīng)，對ALI起到防治作用。MAPKs信號通路是調(diào)節(jié)和控制細(xì)胞炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵途徑，誘導(dǎo)下游凋亡蛋白包括Bax、Bcl-2和Caspase-3的表達(dá)，在肝臟損傷、應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等方面起著重要調(diào)節(jié)作用[29]。馬志梅等[30]發(fā)現(xiàn)AO-I可通過調(diào)控MAPK信號通路進(jìn)而改善NF-κB p65介導(dǎo)的炎癥因子水平，從而減輕對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝毒性。

綜上所述，本研究通過動物實驗初步探究艾納香對急性肝損傷小鼠的保護作用，并運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法系統(tǒng)討論了其作用機制，提示艾納香可能通過作用于AKT1、VEGFA、EGFR等多個靶點，參與調(diào)控癌癥、PI3K-Akt等多條通路發(fā)揮其對急性肝損傷的保護作用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法可以定性地預(yù)測藥物成分與作用靶點的匹配關(guān)系，但不能準(zhǔn)確反映成分與靶點相互作用的量效關(guān)系、相互作用類型等信息，故本研究后續(xù)應(yīng)該對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出的潛在活性成分和作用靶點進(jìn)行體內(nèi)外實驗驗證，進(jìn)一步確證和闡明中藥艾納香發(fā)揮急性肝損傷保護作用的有效成分和藥理作用機制。