姜黃素-多巴胺納米藥物用于腦膠質(zhì)瘤細胞的化療-光熱聯(lián)合治療

江正平，張燕，王強松

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，天津 300192）

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，是原發(fā)性腦瘤的主要死亡原因，由于其惡性程度較高，預(yù)后差并且容易復(fù)發(fā)等特點，嚴重危害人類的生命健康[1]。腦膠質(zhì)瘤病死率較高，膠質(zhì)瘤患者的中位生存期一般小于1年，即使在有利的治療條件下，患者的術(shù)后生存期僅延長至2年左右[2]。因此，克服目前腦膠質(zhì)瘤治療的局限性，設(shè)計和制備安全高效的治療方式刻不容緩。

姜黃素（CUR）是從姜科植物姜黃、郁金、莪術(shù)的根莖中提取的天然多酚成分[3]，已被證實有抗炎[4]、抗菌[5]、抗氧化[6]、抗細胞增殖[7]和抗血管生成[8]等治療作用，近年來研究人員對CUR的抗腫瘤作用進行了大量的研究與探索，證明CUR能通過靶向包括生長因子、細胞因子、轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡的基因在內(nèi)的不同細胞信號通路來表現(xiàn)出抗腫瘤能力[9]；同時CUR安全性較高，即使在高劑量下對人體和動物的毒性也很低[10]。然而，CUR存在水中溶解性差、化學(xué)穩(wěn)定性差、口服人體生物利用度低以及半衰期和藥代動力學(xué)短[5，11]等問題，臨床上大大限制了CUR的應(yīng)用。

由于納米粒子的獨特特性，納米給藥系統(tǒng)可以提高CUR的化學(xué)穩(wěn)定性、溶解性和緩釋性，改善生物利用度、半衰期和細胞攝取[12]。聚多巴胺（PDA）具有良好的生物相容性和生物降解性，較高的黏附能力、負載能力和良好的光熱轉(zhuǎn)化性能，同時PDA也是一種具有多種刺激響應(yīng)釋藥機制的藥物遞送載體材料，在pH變化和近紅外光（NIR）的外源性刺激下可以達到可控釋放藥物的目的[13]。因此，本實驗將PDA作為藥物載體，制備了一種高穩(wěn)定性、低毒性、可控釋的CUR納米粒，研究納米粒的粒徑、載藥量、包封率、光熱效率、體外藥物釋放等參數(shù)，并在細胞水平上模擬了納米?？缭窖X屏障（BBB）行為，評價了細胞攝取和治療效果。

1 材料

1.1 細胞 大鼠腦膠質(zhì)瘤細胞C6-luc、人腦星形膠質(zhì)母細胞瘤細胞U87-luc，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞資源中心。培養(yǎng)條件：置于37℃、5%二氧化碳（CO2）、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 藥品及試劑 CUR（純度≥98%，美國Acros Organics公司）；鹽酸多巴胺（純度≥98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；DMEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（PBS，美國 Gibco公司）；Ham’s F-12K 培養(yǎng)基（上海源培生物科技股份有限公司）；胎牛血清（FBS，以色列Biological Industries公司）；單溶液細胞增殖檢測試劑盒（MTS，美國 Promega公司）；4’-6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液（北京索萊寶科技有限公司）。

1.3 儀器 粒徑分析儀（英國MALVERN公司，型號：Nano-ZS 90）；紫外-近紅外分光光度計（美國Perkinelmer公司，型號：Lambda35）；熒光分光光度儀，（日本 HORIBA 公司，型號：FluoroMax-4）；多功能全波長酶標儀（美國ThermoFisher公司，型號：ThermoVarioskan Flash3001）；激光掃描共聚焦倒置顯微鏡（德國 Carl ZEISS，型號：LSM710）。

2 方法

2.1 包封CUR的PDA納米粒（PDA@CUR NPs）的制備 1 mg CUR（乙醇溶液）與10 mg多巴胺（水溶液）溶于 5 mL 乙醇/水（1/2，V/V）溶劑中，磁力攪拌混勻。向體系中加入1 mol/L氫氧化鈉42 μL調(diào)節(jié)體系pH至弱堿性，50℃水浴磁力攪拌反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至透析袋中（截留分子量，14 000），二次水透析12 h。收集透析后的產(chǎn)物進行超濾濃縮，定容至1 mL，獲得PDA@CUR NPs混懸液，上述實驗操作過程均避光。

2.2 PDA@CUR NPs粒徑和光學(xué)特征 取適量PDA@CUR NPs溶液用蒸餾水稀釋后，放置于馬爾文粒徑分析儀Nano-ZS 90中進行分析，測定納米粒的粒徑大小、多分散系數(shù)（PDI）、表面Zeta電位及粒徑穩(wěn)定性。

取CUR、PDA 納米粒（PDANPs）、PDA@CURNPs溶液稀釋至CUR濃度10 μg/mL，用紫外分光光度計對其進行全波長掃描。

2.3 PDA@CUR NPs的載藥量及包封率 采用差量法測定CUR的包封率。納米粒置于透析袋中，浸入30 mL蒸餾水中，磁力攪拌快速透析2 h，換水5次，收集每次透析外液。熒光分光光度計測定上述溶液中殘余的CUR含量，CUR熒光激發(fā)波長426 nm，發(fā)射波長579 nm。取透析后的產(chǎn)物采用真空冷凍干燥方式凍干得到凍干粉，精確稱質(zhì)量。按照以下公式計算PDA@CUR NPs的載藥量和包封率。

載藥量（%）=納米粒中CUR的質(zhì)量/納米粒的質(zhì)量×100%

包封率（%）=納米粒中CUR的質(zhì)量/CUR的投藥量×100%

2.4 PDA@CUR NPs體外光熱轉(zhuǎn)換 取CUR、PDA NPs和PDA@CUR NPs用808 nm半導(dǎo)體激光器照射5 min，輻射強度為1 W/cm2，期間用紅外成像儀記錄溫度的變化，重復(fù)實驗3次。

2.5 PDA@CUR NPs體外釋藥行為研究 設(shè)置pH5.5和pH7.4的PBS緩沖液作為釋放介質(zhì)來模擬人體正常生理環(huán)境和腫瘤細胞的溶酶體微環(huán)境，同時添加0.5%的吐溫80為CUR增溶。將超濾濃縮后的PDA@CUR NPs加入到截留分子量7 000的透析袋中，放置于20 mL釋放外液中。將釋放體系37℃水浴中磁力攪拌，每次取樣前，將pH不同的兩個平行組別置于45℃水浴中加熱15min，以此來模擬NIR的外源性刺激。在設(shè)置好的時間點每次取樣5 mL，同時加入等體積的新釋放介質(zhì)。取出的釋放液通過熒光分光光度計測定熒光強度，計算CUR的含量，根據(jù)累積釋放率公式計算并繪制累積釋放曲線。

其中Qn是第n次取樣時藥物的累積釋放量，Cn是第n次取樣時釋放液中藥物的濃度，V0是溶出杯中模擬液的體積，V是每次取出的釋放液體積。

2.6 體外模擬PDA@CUR NPs跨越BBB和細胞攝取納米粒的行為考察 選用大鼠腦膠質(zhì)瘤細胞C6-luc和人腦星形膠質(zhì)母細胞瘤細胞U87-luc作為模型細胞，利用納米粒遷移實驗對納米?？缭紹BB的行為進行模擬，選用0.4 μm的帶孔小室模擬已受損的BBB，將 C6-luc和 U87-luc以 5×104個細胞/孔接種于24孔板中，納米粒置于帶孔小室中，共孵育24 h后用DAPI染色細胞核，利用激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

將兩種細胞接種于共聚焦小皿中，接種密度為1×105個細胞/皿，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄去原培養(yǎng)基，分別加入含CUR和PDA@CUR NPs的培養(yǎng)基，孵育12 h后，棄去培養(yǎng)基，4%組織固定液固定，之后用DAPI染色細胞核，加入0.2 mL PBS封閉，將樣品置于激光共聚焦顯微鏡下使用63倍油鏡觀察并拍照。

2.7 體外細胞毒性評價 采用MTS實驗評價納米粒的細胞毒性，以及納米粒協(xié)同光熱聯(lián)合治療對C6-luc和U87-luc兩種細胞的治療效果。設(shè)置空白對照組、游離CUR組以及PDA@CUR NPs組，將C6-luc細胞和U87-luc細胞按1×104個細胞/孔接種于96孔板中，孵育24 h后棄去原培養(yǎng)基，分別加入新鮮培養(yǎng)基、含CUR的培養(yǎng)基和含PDA@CURNPs的培養(yǎng)基，CUR濃度從5μg/mL逐漸上升至80μg/mL，12 h后，用808 nm半導(dǎo)體激光器照射2 min，輻射強度為1 W/cm2，之后繼續(xù)孵育12 h。孵育結(jié)束后PBS洗滌細胞，加入MTS溶液孵育1 h，用酶標儀在490 nm處測量吸光度值，使用無細胞的MTS溶液的吸光度進行校正。

3 結(jié)果

3.1 PDA@CUR NPs粒徑、粒徑穩(wěn)定性和光學(xué)特征 通過馬爾文粒徑分析儀Nano-ZS 90測定的PDA@CUR NPs平均粒徑為（275.1±5.6）nm，PDI為（0.167±0.020），相比于 PDA NPs的粒徑（180.2 nm）明顯增大，見圖1。7 d內(nèi)納米粒的粒徑和PDI穩(wěn)定性較好，見圖2A；納米粒的表面Zeta電位為-41.05mV，相比于PDANPs的Zeta電位（-37.34mV）明顯增大，見圖2B。紫外光譜表明CUR在426 nm有紫外特征吸收峰，CUR與PDA NPs混合后仍然能在426 nm觀察到CUR的特征吸收峰，但是在PDA@CUR NPs紫外光譜中發(fā)現(xiàn)CUR的吸收峰被屏蔽，見圖3。以上實驗結(jié)果說明PDA成功包載CUR形成納米粒，且納米粒的穩(wěn)定性和分散性良好。

圖1 PDA@CUR NPs與PDA NPs粒徑Fig.1 Particle size of PDA@CUR NPs and PDA NPs

圖2 PDA@CUR NPs粒徑穩(wěn)定性、多分散系數(shù)（A）和表面Zeta電位（B）Fig.2 PDA@CUR NPs size stability，polydispersity coefficient(A)and surface zeta potential(B)

圖3 PDA@CUR NPs、PDA NPs和游離CUR紫外光譜Fig.3 UV spectra of PDA@CUR NPs，PDA NPs and free curcumin

3.2 載藥量及包封率的測定 采用差量法測定未被PDA包載的CUR含量。通過熒光分光光度計以426 nm作為激發(fā)波長掃描游離CUR，在579 nm出現(xiàn)最大熒光發(fā)射波長，并且按濃度梯度測量得到CUR熒光標準曲線。根據(jù)公式計算得到納米粒的包封率為（81.73±2.22）%，載藥量為（11.41±0.27）%。

3.3 體外光熱轉(zhuǎn)換 體外光熱體外轉(zhuǎn)換實驗結(jié)果表明，PDA NPs和PDA@CUR NPs均表現(xiàn)出優(yōu)秀的光熱升溫行為。如圖4及圖5所示，在激光1 min后，納米粒組溫度能上升約12℃，5 min內(nèi)，納米粒組的溫度達到約45℃，而游離CUR 5 min內(nèi)僅上升了約4℃。實驗結(jié)果說明CUR在與PDA形成PDA@CUR NPs后受激光照射能夠持續(xù)穩(wěn)定產(chǎn)熱。

圖4 體外光熱轉(zhuǎn)換成像Fig.4 In vitro photothermal conversion imaging

圖5 體外光熱轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)分析Fig.5 In vitro photothermal conversion data analysis

3.4 體外釋藥行為結(jié)果分析 實驗中選用pH及溫度（模擬光熱升溫過程）兩個因素控制CUR的釋放行為。從圖6可知，CUR的釋放呈現(xiàn)出pH及溫度相關(guān)性，酸性pH及光熱升溫可以加速CUR的釋放。48 h后，在pH 7.4且無加熱的釋放環(huán)境中，CUR累積釋放量僅為27.92%，而在pH 5.5且有加熱的釋放環(huán)境中高達61.31%。這些結(jié)果表明，PDA@CUR NPs的藥物釋放有明顯的酸敏感性和NIR外源性刺激下的控釋性，有助于延長藥物在體內(nèi)的循環(huán)時間和在腫瘤組織定點釋放，降低藥物全身毒性，達到藥物可控制釋放的目的。

圖6 PDA@CUR NPs在不同pH及溫度下的體外釋放曲線Fig.6 In vitro release profiles of PDA@CUR NPs at different pH and temperatures

3.5 體外模擬PDA@CUR NPs跨越BBB和細胞攝取實驗 利用激光共聚焦顯微鏡觀察PDA@CUR NPs穿越0.4 μm的帶孔小室的情況，如圖 7（A）所示，綠色為CUR的熒光，藍色為DAPI標記的細胞核的熒光，可以發(fā)現(xiàn)納米粒能夠穿越0.4 μm的帶孔小室到達下室的膠質(zhì)瘤細胞，通過體外模擬實驗證明PDA@CUR NPs有跨越BBB的潛力。通過激光共聚焦顯微鏡分析C6-luc細胞和U87-luc細胞對游離CUR和PDA@CUR NPs的攝取情況以及藥物在細胞內(nèi)的分布。如圖7B所示，可以看出納米粒在與兩種腦膠質(zhì)瘤細胞共孵育12 h就已經(jīng)被腫瘤細胞成功攝取，并且納米粒進入細胞后主要分布在細胞質(zhì)中。實驗結(jié)果說明納米粒能夠攜帶藥物進入腦膠質(zhì)瘤細胞中。

圖7 體外模擬跨越BBB實驗和細胞攝取情況Fig.7 In vitro simulation of blood-brain barrier bypass experiments and cellular uptake

3.6 體外細胞毒性實驗 為了研究納米粒的細胞毒性以及CUR協(xié)同光熱治療對C6-luc細胞和U87-luc細胞的聯(lián)合治療效果，設(shè)置了不同藥物濃度配合光熱治療。如圖8所示，即使在CUR濃度80 μg/mL時孵育24 h，兩種腦膠質(zhì)瘤細胞的細胞存活率均在80%以上，說明PDA@CUR NPs對細胞活力影響較小，與對照組相比細胞存活率下降可能是由于CUR的緩慢釋放導(dǎo)致的。然而，在給藥12 h用激光照射治療后，納米粒激光組隨著CUR濃度升高細胞存活率明顯下降，治療效果明顯優(yōu)于空白激光組、游離CUR組和游離CUR激光組，說明納米粒光熱升溫后對膠質(zhì)瘤細胞有較強的殺傷作用；在CUR濃度在10 μg/mL以上時，聯(lián)合治療組相較游離CUR激光組的細胞存活率顯著降低，當CUR濃度40 μg/mL時兩種細胞存活率均降至50%以下，在CUR濃度80 μg/mL時C6-luc細胞的存活率僅為12%，見圖8A，U87-luc細胞的存活率僅為17%，見圖8B，結(jié)果表明，在NIR外源性的刺激下，CUR從納米粒中釋放出來，并且PDA在激光照射下產(chǎn)熱，兩者聯(lián)合殺死腦膠質(zhì)瘤細胞且治療效果良好。

圖8 體外細胞毒性實驗Fig.8 In vitro cytotoxicity assay

4 討論

CUR是一種有多種治療效果且一直受到研究者們關(guān)注的中藥活性成分，目前已有大量研究證明CUR 對肺癌[14]、乳腺癌[15]、肝癌[16]、胃癌[17]等有治療效果，但是CUR存在水溶性低、生物利用度低、代謝快和半衰期短等問題。相較于其他腫瘤，腦膠質(zhì)瘤由于BBB和血管腦腫瘤屏障（BBTB）的存在得大多數(shù)藥物難以越過BBB到達腫瘤部位，常規(guī)治療手段仍然是手術(shù)切除這一侵入性治療[19]。PDA具有良好的生物相容性、高附著力和出色的光熱轉(zhuǎn)換性能的作為藥物載體，已被廣泛應(yīng)用于藥物控釋遞送系統(tǒng)，實驗結(jié)果顯示PDA@CUR NPs粒徑分布均勻且穩(wěn)定，平均粒徑大于200 nm，有利于在腫瘤組織內(nèi)滯留[20]，納米粒表面帶負電荷更易于其在腫瘤組織的富集。PDA@CUR NPs具有較高的載藥量和包封率，顯著改善CUR水溶性低的問題；同時納米粒具有優(yōu)秀的光熱轉(zhuǎn)換能力，既能通過NIR的刺激將光能轉(zhuǎn)化為熱能，快速升溫殺傷腫瘤細胞，又能將PDA之間非共價π-π介導(dǎo)的相互作用破壞，有效觸發(fā)藥物釋放，將藥物的可控釋性與治療的微創(chuàng)性、高選擇性有機結(jié)合。在細胞水平上證明了PDA@CUR NPs有跨越BBB的潛力，能被腦膠質(zhì)瘤細胞快速攝取，且“CUR+光熱療法”能有效抑制人源和鼠源的腦膠質(zhì)瘤細胞增殖。實驗改善了CUR水溶性、穩(wěn)定性差、代謝快等問題，也為治療腦膠質(zhì)瘤的應(yīng)用上提供了新的思路，也為日后CUR在臨床上的應(yīng)用奠定了一定基礎(chǔ)。