半夏瀉心湯通過抑制炎癥抑制小鼠潰瘍性結(jié)腸炎*

張梁坤 ，谷文超 ，吳婷婷 ，李靈 ，吳秀花 ，張新生 ，韓濤 ，陳健

（1.濟南市中心醫(yī)院，濟南 250013；2.臨朐張新生中醫(yī)診所（新生堂），臨朐 262600；3.山東中醫(yī)藥大學，濟南 250355）

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是現(xiàn)階段國內(nèi)外公共衛(wèi)生領(lǐng)域面臨的重要挑戰(zhàn)，患者常出現(xiàn)腹痛、泄瀉、體質(zhì)量減輕甚或便血、膿血便等臨床表現(xiàn)，嚴重影響患者生活質(zhì)量，降低幸福感[1]；同時有研究證明，UC遷延不愈可導致直結(jié)腸癌的發(fā)生[2-4]。因此，積極探尋合理有效的UC防治方法迫在眉睫。半夏瀉心湯出自《傷寒雜病論》，是中國古代經(jīng)典名方之一。課題組前期經(jīng)循證及實驗研究發(fā)現(xiàn)，半夏瀉心湯單獨應(yīng)用或聯(lián)合應(yīng)用可通過調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)、外周及中樞5-羥色胺（5-HT）水平，促進Th1/Th2以及Th17/Treg免疫細胞平衡，改善局部炎癥反應(yīng)進而發(fā)揮治療UC 的作用[5-9]。

半夏瀉心湯中含有有毒藥物半夏，且原方中用量為半升，約為39.1 g，遠超《中華人民共和國藥典》（2020年版）[10]（以下簡稱《藥典》）中半夏的用量，故有關(guān)半夏的臨床用量亦被歷代醫(yī)家深入論述。文章基于半夏的不同用藥劑量組方以探究不同劑量的半夏瀉心湯防治UC的療效差異。生理狀態(tài)下，機體中抗炎因子與抑炎因子之間的動態(tài)平衡是維持機體健康的基本保證，而炎癥在UC的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用[11-13]，故UC患者體內(nèi)必存在各類炎癥因子的失衡。文章基于模型小鼠血清及局部結(jié)腸組織的炎癥因子含量探究半夏瀉心湯防治UC的作用機制。

本研究基于古代經(jīng)典名方原意及現(xiàn)代用藥法則，選用與原方中洗半夏最為接近的半夏現(xiàn)代炮制品——清半夏，且以半夏的原方用量及藥典最大用量為基準，依據(jù)半夏瀉心湯各藥物劑量比[14]進行組方（半夏瀉心湯古方量方及半夏瀉心湯藥典量方），干預右旋葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導建立的UC模型小鼠（DSS-UC小鼠）以探究不同劑量的半夏瀉心湯防治UC的療效差異及其作用機制。以期為經(jīng)典名方半夏瀉心湯的臨床合理應(yīng)用及UC的防治提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實驗動物 本研究選用的實驗動物為SPF級健康 C57BL/6J小鼠，雄性、6周齡（18～22 g），40只；其均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006，質(zhì)量合格證號：1100111911047707。

1.2 中藥材 清半夏（批號190501）、干姜（批號190101）、黃連（批號 180501）、黃芩（批號 190301）、人參（批號190401）、炙甘草（批號181106）和大棗（批號190506），以上藥物均采自山東百味堂中藥飲片有限公司，并經(jīng)山東中醫(yī)藥大學中藥鑒定學教研室主任徐凌川教授鑒定均為真品。分別精確稱取清半夏 39.10g、9.00g，干姜 46.90g、10.80g，黃連 15.60g、3.60 g，黃芩 46.90 g、10.80 g，人參 46.90 g、10.80 g，炙甘草 46.90 g、10.8 g和大棗 31.00 g、7.2 g組成半夏瀉心湯古方量方（總生藥量：273.30 g）和半夏瀉心湯藥典量方（總生藥量：63.00 g）。取上述兩劑藥分別加8倍量蒸餾水，冷浸120 min，大火開鍋后微沸煎煮30 min后，傾出藥液，趁熱過濾，去滓再煎至154 mL藥液；分別獲取半夏瀉心湯古方量方水煎液（生藥濃度：1.776 5 g/mL）和半夏瀉心湯藥典量方水煎液（生藥濃度：0.409 5 g/mL），4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑 右旋葡聚糖硫酸鈉（美國MP公司相對分子質(zhì)量36 000～50 000，批號S2839），冰醋酸（國藥集團化學試劑有限公司，批號10000218），伊紅（Solarbio，批號 E8090），中性樹脂（Solarbio，批號 G8590），蘇木素（Sevicebio，批號G1004），4%多聚甲醛（Biosharp，批號 69111800）。

儀器：正置顯微鏡（徠卡顯微系統(tǒng)有限公司，型號DM1000），恒溫烘箱（上海一恒科學儀器有限公司，型號DHG-9023A），石蠟切片機（徠卡顯微系統(tǒng)有限公司，型號RM2235），攤片烤片機（湖北康強醫(yī)療器械有限公司，型號TKD-TK），生物組織包埋機-冷凍機（泰維科技，型號TB-718L），生物組織包埋機（泰維科技，型號TB-718D），自動組織脫水機（湖北康強醫(yī)療器械有限公司，型號TKD-TSF），酶標儀（LabsystemsMultiskan，型號MS352型）。

2 方法

2.1 動物實驗設(shè)計 本研究采用C57BL/6J雄性小鼠，接受動物后置于觀察室觀察1周，期間通過體質(zhì)量區(qū)間分組法將32只小鼠隨機分為空白組、模型組、半夏瀉心湯古方量組（以下簡稱古方量組）和半夏瀉心湯藥典量組（以下簡稱藥典量組）；實驗開始后除空白組外所有小鼠自由飲用濃度為2.5%的DSS水溶液7 d；同時古方量組及藥典量組按0.2 mL/10 g給予相應(yīng)的中藥水煎液干預，空白組及模型組給予等量的滅菌水予以對照。干預7 d后，停止DSS水溶液自由飲用，古方量組及藥典量組繼續(xù)中藥干預1周。實驗第14天晚，所有小鼠禁食禁水12 h，隨后收集小鼠各類標本以供檢測。具體流程如圖1。

圖1 半夏瀉心湯防治潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型的實驗流程Fig.1 Experimental workflow of the prevention and treatment of ulcerative colitis mice model by Banxia Xiexin Decoction

本實驗過程中，所有實驗小鼠均飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級屏障環(huán)境設(shè)施（實驗動物使用許可證號為SYXK（魯）20170022）內(nèi)。實驗期間采用60Co滅菌大小鼠維持飼料。環(huán)境溫度（22±2）℃；相對濕度50%±5%；光照交替12/12 h。

本研究實驗方案經(jīng)山東中醫(yī)藥大學實驗動物福利倫理審查委員會審查通過，所有實驗操作嚴格遵循山東中醫(yī)藥大學動物倫理委員會相關(guān)規(guī)定進行。

2.2 UC動物模型復制 本研究采用C57BL/6J小鼠自由飲用濃度為2.5%的DSS水溶液7 d誘導建立UC模型。在誘導建模過程中，每籠小鼠給藥瓶充足且瓶中DSS溶液足量，以減少因小鼠競爭飲水而導致給藥量不足所帶來的偏倚。

2.3 實驗動物給藥 在實驗開始、動物造模之初同時予以中藥灌胃干預。具體如下：自實驗第1天起，各組小鼠每天于11∶00-13∶00灌胃1次，連續(xù)灌胃14 d。空白組、模型組予以生理鹽水灌胃（給藥量為0.2 mL/10 g）；古方量組、藥典量組則分別予以半夏瀉心湯古方量方（生藥濃度：1．776 5 g/mL）、藥典量方（生藥濃度：0．409 5 g/mL）水煎液灌胃（給藥量為0．2 mL/10 g）。

2.4 實驗動物 一般狀況的記錄實驗期間每日觀察、記錄實驗小鼠的飲食攝水量、糞便、被毛、活動和精神狀態(tài)、體質(zhì)量及死亡率等一般情況，并詳細記錄小鼠腹瀉及便血程度。同時根據(jù)文獻[15]方法計算疾病指數(shù)（DAI）值：DAI=體重指數(shù)+大便黏稠度指數(shù)+出血情況指數(shù)。各指標計算標準如下：體重指數(shù)（體質(zhì)量不變?yōu)?，下降1%～5%為1分，下降5%～10%為2分，下降10%～15%為3分，下降大于15%為4分）；大便黏稠度指數(shù)（正常為0，松散的大便為2分，腹瀉為4分）和大便出血指數(shù)（正常0分，隱血陽性為2分，顯性出血為4分）。

2.5 實驗動物標本的收集與檢測 1）通過小鼠眼眶后靜脈叢收集血液，4℃下靜置30 min后，在4℃、3 000 r/min條件下離心15 min，離心半徑12．5 cm，取上清，-80℃保存，供炎癥因子檢測。2）打開小鼠腹腔，摘取胸腺、肝、脾、腎臟，濾紙吸干殘血后稱質(zhì)量（g），計算臟器指數(shù)。3）分離腸管，水平拉直腸管測量腸管總長度及結(jié)腸長度（cm），稱取腸管總質(zhì)量及結(jié)腸質(zhì)量（g）。4）截取結(jié)腸近段及遠段，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗干凈，4%甲醛溶液固定保存，經(jīng)蘇木精-伊紅（HE）染色以觀察結(jié)腸組織病理損傷情況；截取結(jié)腸中間段用PBS沖洗干凈，-80℃保存，供炎癥因子檢測。

2.6 統(tǒng)計學方法 本研究數(shù)據(jù)分析、作圖采用Graphpad Prism 9統(tǒng)計學軟件包，并使用均數(shù)±標準差（±s）表示；多組間數(shù)據(jù)差異比較采用one-way ANOVA進行分析，組間兩兩比較采用LSD t-test。相關(guān)性分析則采用R version 3．5．3軟件進行計算及作圖。P＜0．05表示具有統(tǒng)計學差異。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠HE染色比較 為觀察半夏瀉心湯各方對DSS-UC模型小鼠局部組織的病理損傷的影響，分別對各組別小鼠結(jié)腸近段及遠段組織進行HE染色，以分析其局部組織病理學改變。HE染色結(jié)果顯示：空白組小鼠結(jié)腸組織近段及遠段均無明顯的炎癥浸潤，其黏膜完好、腸腺排列整齊，隱窩結(jié)構(gòu)無改變，可見大量杯狀細胞，見圖2A、B。DSS-UC模型小鼠則出現(xiàn)嚴重的炎性細胞浸潤，同時出現(xiàn)腸腺排列紊亂、上皮細胞黏液分泌減少，并伴有隱窩萎縮、分支等結(jié)構(gòu)改變，見圖2C、D。而藥物干預組結(jié)腸組織損傷均有顯著改善，上皮細胞完整性改善、黏液分泌增多，炎性細胞浸潤減少，杯狀細胞數(shù)量已顯著增加；且古方量組的改善優(yōu)于藥典量組，見圖 2E、F、G、H。

圖2 半夏瀉心湯防治潰瘍性結(jié)腸炎各組小鼠結(jié)腸組織病理變化（HE染色，×200）Fig.2 Pathological changes the prevention and treatment in colon tissue of ulcerative mice in each group of by Banxia Xiexin Decoction(HE staining，×200)

此結(jié)果表明，半夏瀉心湯可顯著改善DSS-UC模型小鼠結(jié)腸近段及遠段的組織病理學損傷，且古方量組療效優(yōu)于藥典量組。

3.2 各組臟器指數(shù)比較 臟器指數(shù)結(jié)果如圖3所示，與空白組相比，模型組小鼠的肝臟指數(shù)（P＜0．01）、脾臟指數(shù)（P＜0．01）、結(jié)腸指數(shù)（P＜0．01）、結(jié)總腸質(zhì)量比升高（P＜0．05），均具有統(tǒng)計學差異。結(jié)總腸長度比有上升趨勢，但無統(tǒng)計學差異（P＞0．05）；胸腺指數(shù)降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）。與模型組相比，兩給藥組小鼠胸腺指數(shù)、肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、結(jié)腸指數(shù)、結(jié)總腸長度比、結(jié)總腸質(zhì)量比均有不同程度的恢復，其中古方量組小鼠胸腺指數(shù)恢復明顯，具有統(tǒng)計學差異（P＜0．05）；藥典量方對小鼠結(jié)總腸長度比、結(jié)總腸質(zhì)量比的恢復明顯，而古方量方則對小鼠胸腺指數(shù)、肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)的恢復顯著。腎臟指數(shù)及結(jié)腸長度質(zhì)量比在各組別小鼠間無明顯差異。

圖3 半夏瀉心湯防治潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的臟器指數(shù)Fig.3 Organ index of the prevention and treatment in ulcerative colitis mice by Banxia Xiexin Decoction

此結(jié)果表明DSS-UC模型小鼠的肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、結(jié)腸指數(shù)、結(jié)總腸長度比、結(jié)總腸質(zhì)量比顯著高于正常小鼠，而胸腺指數(shù)則顯著低于正常小鼠，腎臟指數(shù)及結(jié)腸長度重量比則無顯著變化；半夏瀉心湯可不同程度的預防DSS造模所帶來的臟器指數(shù)的變化，其中古方量方對胸腺指數(shù)的恢復尤為顯著；不同劑量的半夏瀉心湯對臟器指數(shù)的影響不盡相同，藥典量方在預防UC小鼠結(jié)總腸長度比、結(jié)總腸質(zhì)量比的改變方面更有優(yōu)勢，而古方量方則在預防UC小鼠胸腺指數(shù)、肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)的改變方面更有優(yōu)勢。

3.3 各組小鼠炎癥因子水平比較 炎癥在UC發(fā)生發(fā)展過程中起著極為重要的作用，研究檢測各組小鼠血清及結(jié)腸組織中各炎癥因子含量以探究半夏瀉心湯各組方在防治UC發(fā)生發(fā)展中對血清及結(jié)腸組織炎癥因子含量的影響?，F(xiàn)分述如下。

如圖4所示，與空白組相比，模型組小鼠血清及結(jié)腸組織白介素（IL）-4含量升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）；而古方量組、藥典量組小鼠血清及結(jié)腸組織IL-4含量低于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）。此結(jié)果表明半夏瀉心湯可防治 DSS-UC小鼠模型血清及結(jié)腸組織中IL-4的升高。

圖4 半夏瀉心湯防治潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的IL-4水平Fig.4 Serum IL-4 level of the prevention and treatment in ulcerative colitis mice by Banxia Xiexin Decoction

如圖5所示，與空白組相比，模型組小鼠血清及結(jié)腸組織IL-10含量降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）；與模型組相比，古方量組、藥典量組小鼠血清及結(jié)腸組織IL-10含量則有不同程度的恢復。古方量方及藥典量方對實驗小鼠結(jié)腸組織IL-10含量的恢復明顯（P＜0．05），其中古方量方顯著（P＜0．01），差異均具有統(tǒng)計學意義。此結(jié)果表明半夏瀉心湯可防治DSS-UC小鼠模型血清及結(jié)腸組織中IL-10的降低，且以古方量方為優(yōu)。

圖5 半夏瀉心湯防治潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的IL-10水平Fig.5 Serum IL-10 level of the prevention and treatment in ulcerative colitis mice by Banxia Xiexin Decoction

如圖6所示，與空白組相比，模型組小鼠血清及結(jié)腸組織IL-17含量降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）；與模型組相比，古方量組小鼠血清及結(jié)腸組織IL-17含量與模型組相近；而藥典量組小鼠僅血清IL-17含量有恢復，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．01），結(jié)腸組織IL-10含量與模型組相比，無統(tǒng)計學差異（P＞0．05）。此結(jié)果表明半夏瀉心湯藥典量方可防治DSS-UC小鼠模型血清IL-10的降低。

圖6 半夏瀉心湯防治潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的IL-17水平Fig.6 Serum IL-17 level of the prevention and treatment in ulcerative colitis mice by Banxia Xiexin Decoction

如圖7所示，與空白組相比，模型組小鼠血清及結(jié)腸組織腫瘤壞死因子（TNF）-α含量升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）。與模型組相比，古方量組、藥典量組結(jié)腸組織TNF-α含量均有恢復（P＜0．01），而對于血清TNF-α 含量，藥典量組小鼠較模型組降低（P＜0．01），差異均具有統(tǒng)計學意義，但古方量組小鼠僅有下降的趨勢。此結(jié)果表明半夏瀉心湯古方量方及藥典量方可防治DSS-UC小鼠模型結(jié)腸組織中TNF-α的降低，而半夏瀉心湯藥典量方則可防治DSS-UC小鼠模型血清TNF-α的降低。

圖7 半夏瀉心湯防治潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的TNF-α水平Fig.7 Serum TNF-α level of the prevention and treatment in ulcerative colitis mice by Banxia Xiexin Decoction

如圖8所示，與空白組相比，模型組小鼠血清及結(jié)腸組織干擾素γ（IFN-γ）含量升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）。古方量組、藥典量組小鼠血清及結(jié)腸組織IFN-γ含量較模型組小鼠無變化。此結(jié)果表明半夏瀉心湯各組方對DSS-UC小鼠模型血清及結(jié)腸組織IFN-γ水平無顯著影響。

圖8 半夏瀉心湯防治潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的IFN-γ水平Fig.8 Serum IFN-γ level the prevention and treatment in ulcerative colitis mice by Banxia Xiexin Decoction

如圖9所示，與空白組相比，模型組小鼠血清及結(jié)腸組織5-HT水平均下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）；而與模型組相比，藥物干預組小鼠血清及結(jié)腸組織5-HT水平均有恢復，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．01），其中藥典量組小鼠血清及結(jié)腸組織5-HT水平均已恢復到空白組水平，與空白組比較無統(tǒng)計學差異（P＞0．05）；但古方量組小鼠血清 5-HT 水平低于空白組（P＜0．05），而結(jié)腸組織 5-HT 水平則高于空白組（P＜0．01），差異均具有統(tǒng)計學意義。此結(jié)果表明，半夏瀉心湯可預防DSS-UC模型小鼠血清及結(jié)腸組織5-HT含量的降低。

圖9 半夏瀉心湯防治潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的5-HT水平Fig.9 Serum 5-HT level the prevention and treatment in ulcerative colitis mice by Banxia Xiexin Decoction

如圖10A、B所示，與空白組相比，模型組小鼠血清及結(jié)腸組織IL-4/IL-10水平升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）；與模型組相比，古方量組、藥典量組小鼠血清及結(jié)腸組織IL-4/IL-10水平則降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．01），與空白組小鼠水平相近。此結(jié)果表明半夏瀉心湯可防治DSS-UC小鼠模型血清及結(jié)腸組織IL-4/IL-10的降低。

如圖10C、D所示，與空白組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織IL-10/IL-17水平升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），而血清 IL-10/IL-17水平則無變化。與模型組相比，古方量組小鼠血清及結(jié)腸組織IL-10/IL-17 水平則進一步升高（P＜0．05），且血清 IL-10/IL-17 水平升高尤為顯著（P＜0．01），差異均具有統(tǒng)計學意義。藥典量組小鼠結(jié)腸組織IL-10/IL-17水平亦進一步升高，具有統(tǒng)計學差異（P＜0．05），但血清IL-10/IL-17水平則無顯著變化，與空白組、模型組小鼠相似。此結(jié)果表明半夏瀉心湯古方量方可升高DSS-UC小鼠模型血清及結(jié)腸組織IL-10/IL-17的水平，而藥典量方僅可升高DSS-UC小鼠模型結(jié)腸組織IL-10/IL-17的水平。

如圖10E、F所示，與空白組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織IFN-γ/IL-4水平降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．01），而血清IFN-γ/IL-4 水平則無顯著變化。與模型組相比，古方量組小鼠結(jié)腸組織IFN-γ/IL-4水平有恢復（P＜0．01），藥典量組小鼠血清 IFN-γ/IL-4水平有恢復（P＜0．01），差異均具有統(tǒng)計學意義。此結(jié)果表明半夏瀉心湯古方量方可防治DSS-UC小鼠模型結(jié)腸組織IFN-γ/IL-4的降低，而藥典量方可防治DSS-UC小鼠模型血清IFN-γ/IL-4的降低。

圖10 半夏瀉心湯防治潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的相關(guān)炎癥因子比值Fig.10 Ratio of inflammation-related factors of experimental mice of the prevention and treatment in ulcerative colitis mice by Banxia Xiexin Decoction

3.4 各組小鼠諸指標的相關(guān)性分析 本研究同時還對上述各指標進行了相關(guān)性分析，如圖11，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清5-HT水平與血清IL-4、IL-17、TNF-α水平以及結(jié)腸指數(shù)具有相關(guān)性，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其中與IL-17 水平（r=0.611 4，P=0.001 2）成正相關(guān)，與 IL-4水平（r=-0.730 5，P=0）、TNF-α 水平（r=-0.567 3，P=0.003 1）以及結(jié)腸指數(shù)（r=-0.429 5，P=0.032 2）成負相關(guān)。血清IL-10水平分別與胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、結(jié)腸指數(shù)具有顯著相關(guān)性（P＜0.01）；其中與胸腺指數(shù)（r=0.661 1，P=0.000 3）成正相關(guān)，與脾臟指數(shù)（r=-0.602 1，P=0.001 4）以及結(jié)腸指數(shù)（r=-0.643 1，P=0.000 5）成負相關(guān)。

圖11 半夏瀉心湯防治潰瘍性結(jié)腸炎小鼠各指標的相關(guān)性Fig.11 Correlation each indicator in experimental of ulcerative colitis mice by Banxia Xiexin Decoction

結(jié)腸組織5-HT水平分別與結(jié)腸組織IL-4水平（r=-0.431 4，P=0.031 3）、TNF-α 水平（r=-0.850 3，P=7.39E-08）成顯著負相關(guān)。結(jié)腸組織IL-10水平分別與結(jié)腸組織IL-4水平（r=-0.420 4，P=0.036 4）、結(jié)腸指數(shù)（r=-0.489 7，P=0.01 3）成顯著負相關(guān)。結(jié)腸組織IL-17水平與胸腺指數(shù)（r=0.447 8，P=0.024 8）成負相關(guān)。

胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)（r=-0.690 1，P=0.000 1）及結(jié)腸指數(shù)（r=-0.456 4，P=0.021 8）成負相關(guān)。脾臟指數(shù)與結(jié)腸指數(shù)（r=0.436 5，P=0.029 1）成正相關(guān)。

4 討論

半夏瀉心湯原方用于治療柴胡湯證誤下之“心下痞”證及“嘔而腸鳴”，其由小柴胡湯去柴胡、生姜加黃連三兩、干姜一兩而成，由原來治療表里之樞病轉(zhuǎn)變?yōu)橹委熒舷轮畼胁16-17]?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》有云：“飲入于胃，游溢精氣，上輸于脾。脾氣散精，上歸于肺，通調(diào)水道，下輸膀胱?！倍鳸C患者脾氣不升，無法將運化來的水谷精微布散全身，聚而為水濕，濕性重濁，下趨腸腑，郁久化熱，血腐肉敗而發(fā)??；其基本病機為臟（脾）氣不升、腑（腸）氣不降，實為中焦上下樞機之邪：在上為脾氣虛，在下在腸蘊濕熱。半夏瀉心湯以“辛開苦降甘補”組方，方中甘溫之參、草、棗可補脾益氣，復中土之功；辛溫為陽，主升主動，姜、夏助脾氣升提布散；“六腑以通為用”，故芩、連之苦寒即可清熱燥濕，消除腸中濕熱，又可順腑氣。且方中半夏味辛性降，可辛散助開、降逆助合；開上瀉下，為開上下樞機之要藥。諸藥相伍，補中益氣，復脾升腸降，中焦上下樞機得通，病癥自除。

“經(jīng)方不傳之秘在于量”“古方之妙，全在藥量”。由此可見，歷代醫(yī)家對經(jīng)方藥物劑量的重視。經(jīng)方的臨床應(yīng)用中，合理理解并應(yīng)用各藥物的劑量是平衡經(jīng)方有效性及安全性的關(guān)鍵所在，亦是提高中醫(yī)療效的引發(fā)點。經(jīng)典名方半夏瀉心湯因方中含有有毒藥物半夏，故其藥物劑量的選用被歷代醫(yī)家所爭論。研究在課題組前期研究的基礎(chǔ)之上，保持全方各藥物劑量比例不變，以半夏的古方用量及現(xiàn)代《藥典》的日最大應(yīng)用劑量為基準組方，分別干預DSS-UC模型小鼠，通過分析小鼠體質(zhì)量、死亡率等一般狀態(tài)，DAI指數(shù)、臟器指數(shù)等指標以及結(jié)腸局部病理損傷的差異以探究半夏瀉心湯各組方防治UC的療效差異。研究結(jié)果顯示：DSS-UC小鼠可見精神萎靡、活動量減少、被毛蓬松等臨床表現(xiàn)，體質(zhì)量顯著減輕、DAI指數(shù)、肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、結(jié)腸指數(shù)、結(jié)總腸長度比、結(jié)總腸質(zhì)量比顯著升高，胸腺指數(shù)則顯著低，結(jié)腸局部炎癥反應(yīng)嚴重，大量炎性細胞浸潤。而經(jīng)半夏瀉心湯干預防治后上述指標出現(xiàn)不同程度的恢復，尤其是半夏瀉心湯古方量組小鼠改善尤為明顯。說明半夏瀉心湯可防治因DSS誘導建模所致的小鼠局部組織及全身損傷，且古方量方療效為佳，表明了經(jīng)方原方組方的合理性。

同時本研究對半夏瀉心湯治療UC的作用機制進行初步探討，結(jié)果表明，半夏瀉心湯可以通過升高DSS-UC模型小鼠血清及結(jié)腸組織中IL-10、5-HT水平，降低血清及結(jié)腸組織中IL-4、TNF-α水平，改善IL-4/IL-10、IFN-γ/IL-4水平，進而改善DSS-UC小鼠腸道炎癥反應(yīng)，改善組織損傷情況，從而發(fā)揮治療UC的治療作用。

IL-4是由機體活化T細胞產(chǎn)生，具有多種生物學功能[18]。大量研究證實IL-4能抑制IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生，同時降低活化單核巨噬細胞分泌氧自由基，具有顯著的抑炎特征[19-20]。但亦有研究表明IL-4在UC中可發(fā)揮促炎作用，其可在UC患者體內(nèi)顯著升高，且其水平與UC疾病活動度成正相關(guān)[21-24]，此結(jié)果與本研究結(jié)果相一致。推測原因可能是：IL-4可誘導B細胞并刺激內(nèi)皮細胞，分泌黏附因子及趨化性細胞因子，且IL-4是小鼠巨噬細胞趨化因子，其可以顯著促進IL-1ra的產(chǎn)生，并抑制單核細胞產(chǎn)生IL-1、TNF和IL-6；此外IL-4可誘導單核細胞及嗜酸性粒細胞并刺激肥大細胞增殖參與炎癥反應(yīng)[23-24]。經(jīng)半夏瀉心湯干預后，DSS-UC模型小鼠結(jié)腸組織及血清IL-4水平顯著降低，表明半夏瀉心湯可以降低UC模型中促炎因子IL-4水平以發(fā)揮治療作用。

IL-10是由Th2細胞產(chǎn)生的抗炎因子，是機體維持腸道免疫平衡的關(guān)鍵因子[25-26]。IL-10可以通過抑制抗原提呈和產(chǎn)生并抑制促炎趨化因子和細胞因子的產(chǎn)生，進而抵抗炎癥引起的組織損傷，其水平降低是UC的重要表現(xiàn)之一[27-30]；同時有研究發(fā)現(xiàn)，敲除或抑制IL-10基因后，小鼠患UC的幾率顯著增加，對炎癥性腸病表現(xiàn)出強敏感性[31-35]。本研究結(jié)果顯示，DSS-UC模型小鼠血清及結(jié)腸組織中IL-10水平顯著于正常對照組，且經(jīng)半夏瀉心湯干預后顯著恢復；此表明IL-10在UC的免疫反應(yīng)中起重要作用，且半夏瀉心湯可以通過升高DSS-UC模型小鼠IL-10水平，從而抑制抗炎因子水平，改善腸道炎癥，進而發(fā)揮治療UC的作用。對各炎癥因子進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，抑炎因子IL-10水平與IL-4水平成負相關(guān)，此結(jié)果亦佐證了IL-4在UC中發(fā)揮促炎作用。

IL-17主要有免疫細胞Th17產(chǎn)生，此外巨噬細胞、樹突狀細胞、CD8+T細胞、嗜中性粒細胞、肥大細胞、上皮細胞和腫瘤細胞中也可產(chǎn)生少量IL-17；IL-17家族共有6個成員，分別為IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E（亦稱為 IL-25）和 IL-17F。目前有關(guān)IL-17生物學功能的研究眾多，但其具體的生物學功能尚無定論，不用研究的結(jié)果已有所差異。有研究顯示IL-17可以與其他細胞因子協(xié)同，刺激中性粒細胞聚集、促進前列腺素E2表達，從而誘導并加重炎癥反應(yīng)，多種自身免疫?。ㄈ缦到y(tǒng)性紅斑狼瘡[36]、銀屑病[37]、風濕性關(guān)節(jié)炎[38]等）均與其水平升高有關(guān)；同時亦有研究發(fā)現(xiàn)UC患者病變腸黏膜中的IL-17表達水平明顯高于正常黏膜[39-43]，且選擇性敲除或抑制IL-17基因可減輕UC的炎癥反應(yīng)[44]，上述研究表明IL-17在機體內(nèi)為重要的促炎因子。但有研究發(fā)現(xiàn)在各類炎癥性疾病中IL-17水平顯著下降，并認為IL-17能加強上皮細胞的連接同時保護腸黏膜通透性，在UC中發(fā)揮抑炎效應(yīng)[45-46]。本研究中已發(fā)現(xiàn)DSS-UC模型小鼠血清及組織中IL-17水平顯著降低，且經(jīng)半夏瀉心湯干預后顯著恢復，推測可能是由于IL-17在UC中發(fā)揮抑炎作用，半夏瀉心湯可以升高抑炎因子IL-17的水平以發(fā)揮治療UC的作用，但其具體機制仍需進一步的臨床驗證。

TNF-α、IFN-γ是經(jīng)典的促炎因子。IFN-γ是可溶性二聚體細胞因子，是II型干擾素的唯一成員，亦是常見的促炎性細胞因子[47-48]。研究表明，IFN-γ在UC患者結(jié)腸組織及血清異常高表達，可參與UC的發(fā)生發(fā)展[49-51]。TNF-α、IFN-γ等炎癥因子可刺激產(chǎn)生更多干擾素γ誘導蛋白10（IP10），并進一步導致免疫細胞聚集，加重炎癥反應(yīng)；同時可直接或間接損傷腸黏膜屏障以誘發(fā)UC[52]。研究結(jié)果顯示，DSS-UC模型小鼠血清IFN-γ水平顯著上升，與上述研究結(jié)果相一致；但結(jié)腸組織IFN-γ水平顯著下降，與上述研究結(jié)果相悖，通過查閱文獻，但未查詢到相關(guān)資料，因此DSS-UC模型小鼠結(jié)腸組織IFN-γ水平下降的具體原因有待于進一步的探究。TNF-α主要由巨噬細胞、T細胞、B細胞等多種細胞產(chǎn)生，是調(diào)節(jié)免疫細胞的關(guān)鍵細胞因子，屬于前促炎細胞因子，最早表達于炎癥反應(yīng)中，與炎癥的嚴重程度相關(guān)[53-55]。其是目前公認的能夠介導UC發(fā)病的細胞因子，可以促使其他各類促炎因子的釋放，擴大炎癥連鎖反應(yīng)，參與UC的炎癥反應(yīng)及免疫應(yīng)答[56-58]。本研究結(jié)果顯示，半夏瀉心湯可以顯著降低DSS-UC模型小鼠結(jié)腸組織及血清TNF-α水平。眾多研究結(jié)果與本研究結(jié)果相似，表明半夏瀉心湯可以抑制結(jié)腸組織及血清TNF-α水平，抑制腸道炎癥反應(yīng)，改善局部組織損傷，進而改善UC癥狀[5-6，59]。

5-HT主要由腸道中的嗜鉻細胞和腸肌間神經(jīng)叢合成，其可作為免疫調(diào)節(jié)因子作用于淋巴細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞免疫細胞上的5-HT受體，調(diào)節(jié)免疫細胞功能，分泌IL-6、IFN-γ等細胞因子，介導炎癥反應(yīng)[60]；同時5-HT還作為重要的腦腸肽，在“腦腸軸”中發(fā)揮重要地位[61]；除此之外，5-HT還參與肝臟脂質(zhì)代謝等眾多生理過程[62]。研究表明，5-HT參與UC的發(fā)生與發(fā)展，但其在UC中發(fā)揮的生物學功能尚有歧義。有研究者發(fā)現(xiàn)UC患者結(jié)腸黏膜中5-HT生成量增加、5-HT的再攝取量減少，從而導致UC患者結(jié)腸黏膜中及血清中5-HT的有效含量升高[63-65]，且UC患者結(jié)腸黏膜24 h的5-HT釋放量且與UC疾病活動度（Mayo評分）呈正相關(guān)性[64]。但亦有研究發(fā)現(xiàn)UC患者體內(nèi)5-HT水平降低[66]，本研究結(jié)果與其一致，DSS-UC模型小鼠血清及組織中5-HT水平顯著見底，而經(jīng)半夏瀉心湯干預后，其均有顯著恢復。但此結(jié)果與課題組前期研究結(jié)果[6]不一致，推測其可能的原因是：5-HT水平可能隨疾病的不同階段或是不同的時期有關(guān)。但其具體機制仍需要進一步的實驗探究以明確5-HT水平與UC的關(guān)系。

5 結(jié)論

半夏瀉心湯可以通過升高DSS-UC模型小鼠血清及結(jié)腸組織中IL-10、5-HT水平，降低血清及結(jié)腸組織中IL-4、TNF-α水平進而改善DSS-UC小鼠腸道炎癥反應(yīng)，改善組織損傷情況，從而發(fā)揮治療UC的治療作用；且以古方量效果為佳。

6 展望

本研究基于免疫穩(wěn)態(tài)、從炎癥因子水平入手，通過檢測不同劑量的半夏瀉心湯對DSS-UC模型小鼠血清及結(jié)腸組織中炎癥因子水平的影響，探究半夏瀉心湯治療UC的作用機制?；趯嶒灲Y(jié)果，筆者對在UC疾病中生物學效應(yīng)存在爭議的炎癥因子（如 IL-4、Il-17、5-HT）進行了科學合理的闡釋，但本研究僅采用了2.5%DSS誘導的小鼠為動物模型，且未從多角度對相關(guān)因子進行動態(tài)監(jiān)測。故后期計劃采用多種動物模型及臨床研究，采用多種方法檢測UC發(fā)展及轉(zhuǎn)歸的不同時間點各相關(guān)炎癥因子的動態(tài)變化，深入探究各炎癥因子在UC疾病中的變化規(guī)律，以闡釋UC的發(fā)病機制。