甲狀腺乳頭狀癌基因突變與其侵襲性相關(guān)性研究

張 冉，楊 潔，馮恩梓，袁曉鳳，王 清

（昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院頭頸外科，云南 昆明 650118）

甲狀腺癌是我國最常見的頭頸部腫瘤之一。2020 年全球新發(fā)甲狀腺癌病例數(shù)約為58 萬，發(fā)病率在所有癌癥中位列第11 位[1]，其中甲狀腺乳頭狀癌（Papillary Thyroid Carcinoma PTC）是甲狀腺癌中最多見的類型。通過手術(shù)以及I131 綜合治療，PTC 預后總體較好，然而其中一部分PTC 依舊表現(xiàn)出較強的侵襲性，頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腺外侵犯不僅增加了手術(shù)難度，導致腫瘤組織不能夠完全切除，而且增加了腫瘤復發(fā)的風險以及影響患者的生存質(zhì)量[2，3]。國內(nèi)BRAF V600E 鑒別細針穿刺性質(zhì)不明確的腫瘤應用已較為廣泛，然而基因突變關(guān)于預判PTC 侵襲性及預后方面的實際應用卻相對較少，然而這對預測患者預后有巨大的潛在價值，一項meta 分析顯示BRAF V600E 突變的PTC 患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的概率明顯提高[4]，還有研究聯(lián)合穿刺細胞學及BRAF V600E 突變也顯示BRAF V600E 突變的PTC 侵襲性更強，并在一定程度上能夠預測PTC 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生[5]。本研究除了研究比較熱門同時也是應用比較成熟的BRAF V600E，還納入 了TERT，RET，RAS，TP53，CCDC6，NTRK，ETV6 共8 個基因進行分析，對各基因突變組與與野生型組的臨床病理特征進行對比，探究各基因突變與PTC 病理特征的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

本研究回顧性納入2018 年4 月至2022 年4月就診于昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院并且有完整的基因信息、病理資料、臨床資料的PTC 患者，納入標準：（1）本院行甲狀腺葉切除+中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃術(shù)且術(shù)后病理類型為甲狀腺乳頭狀癌；（2）有完整的臨床病理資料；（3）為初治病例，未接受過放化療；（4）無同期其他原發(fā)癌及遠處轉(zhuǎn)移。收集到樣本總數(shù)114 例，<55 歲91 例（79.8%），≥55 歲23 例（20.2%），年齡最小18 歲，最大78 歲，平均年齡43.11 歲，年齡中位數(shù)43 歲，男性23例（20.2%），女性91 例（79.8%）。

1.2 方法

1.2.1 基因檢測對術(shù)后腫瘤樣本核酸提取后進行文庫構(gòu)建和探針捕獲，采用高通量測序技術(shù)（Next Generation Sequencing NGS）對21 個實體瘤相關(guān)突變進行檢測，包括BRAF、AKT1、KRAS、NRAS、HRAS、PIK3CA、CTNNB1、GNAS、TSHR、TERT、RET、NTRK1、ALK、PTEN、TP53、PAX8、RASAL1、PDGFRA、EIF1AX、ETV6、TSC2，其中BRAF、RET、NTRK、ALK、PAX8、ETV6 同時檢測融合突變的基因，例如：RET 同時檢測融合突變基因：CCDC6，TERT 同時檢測啟動子區(qū)域的基因，測序平臺為illumina，分析軟件為癌癥基因突變信息分析系統(tǒng)，基因檢測由昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院醫(yī)院分子檢測中心完成，檢測報告由昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院分子檢測中心出具。

1.2.2 回顧性收集符合入組標準患者的年齡（年齡分層按照第八版AJCC 分期系統(tǒng)分層）、性別、多發(fā)癌灶、侵犯包膜、中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目，側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目，T 分期，N 分期，M 分期，術(shù)前Tg-Ab，TPO-Ab等臨床病理資料，以及基因資料，以各基因突變組作為觀察組，野生型組作為對照組，以上臨床病理特征為觀察指標，對比各基因突變組與野生型組在臨床病理特征的差異（表1，表2）；多基因突變作為觀察組，單基因突變型作為對照組，以上述臨床病理特征為觀察指標，對比多基因突變與單基因突變臨床病理特征差異，探討基因突變數(shù)量與其侵襲性的關(guān)系（表3）；參照cN0 診斷標準：臨床觸診頸部未發(fā)現(xiàn)明顯淋巴結(jié)腫大或增大淋巴結(jié)最長徑不超過2 cm，且質(zhì)地柔軟；常規(guī)影像學檢查，包括高頻超聲檢查及頸部CT 檢查等為未發(fā)現(xiàn)異常增大淋巴結(jié)，且淋巴結(jié)內(nèi)無囊性變、點狀強回聲、皮髓質(zhì)結(jié)構(gòu)消失、分界不清等超聲現(xiàn)象，從cN0 患者中篩選出BRAF V600E 單基因突變及無基因突變的PTC 患者，以BRAF V600E突變作為觀察組，無基因突變作為對照組，中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目為觀察指標，對比BRAF V600E 突變與無基因突變的PTC 在中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移的差異。

表3 98 例單基因突變與多基因突變病理特征的單因素分析Tab.3 Single factor analysis of pathological characteristics of 98 cases of single gene mutation

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS25.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料采用頻數(shù)（百分比表示），組間比較采用卡方檢驗，非正態(tài)分布的計量資料的比較采用非參數(shù)檢驗。以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

基因突變情況：21 個基因中有突變基因8 個：BRAF V600E 突變87 例（76.3%），其中單基因突變 81 例（71.1%），BRAF V600E+TERT 3 例（2.6%），BRAF V600E+TP53 2 例（1.7%），BRAF V600E+RAS 1 例（0.9%）；TERT 突變4 例（3.5%），其中 BRAF V600E+TERT 3 例，TERT+RETCCDC6 融合1 例（0.9%）；RAS 突變3 例（2.6%），均為NRAS 突變，其中2 例為單基因突變，BRAF V600E+RAS 1 例；RET 突變6 例（5.3%），其中單基因突變3 例，RET-CCDC6 融合2 例（1.7%），TERT+RET-CCDC6 融合1 例（0.9%）；CCDC6 突變3 例（3%），其中RET-CCDC6 融合2 例（1.7%），TERT+RET-CCDC6 融合1 例（0.9%）；TP53 突變3 例（2.6%），其中BRAF V600E+TP53 2 例（1.7%），TP53+ETV6-NTRK3 融合1 例（0.9%）；NTRK3 和ETV6 突變 3 例（2.6%），其中 TP53+ETV6-NTRK3 融合1 例（0.9%），另外2 例（1.7%）均為ETV6-NTRK3 融合突變。12 例（10.5%）為2 個及2 個以上多基因突變，單基因突變86 例（75.4%），16 例無基因突變。臨床病理資料：多發(fā)病灶54例（47.4%），包膜侵犯30 例（26.3%），中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移78 例（68.4%），側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28 例（24.6%）。BRAFV600E 突變組與野生型組：突變組中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移占比較大，中央?yún)^(qū)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量也較多（P<0.05），N1 占比較大，TPOAb 降低（P<0.05）；TERT 突變組與野生型組：TERT 突變組老年占比較大，男性占比較大，側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者占比較大，側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量較多，T 分期較晚（P<0.05）；RET 突變組與野生型組：側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者占比較大，側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移占比較大，T 分期較晚（P<0.05），NTRK3 與ETV6 均為融合突變，結(jié)果一致：突變組侵犯甲狀腺包膜占比較大（P<0.05）；RAS 突變組與野生型組：Tg-Ab 水平較低（P<0.05）；TP53，CCDC6 突變組與野生型組，差異均無統(tǒng)計學意義（P≥0.05）；多基因突變組與單基因突變組：多基因突變組侵犯包膜占比較大，側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移占比較大，側(cè)頸轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)量較多，M 分期較晚（P<0.05）；cN0 患者中BRAF V600E 突變組與無基因突變組，突變組中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移占比較大，中央?yún)^(qū)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)目較多（P<0.05）。

3 討論

雖然甲狀腺癌相對其他惡性腫瘤預后較好，依舊有40%～90%的患者在初次手術(shù)中發(fā)現(xiàn)有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[6?7]，腫瘤侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是甲狀腺癌預后的重要影響因素[8]，而且隨著PTC 發(fā)病率的不斷攀升，中晚期難治性PTC 也越來越常見[9]。2003 年Cohen 等[10]首次提出BRAF 基因與甲狀腺癌相關(guān)，隨著測序技術(shù)的發(fā)展，在PTC 中一些新的突變基因被發(fā)現(xiàn)，然而關(guān)于一些突變基因?qū)е碌腜TC 生物學行為卻沒有明確的定論。相較于一代測序（Sanger Sequencing）而言，二代測序有成本低、通量高、速度快等優(yōu)點[11]。本研究就是基于二代測序進行的PTC 相關(guān)基因突變與其生物學行為的討論，本次測序覆蓋了21 個基因，檢測了目標區(qū)域內(nèi)的點突變，插入缺失突變，融合突變，拷貝數(shù)變異，全部患者114 例中檢測到基因突變8 個。BRAFV600E 突變是目前已知PTC中最常見的分子缺陷，本研究中BRAF V600E 突變型87 例，突變率達76.3%，觀察結(jié)果顯示其突變型較野生型更容易發(fā)生中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，突變組73.6%，陰性組51.9%（P<0.05），多項研究也表明BRAFV600E 突變是PTC 中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險因素[12?14]，有文獻報道[15]BRAFV600E突變是PTC 腫瘤多灶性及包膜外侵犯的危險因素，且相對于野生型表現(xiàn)出更強的側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移傾向，本研究結(jié)果顯示BRAF V600E 突變與PTC 多癌灶性、包膜侵犯以及側(cè)頸淋巴結(jié)并無顯著性關(guān)聯(lián)，這可能與一部分有多癌灶、包膜侵犯、側(cè)頸轉(zhuǎn)移的患者不愿意入組以及樣本量偏小有關(guān)。反觀TERT 突變型和RET 突變型比野生型均表現(xiàn)出更強的側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的能力，T 分期也較晚，這兩方面2 者表現(xiàn)出一定的一致性，TERT 側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，突變組75%，陰性組22.7%（P<0.05），側(cè)頸轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目，突變組5.50±7.14，陰性組1.15±2.48（P<0.05），除此以外，TERT 突變組相較陰性組診斷年齡更大，突變組60.75±12.82，陰性組42.46±11.01（P<0.05）。本研究中TERT 突變4 例，突變率為2.7%，相關(guān)研究也顯示存在TERT 突變的PTC 有更強的腺外侵犯能力，是影響T 分期和診斷年齡的重要因素[16]，有研究報道TERT 和高齡患者存在關(guān)聯(lián)[17]，與本研究結(jié)果一致。本研究中檢測到的RAS 突變均為NRAS 突變，且突變型與野生型也并未表現(xiàn)出明顯差異，本研究中，TP53 突變型與野生型在PTC 臨床病理特征均無顯著性差異，與國外一項研究一致[18]。

多基因突變中，3 例TERT 與BRAF V600E突變共存，TERT 突變已被證實與BRAF V600F突變存在協(xié)同相關(guān)[19]，相關(guān)研究[20]顯示BRAF V600E 聯(lián)合TERT 啟動子突變與PTC 碘治療療效不佳顯著相關(guān)，雖然本研究并未對碘治療展開討論，這也是TERT 突變型PTC 侵襲性強的一個表現(xiàn)，可為后續(xù)研究提供新的思路。有研究顯示BRAF V600E 和TERT 啟動子突變與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、多灶性轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、甲狀腺外擴散顯著相關(guān)[21，22]，由于樣本量的限制，本研究并沒有做BRAF V600E 單基因突變與其他基因突變共存的對比，本研究把2 個及兩個以上基因突變歸為多基因突變組，與單基因突變比較觀察，觀察結(jié)果（表3）顯示多基因突變的 PTC 與包膜侵犯、側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，而中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移并沒有表現(xiàn)出顯著差異，包膜侵犯：單基因突變25.6%，多基因突變66.7%（P<0.05），側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：單基因突變：18.6%，多基因突變：66.7%（P<0.05），M 分期也有顯著性差異，多基因突變較BRAF V600E 侵襲型更強也主要表現(xiàn)在這三方面，相關(guān)研究也顯示多基因突變可能比單基因突變有更強的侵襲性[23]。國內(nèi)關(guān)于RETCCDC6 融合突變的相關(guān)報道較少，本研究3 例RET 基因與CCDC6 融合突變，與各病理特征相關(guān)性分析也并沒有統(tǒng)計學差異，為意義不明確的突變類型。ETV6-NTRK3 融合突變也少見報道，本研究中有3 名患者存在NTRK-ETV6 融合突變，在包膜侵犯上較陰性組更強，有研究報道ETV6-NTRK3 融合突變可能與輻射暴露有關(guān)[24]，2011年福島核泄漏福島核泄漏發(fā)生后，一項研究收集了2013 年至2016 年在福島醫(yī)科大學醫(yī)院接受PTC 手術(shù)的136 名患者，發(fā)現(xiàn)6 名患者ETV6-NTRK3 融合突變，突變率為4.3%[25]，本研究的突變率為2.1%，為本研究的2 倍。

PTC 轉(zhuǎn)移最多見的就是中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，再通過中央?yún)^(qū)向側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，很少一部分患者會直接轉(zhuǎn)移至側(cè)頸淋巴結(jié)，所以國內(nèi)大部分PTC 切除原發(fā)灶的同時會同時進行預防性中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)的清掃，然而中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃也存在一定的潛在風險，比如甲狀旁腺損傷導致術(shù)后低鈣血癥以及喉返神經(jīng)損傷的風險增高。所以，對cN0 的PTC 患者是否行預防性中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃一直存在爭議[1]。本研究從所有患者中篩選出cN0 患者，以BRAF V600E 單基因突變以及無基因突變進行分組，以中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及中央?yún)^(qū)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的數(shù)目進行比較，觀察發(fā)現(xiàn)有BRAF V600 突變的患者更容易發(fā)生中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移BRAF V600F 單基因突變組47.6%，無基因突變組9.1%（P<0.05），中央?yún)^(qū)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)目BRAF V600F，突變組2.10 ±2.54，無基因突變組0.09±0.30（P<0.05），相關(guān)研究也顯示術(shù)前 BRAF V600E 突變陽性的患者發(fā)生隱匿性中央淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能性顯著更高[26]，見表4。該研究也有許多不足之處，樣本量太小，特別是一些罕見的基因型，讓統(tǒng)計分析較困難，未對甲狀腺乳頭狀癌進行進一步的分型，一些侵襲性高的病理亞型可能與某些基因的突變型有關(guān)，希望后續(xù)研究可以進一步擴大研究樣本量，以及對PTC 進一步細分亞型進行研究。

表4 53 例cN0 患者BRAF V600E 突變與無基因突變中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的比較Tab.4 Comparison between braf v600e mutation and central lymph node metastasis without gene mutation.

綜上所述，基因突變和PTC 侵襲性存在相關(guān)性，PTC 中BRAFV600E 突變侵襲性主要表現(xiàn)為中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率更高。多基因突變的侵襲性較BRAF V600E 突變更強，主要表現(xiàn)在甲狀腺包膜的侵犯率更高，側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率更高，側(cè)頸轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)目較多，M 分期更晚。cN0 患者中存在BRAF V600E 突變的患者更容易發(fā)生中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，BRAF V600E 突變可為PTC 患者個體化治療提供一定的參考。