KRAS 基因多態(tài)性與云南漢族人群非小細胞肺癌的相關(guān)性分析

梁 燕 ，王 磊 ，雷 鳴 ，陳本超 ，孫 萍 ，李 帥 ，劉 莉 ，王倩蓉 ，廖曼霖 ，馬千里

（1）云南開放大學(xué)健康護理學(xué)院，云南 昆明 650500;2）昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院胸外科，云南 昆明 650118;3）昆明市兒童醫(yī)院，云南 昆明 650228）

根據(jù)最新的全球癌癥統(tǒng)計，2020 年約1 000萬人死于癌癥相關(guān)疾病。在中國，2020 年癌癥死亡病例約300 萬例，占全世界的30.2%[1]。在所有的癌癥中，肺癌是男性癌癥發(fā)病占比（14.3%）和癌癥死亡占比（21.5%）最高的癌癥。在女性中，肺癌是女性癌癥發(fā)病占比（8.4%）及癌癥死亡占比第一（13.7%）的癌癥[1]。肺癌的發(fā)生是一個非常復(fù)雜的過程，是多種因素共同作用的結(jié)果。除吸煙，空氣污染等被認(rèn)為是肺癌發(fā)生的重要危險因素以外[2]，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，遺傳因素同樣發(fā)揮著重要作用[3]。

Kirsten 大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（kirsten rat sarcoma viral oncogenehomolog，KRAS）基因是在人類癌癥中發(fā)現(xiàn)的第一個致癌基因[4]，其為RAS家基因族的一員。研究認(rèn)為，遺傳變異是導(dǎo)致癌癥發(fā)生的重要因素，而其中，由RAS 家族成員引起的突變最為常見，約27%的腫瘤發(fā)生與其密切相關(guān)[5]。Tomasini 等研究認(rèn)為部分腫瘤的發(fā)生發(fā)展與KRAS 基因過表達或者突變導(dǎo)致的表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）通路持續(xù)活化相關(guān)[6]。

單核苷酸多態(tài)性（single nueleotide polymorphism，SNP）定義為一個核苷酸插入、缺失或改變成為其他核苷酸?；虻腟NP 可影響基因正常表達或蛋白質(zhì)的變異，從而影響疾病的發(fā)生發(fā)展[7]。如同其他致癌基因一樣，KRAS 基因中的SNP 也被發(fā)現(xiàn)與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性[8]。chneiderova 等發(fā)現(xiàn)KRAS 基因中 rs712 基因型 TT的攜帶者通過影響與微小核糖核酸（micro RNA，miRNA）的相互作用，從而導(dǎo)致 miRNA 表達差異而降低患直腸癌的易感性[9]。

本研究選取KRAS 基因中3′UTR 區(qū)域3 個SNP 位點（rs12587G >T、rs12245A >C、rs1137282A >G），研究其與非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）的相關(guān)性。在此基礎(chǔ)上，對病例組進行分層分析，進一步研究這3個SNP 位點與非小細胞肺癌病理類型以及臨床分期的相關(guān)性。以期為非小細胞肺癌的的早期診斷以及治療提供新的靶點及思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究設(shè)置病例組和對照組。病例組：455例確診為非小細胞肺癌的患者，病例確診時間：2012 年3 月至2016 年2 月期間，病例確診醫(yī)院：昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院。病例排除要求參照實驗室前期已經(jīng)建立的排除標(biāo)準(zhǔn)[10]。病例組排除術(shù)前接受放化療等抗腫瘤治療的患者；排除患有其他惡性腫瘤的患者。選取同期在同一醫(yī)院體檢的健康人群391 人作為對照組。所有參加者均為居住于云南地區(qū)彼此無血緣關(guān)系的漢族個體。研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查批準(zhǔn)，所有樣本采集均征得本人知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 樣品采集及基因組DNA 提取使用EDTA抗凝采血管，采集病例組和對照組空腹靜脈血5 mL。樣品基因組DNA 提取采用全血基因組DNA 提取試劑盒（QIAamp DNA Blood Mini Kit，德國QIAGEN 公司），按照說明書操作。采用超微量紫外可見分光光度計（NanoDrop-2000，美國Thermo Fisher Scientific 公司）檢測基因組DNA 的濃度和純度?；蚪MDNA 置于2 ℃至8 ℃儲存。

1.2.2 基因分型基因分型方法采用TaqMan 探針法。TaqMan 探針（TaqMan SNP Genotyping Assays）和SNP 分型試劑（TaqPath? ProAmp?Master Mix）購買于美國Applied Biosystems 公司。SNP 位點rs12587 分析序列號為C－12104199_10、SNP 位點 rs12245 分析序列號為C－176064436_10、SNP 位點rs1137282 分析序列號為C－25471658_10。SNP 分型檢測使用美國Applied Biosystems 公司QuantStudio 6 Flex 實時熒光定量PCR 儀，具體檢測過程及驗證方法參照實驗室已經(jīng)建立的方法[11]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

本研究統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS（19.0）軟件進行，采用t檢驗分析各組間的年齡差異，采用卡方（χ2）檢驗分析各組間的性別差異，采用哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium）檢驗樣品的代表性。并用χ2檢驗比較各組間SNP 位點等位基因和基因型頻率的差異。采用SNPStats 軟件（https://www.snpstats.net/start.htm）對 SNP 位點基因型進行遺傳模式的分析，共分析五種遺傳模式（共顯性模式、顯性模式、隱性模式、超顯性模式和邏輯累加模式），同時計算赤池信息量準(zhǔn)則（akaike information criterion，AIC）和貝葉斯信息準(zhǔn)則（bayesian information criterions，BIC）的數(shù)值，并以此來確定最優(yōu)的遺傳模式（具有最小AIC、BIC 數(shù)值）。采用 SHEsis（http://analysis.biox.cn/myAnalysis.php）軟件計算各Kras 基因中各SNP 位點間的連鎖不平衡關(guān)系。根據(jù)連鎖不平衡結(jié)果構(gòu)建單倍型，采用χ2檢驗比較構(gòu)建的單倍型在各組中分布頻率的差異。統(tǒng)計學(xué)分析中，當(dāng)P<0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，當(dāng)存在多重比較時，采用Bofferroni 校正，當(dāng)校正后P<0.016（0.05/3）時，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象基本特征

本研究病例臨床特征分析見表1。病例組和對照組排除了性別和年齡差異（P>0.05）。病例組分為鱗癌164 例、腺癌265 例、鱗癌合并腺癌8 例，其他類型肺癌18 例。臨床分期為I 期+II期148 例、III 期+IV 期307 例。

表1 病例的臨床特征（n）Tab.1 The clinical characteristics of the subjects enrolled in this study（n）

2.2 Hardy-Weinberg 平衡檢驗研究樣本群體代表性

KRAS 基因rs12587、rs12245、rs1137282 位點基因型在對照組（P=0.130、0.846、0.485）的分布均符合Hardy-Weinberg 平衡檢驗（P>0.05），說明本研究的樣本為具有群體代表性的隨機樣本。

2.3 KRAS 基因SNP 位點與非小細胞肺癌（NSCLC）的相關(guān)性

rs12587（G >T）位點等位基因在NSCLC 組與對照組中分布頻率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.008），其中G 等位基因可能是NSCLC 發(fā)生的風(fēng)險因素（OR=1.365，95%CI：1.086～1.716）。rs12587位點基因型在NSCLC 組與對照組中分布頻率的差異經(jīng)Bofferroni 校正后無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.035）。rs12245、rs1137282 位點等位基因與基因型在NSCLC 組與對照組中分布頻率的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.017），見表2。

表2 KRAS 基因SNP 位點等位基因和基因型在NSCLC 和對照組的分布頻率[n（%）]Tab.2 The allelic and genotypic frequencies of SNPs in KRAS gene between NSCLC case and control groups [n（%）]

2.4 KRAS 基因SNP 位點與NSCLC 相關(guān)性的遺傳模式分析

rs12587 位點的最優(yōu)遺傳模式為邏輯累加模式，該結(jié)果表明，該位點2T/T+G/T 基因型與與NSCLC 的風(fēng)險降低有關(guān)（OR=0.75，95%CI：0.60～0.94）見表3。rs12245 與rs1137282 位點與NSCLC 的發(fā)生無相關(guān)性（P>0.05），見表3。

表3 KRAS 基因3 個SNP 位點與NSCLC 相關(guān)性的遺傳模式分析[n（%）]Tab.3 The inheritance analysis of three SNPs between NSCLC and control groups [n（%）]

2.5 KRAS 基因SNP 位點連鎖不平衡分析及單倍型構(gòu)建

KRAS 基因3 個SNP 位點連鎖不平衡分析結(jié)果顯示，3 個SNP 位點rs12587、rs12245、rs1137282存在連鎖不平衡，D’值分別為0.993、0.932、0.938。單倍型結(jié)果顯示，單倍型rs12587Grs12245T-rs1137282A 頻率在NSCLC 組與對照組中的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.041），但Bofferroni校正后則無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表4。其余單倍型頻率在NSCLC 組與對照組的差異無統(tǒng)計學(xué)（P>0.05）。

表4 NSCLC 組和對照組的單倍型分布差異[n（%）]Tab.4 The haplotype analysis between CC and control group [n（%）]

2.6 KRAS 基因SNP 位點與NSCLC 病理類型的相關(guān)性

根據(jù)病理類型分層分析結(jié)果顯示，鱗癌組與對照組的rs12587 位點等位基因和基因型頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001、P=0.001），其中等位基因G 是鱗癌的風(fēng)險因素（OR=0.55，95%CI0.39～0.77），見表5。鱗癌組與對照組的rs12245位點等位基因和基因型頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.003、P=0.001），等位基因G 是鱗癌發(fā)生的風(fēng)險因素（OR=0.60，95%CI0.43～0.84），見表5。鱗癌組和對照組中rs1137282 位點等位基因及基因型頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表5。而在腺癌和對照組中，以上3 個位點等位基因及基因型頻率均差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表5。

表5 KRAS 基因中SNP 位點的等位基因和基因型在鱗癌病例組、腺癌病例組和對照組的分布頻率[n（%）]Tab.5 The allelic and genotypic frequencies of SNPs in KRAS gene between SCC，AC and control groups [n（%）]

2.7 KRAS 基因SNP 位點與NSCLC 病理類型相關(guān)性的遺傳模式分析

在鱗癌組與對照組的比較分析中，rs12587 位點的最優(yōu)遺傳模式為顯性模式，攜帶G/T+T/T 基因型的個體患鱗癌的風(fēng)險顯著降低（P<0.001，OR=0.45，95%CI0.30～0.68），見表6。rs12245位點的最優(yōu)遺傳模式為超顯性模式，攜帶A/T 基因型的個體患鱗癌的風(fēng)險顯著降低（P<0.001，OR=0.43，95%CI0.28～0.67），見表6。在不同遺傳模式下，3 個SNP 位點與腺癌無相關(guān)性（P>0.05），見表6。

表6 SNP 位點在NSCLC 不同病理類型與對照組的遺傳模式分析[n（%）]Tab.6 The inheritance analysis of the SNP sites between SCC，AC group and control group [n（%）]

2.8 KRAS 基因SNP 位點與NSCLC 臨床分期的相關(guān)性

臨床分期的分層分析結(jié)果顯示，rs12587，rs12245，rs1137282 位點與NSCLC 的臨床分期無相關(guān)性（P>0.05）。

3 討論

引起癌癥發(fā)生的病因和誘因眾多，其中遺傳因素所起的作用不容忽視。KRAS 基因編碼的蛋白屬于小的GTPase 膜結(jié)合蛋白的一種，在細胞中作為控制細胞活躍和不活躍狀態(tài)的分子開關(guān)，KRAS 在其活躍狀態(tài)下可激活許多不同的細胞內(nèi)傳導(dǎo)信號通路[5]，導(dǎo)致下游信號通路被過度活化，從而抑制惡性腫瘤細胞凋亡，刺激促進其生長[12?13]。

MiRNA 是一組非編碼小RNA，其和基因3′UTR 區(qū)域的SNP 位點的相關(guān)性可能進一步影響到基因的表達[8，14?15]。已有研究證明癌癥的發(fā)生與KRAS 基因3′UTR 區(qū)域的SNP 具有相關(guān)性[16]。例如，位于 KRAS 基因 3′ UTR 區(qū)域的與miRNA（let-7 miRNA）互補位點的SNP，與KRAS表達增加和let-7 miRNA 水平降低相關(guān)，并已被證明會增加非小細胞肺癌的風(fēng)險[17]。

本研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC 組與對照組中，KRAS基因的rs12587 位點等位基因頻率具有顯著差異，其中G 等位基因可能與NSCLC 的發(fā)生風(fēng)險相關(guān)。同時，遺傳模式分析顯示，2T/T-G/T 基因型個體比G/G 基因型個體患NSCLC 的風(fēng)險顯著降低。2016 年，Dai 等[18]研究表明rs12587 位點與中國人群結(jié)直腸癌無關(guān)。隨后，Lin 等[19]的研究表明rs12587 與中國兒童神經(jīng)母細胞瘤不相關(guān)。但是，2019 年，F(xiàn)u 等[20]的研究表明rs12587 位點GT 基因型增加了腎母細胞瘤的風(fēng)險。造成研究結(jié)果差異的原因可能是，rs12587 位點在不同的腫瘤類型中發(fā)揮的作用不同，甚至是同一類型腫瘤的不同類型。如本研究就發(fā)現(xiàn)，rs12587 位點與NSCLC 鱗癌的發(fā)病風(fēng)險相關(guān)，但與腺癌的發(fā)病風(fēng)險無相關(guān)性。

本研究發(fā)現(xiàn)，rs12245 位點攜帶A/T 基因型的個體患鱗癌的風(fēng)險顯著降低。2014 年，Cipollini等[21]發(fā)現(xiàn)rs12245 與女性患卵巢癌易感性風(fēng)險增加有相關(guān)性。2016 年，Dai 等[18]研究KRAS 基因上包含rs12245 位點在內(nèi)的6 個SNP 位點，并未發(fā)現(xiàn)rs12245 與中國人群結(jié)直腸癌的生存及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性。2020 年，Liu 等[22]的研究表

明在非霍奇金淋巴瘤患者中rs12245 位點的TT 基因型增加了KRAS 基因表達量。綜合以上研究，可以發(fā)現(xiàn)，rs122455 與不同類型癌癥的風(fēng)險相關(guān)性并不一致。而要進一步驗證rs12245 位點與鱗癌的風(fēng)險相關(guān)性，則需進一步擴大人群樣本量。

本研究沒有發(fā)現(xiàn)rs1137282 與NSCLC 的相關(guān)性。2017 年，Sullivan 等發(fā)現(xiàn)NSCLC 患者中，rs1137282 位點攜帶等位基因G（A/G+G/G）的患者3 a 無復(fù)發(fā)生存率是53%，基因型為A/A 的患者3 a 無復(fù)發(fā)生存率是76%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.02）?；谝陨辖Y(jié)果，Sullivan 等[23]認(rèn)為rs1137282 可被視為可切除 NSCLC 患者復(fù)發(fā)的預(yù)后因素。2018 年，Riera 等[24]發(fā)現(xiàn)rs1137282 的GG 基因型與 II 期結(jié)腸癌患者的總生存期下降顯著相關(guān)。2019 年，Shen 等[25]發(fā)現(xiàn) KRAS 中的rs1137282 與甲狀腺乳頭狀癌患者遠處轉(zhuǎn)移性疾病的低風(fēng)險相關(guān)。以上研究結(jié)果提示，rs1137282 位點可能與癌癥患者的復(fù)發(fā)、生存及轉(zhuǎn)移相關(guān)，而關(guān)于它在癌癥的發(fā)生發(fā)展中的相關(guān)性作用還需在更多疾病類型及更大人群樣本中進一步驗證。

值得注意的是，雖然本研究發(fā)現(xiàn)rs12587 位點與NSCLC 的發(fā)生具有相關(guān)性，但是單倍型分析結(jié)果卻顯示3 個位點構(gòu)建的單倍型與NSCLC 的發(fā)生發(fā)展沒有相關(guān)性。造成這一差異的原因可能是：1，本研究的病例數(shù)相對中等，但不足以獲得有差異的統(tǒng)計結(jié)果，因此單倍型分析無相關(guān)性；2，KRAS 基因?qū)τ趥€體非常重要，影響KRAS 基因3′UTR 穩(wěn)定性的位點可能不止1 個位點，當(dāng)rs12587 位點發(fā)生變異，KRAS 基因可通過其他位點抵消rs12587 位點變異對KRAS 基因的影響。

今后要充分研究KRAS 基因與非小細胞肺癌的相關(guān)性，在擴大樣本量的同時，尚需結(jié)合更多SNP 位點進行系統(tǒng)性分析，同時輔以功能驗證。