miR-219-5p 靶向SOX5 在口腔癌中的作用初探

周 婷 ，何 影 ，董曉函 ，習(xí)楊彥彬 ，陳 波 ，佟 鈞 ，毛 瑞

（1）昆明醫(yī)科大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500;2）武警云南省總隊(duì)醫(yī)院 門診部，云南 昆明 650100;3）昆明醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500;4）昆明醫(yī)科大學(xué)科技成果孵化中心，云南 昆明 650500;5）昆明醫(yī)科大學(xué)體育部，云南 昆明 650500）

頭頸部癌癥是人類第6 大常見癌癥，約占總癌癥種類的3%，這其中48%屬于口腔癌。全世界每年約有30 萬例新發(fā)口腔鱗狀細(xì)胞癌病例，中國口腔癌的發(fā)病率約為5～6 人/10 萬[1]?？谇话┚哂羞M(jìn)展快、浸潤廣、預(yù)后差的特點(diǎn)，盡管目前手術(shù)及放化療等治療技術(shù)在不斷提高，但是遠(yuǎn)未達(dá)到理想效果，口腔癌的長期生存率仍然低于50%[1?2]。若能深入闡明其發(fā)病的分子機(jī)制，綜合多項(xiàng)分子靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測或治療，則有望在口腔癌的早期診斷、治療方面有所突破。

SOX5（SRY-related high-mobility-group box 5）屬于SOX 轉(zhuǎn)錄因子家族的成員。近年的研究發(fā)現(xiàn)，SOX5 在軟骨組織分化、性別決定中起到重要的作用，并可促進(jìn)多種腫瘤的發(fā)展與轉(zhuǎn)移。而目前關(guān)于SOX5 在口腔癌中的表達(dá)情況以及其在口腔癌中的可能作用還不清楚。小分子RNA（miRNA）是一類長度為17～25 個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA 分子，它們在轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控中起著重要的作用。越來越多的研究表明，miRNA 參與口腔癌的發(fā)生與發(fā)展過程，對口腔癌中miRNA 的表達(dá)變化以及其調(diào)控基因的研究，有助于推進(jìn)我們對口腔癌發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)。最近的研究表明，miR-219-5p 做為新的癌癥相關(guān)miRNA，可抑制包括結(jié)直腸癌、胃癌、卵巢癌及膠質(zhì)瘤癌等多種癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲過程，miR-219-5p 在這些癌組織中的表達(dá)下調(diào)。但目前關(guān)于miR-219-5p 在口腔癌中的表達(dá)和作用尚不清楚。

根據(jù)生物學(xué)軟件的預(yù)測，以及對SOX5 基因3’-UTR（非編碼區(qū)域）的分析，作者發(fā)現(xiàn)SOX5是miR-219-5p 的一個(gè)潛在靶基因，那么SOX5和miR-219-5p 是否參與到口腔癌的發(fā)生進(jìn)展中呢？如果是，miR-219-5p 是否通過對SOX5 的靶調(diào)控參與了口腔癌的發(fā)生進(jìn)展呢？為了解決以上問題，本研究擬對miR-219-5p/ SOX5 在口腔癌中的作用做一初探，擬為臨床治療提供全新的藥物治療靶點(diǎn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人舌鱗癌細(xì)胞株SCC4、SCC9 和人正常皮膚成纖維細(xì)胞（HF）購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。SCC4 和SCC9 細(xì)胞由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫進(jìn)行STR 驗(yàn)證。本研究中沒有使用錯(cuò)誤識(shí)別和/或污染的細(xì)胞系。

miR-219-5p 模擬物、miR-219-5p 抑制劑、miRNA 模擬物陰性對照（miR-NC）和siRNA 陰性對照（miR-219-5p 抑制劑，NC）由中國廣州瑞博生物有限公司提供。用Lipofectamine 3000 試劑盒（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

TRIzol?（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）及miRNeasy mini kit（Qiagen AB）用于總RNA 的提取，All-in-OneTM miRNA 定量RTPCR 檢測試劑盒（GeneCopoeia 公 司）用 于miR-219-5p 的RT-qPCR 分析。用于miRNAhsa-miR-219-5p 及U6（內(nèi)參基因）RT-PCR 分析的引物購自Applied Biosystems 及 Thermo Fisher Scientific公 司。采 用 Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase（Takara Bio，Inc.）及2×Mix SYBR Green I（Takara Bio，Inc.）檢測樣本中SOX5 mRNA 的表達(dá)水平。采用BCA 試劑盒（北京生物技術(shù)公司）檢測蛋白濃度。

1.2 細(xì)胞分組

細(xì)胞在制備好的培養(yǎng)基中經(jīng)過第12 代傳代培養(yǎng)，該培養(yǎng)基成分為：Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium（DMEM）/F12（DMEM）/F12（ThermoFisher，上海，中國）、2 mmol/L 谷氨酰胺、10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素 和100 mg/mL 鏈霉素（ThermoFisher 科學(xué)，上海，中國）。在提供5%CO2、恒溫37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

將1.5 μL miR-219-5p 模擬物（3 μmol/L）、5 μL miR-219-5p 抑制劑（2.5 μmol/L）或等量 的Lipofectamine 3000 試劑盒中的空白對照劑加入SCC4 和SCC9 細(xì)胞系進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。所使用的miRNA 的序列描述如下：miR-219-5p 模擬物，UGAUUGUCCAAACGCAAUUCU；miR-219-5p 模擬物空白對照（miR-NC），UGGAUUCCUUAACUUC CCAA；miR-219-5p 抑制劑，UUCAACCAGGAAA AG-UUGGGAAU；miR-219-5p 抑制劑空白對照（miR-219 inhibitor NC），AUGGCACGUGUACUCC UACAUAC。將濃度為1×106的各細(xì)胞系接種在培養(yǎng)皿中，按照制造商的說明書建議，在37 ℃下用上述試劑共培養(yǎng)48 h。隨后，收集處理過的細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的分析，包括逆轉(zhuǎn)錄定量PCR（RT-qPCR）及Western blot 實(shí)驗(yàn)等。

1.3 miR-219-5p 靶向SOX5 基因及其結(jié)合區(qū)域的驗(yàn)證

根據(jù)miRMine（http://www.microrna.org）在線網(wǎng)站的計(jì)算，預(yù)測SOX5 mRNA 的3′-UTR 序列中miR-219-5p 的結(jié)合位點(diǎn)為5′-GGACCAAA-3′，據(jù)此，設(shè)計(jì)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中相應(yīng)突變位點(diǎn)序列為5′-GCAGGCCA-3′。

應(yīng)用熒光素酶報(bào)告基因檢測驗(yàn)證口腔癌細(xì)胞中miR-219-5p 靶向調(diào)控SOX5 基因。通過分子克隆實(shí)驗(yàn)將野生型（wt）和突變型（mut）序列插入pmirGLO 載體（購自Promega 公司）。在熒光素酶活性測定實(shí)驗(yàn)中，miR-219-5p 模擬物或抑制劑分別用wt-SOX5 和mut-SOX5 或?qū)φ請?bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染口腔癌細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h 后，使用雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)（Promega，Madison，WI）測量螢火蟲（firefly）和海腎（Renilla）的熒光素酶活性，設(shè)定海腎熒光素酶活性作為內(nèi)部對照。螢火蟲的熒光素酶活性以海腎Renilla 的熒光素酶活性為準(zhǔn)做標(biāo)準(zhǔn)化處理。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行3 次。

1.4 RT-qPCR

按發(fā)表文獻(xiàn)的方法描述、運(yùn)用RT-qPCR 檢測各細(xì)胞株中miR-219-5p 和SOX5 的相對表達(dá)水平[3]。參照樣本中U6 的表達(dá)水平對miR-219-5p 的相對表達(dá)量參照進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化[4]。引物設(shè)計(jì)并購自Invitrogen（Thermo Fisher Scientific，Inc.），所用引物序列描述如下，hsa-miR-219-5p：正向，5′-UAUCCACUUGAUCG-GCCUAC-3′；反向5′-GCUCCGCTGUAGACCUAUCUGCA-3′ ；GAPDH，正向5′-CGAGATCCCTCCAAAATCAA-3′，反向5′-TTCACACCCATGACGAACAT-3′；SOX5，正向5′-CGTAACGAGCCTATGCAAT-3′，反向 5′ -TACC GGAAGCTA-CAATGCA-3′。每個(gè)PCR 反應(yīng)由兩部分組成，包括95 ℃初始變性3 min，多次循環(huán)擴(kuò)增（36 個(gè)循環(huán)，95 ℃ 10 s，56.5 ℃ 20 s，75 ℃30 s），隨后95 ℃變性15 s，65 ℃退火10 s，最終95 ℃延伸10 s GAPDH 作為內(nèi)參基因。用2-ΔΔCq法評(píng)價(jià)各基因的相對表達(dá)水平[5]。

1.5 Western blot 分析

Western blot 檢測SOX5 蛋白在個(gè)樣本中的表達(dá)水平。按BCA 檢測試劑盒說明書檢測蛋白濃度。取蛋白質(zhì)樣品（40 μg）用10% SDS-PAGE 分離，轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上（中國碧云天生物）。用5%的脫脂牛奶封閉纖維素膜2 h，隨后，加入一抗SOX5（1∶1000；cat.no.sc- 293215；Santa Cruz 生物技術(shù)公司）和GAPDH（1∶500；cat.no.sc-47724；Santa Cruz 生物技術(shù)公司），4 ℃下孵育過夜。0.01 mol/L PBS 漂洗3 次，每次5 min；HRP 標(biāo)記的二抗IgG（1∶2000；cat.no.sc-516102）在20～24 ℃孵育2 h。用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑（EMD，Millipore）觀察纖維膜上免疫印跡信號(hào)。以GAPDH 作為蛋白表達(dá)的參考。蛋白質(zhì)的印跡結(jié)果采用Bio-Rad 化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，美國）顯影，印跡的條帶采用Image J 軟件（V1.8.0.172，美國）進(jìn)行光密度值的分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS 軟件（SPSS inc.，version21.0，美國）對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用方差分析（ANOVA）和Student-Newman-Keuls 檢驗(yàn)（Student-Newman-Keuls test）測定各組間mRNA 和蛋白表達(dá)水平是否具有顯著性差異。計(jì)量數(shù)據(jù)表述方式采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（standard deviation，SD），P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用Pearson 相關(guān)系數(shù)分析miR-219-5p 與SOX5 的表達(dá)水平是否具有相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 在口腔癌細(xì)胞株中miR-219-5p 表達(dá)下調(diào)、SOX5 表達(dá)上調(diào)

RT-qPCR 及Western blot 的檢測結(jié)果顯示：在人口腔癌細(xì)胞株SCC4 及SCC9 中，miR-219-5p 的表達(dá)下調(diào)（圖1A），與正常細(xì)胞株HF 相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；而SOX5 的基因（圖1B）及蛋白（圖1C）表達(dá)水平顯著增加，與正常細(xì)胞株HF 相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；Pearson 相關(guān)系數(shù)分析合并后各組數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，人口腔癌細(xì)胞株中miR-219-5p 及SOX5 的表達(dá)水平r=-0.869，絕對值接近1，說明miR-219-5p 的表達(dá)水平和SOX5 的表達(dá)水平呈現(xiàn)負(fù)性相關(guān)。

圖1 miR-219-5p 及SOX5 在人口腔癌細(xì)胞株SCC4 及SCC9 中的表達(dá)檢測Fig.1 The expressions of miR-219-5p and SOX5 in oral squamous cell lines SCC4 and SCC9

2.2 miR-219-5p 通過靶向3′-UTR 區(qū)域調(diào)控口腔癌細(xì)胞中SOX5 的表達(dá)

miR-219-5p 通過靶向3′-UTR 區(qū)域調(diào)控口腔癌細(xì)胞中SOX5 的表達(dá)見圖2。

由于SOX5 和miR-219-5p 在口腔癌細(xì)胞中表達(dá)趨勢相反，呈現(xiàn)負(fù)性相關(guān)，筆者推測miR-219-5p 可能通過特定的“種子”區(qū)域靶向調(diào)控SOX5 mRNA 表達(dá)。為了驗(yàn)證這一推測，我們使用miRMine 來預(yù)測SOX5 mRNA 中miR-219-5p可能的結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果表明，SOX5 mRNA 的3′-UTR 上確實(shí)存在miR-219-5p 的結(jié)合位點(diǎn)，SOX5 是miR-219-5p 的潛在靶基因（圖2A，紅色標(biāo)注的為miR-219-5p 與SOX5 mRNA 靶向結(jié)合的潛在位點(diǎn)）。根據(jù)此結(jié)合位點(diǎn)，筆者設(shè)計(jì)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中相應(yīng)突變位點(diǎn)序列為5′-GCAGGCCA-3′（圖2B，黃色標(biāo)示的為突變后的序列）。

接下來的雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)揭示：與相應(yīng)對照組（SOX5 3′UTR-wt+miR-NC）相比，未經(jīng)突變處理的野生型SOX5 3′UTR-wt 與miR-219-5p 模擬物（SOX5 3′UTR-wt+miR-219-5p）聯(lián)合轉(zhuǎn)染可顯著降低SCC4 與SCC9 的熒光素酶活性（P<0.05，圖2C-D）。而在SOX5 種子序列區(qū)做了突變處理即SOX53′-UTR-mut 載體轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中，miR-219-5p 處理均不能誘導(dǎo)SCC4 或SCC9 細(xì)胞中熒光素酶活性降低（SOX5 3′UTR-mut+miR-NC vs.SOX5 3′UTR-mut+miR-219-5，P>0.05，圖2C-D）。

圖2 miR-219-5p 靶向3’-UTR 特異性序列調(diào)控SOX5Fig.2 miR-219-5p regulates SOX5 by binding to specific sites in 3’-UTR

為了進(jìn)一步確定在口腔癌細(xì)胞中miR-219-5p 是否靶向調(diào)節(jié)SOX5 的表達(dá)水平，筆者用miR-219-5p 模擬物或抑制劑處理SCC4 和SCC9 細(xì)胞，隨后檢測SOX5 的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，miR-219-5p 模擬物處理后顯著抑制了SOX5 表達(dá)，而miR-219-5p 抑制劑處理顯著恢復(fù)了SCC4（圖3A～B）和SCC9（圖3C～D）細(xì)胞中SOX5 的表達(dá)水平，與各自的對照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。這些結(jié)果驗(yàn)證了在口腔癌細(xì)胞中miR-219-5p 通過與SOX5 mRNA3′-UTR 中特定的序列結(jié)合而靶向調(diào)控SOX5 的表達(dá)。

3 討論

作為SOX 轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，SOX5 除了在軟骨組織分化、性別決定中起到重要的作用，也是許多疾病的易感基因，可促進(jìn)鼻咽癌[6]、舌癌[3]、肝癌[7]、乳腺癌[8]和前列腺癌[9]等多種腫瘤的發(fā)展與轉(zhuǎn)移。Huang 等發(fā)現(xiàn)SOX5 通過調(diào)控SPARC 的表達(dá)下降來促進(jìn)鼻咽癌的進(jìn)展，同時(shí)SOX5 在鼻咽癌組織中的過表達(dá)與臨床低生存率成正相關(guān)性[6]；在肝癌及乳腺癌中，SOX5 通過Smad3-Sox5-Twist1 信號(hào)通路促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及腫瘤細(xì)胞的入侵[7?8]；在前列腺癌中，SOX5 通過調(diào)控Twist1 的表達(dá)來調(diào)節(jié)TGF-β 誘導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[9]。而本研究發(fā)現(xiàn)SOX5 在人口腔癌組織以及細(xì)胞中表達(dá)異常增加，且其表達(dá)水平

上調(diào)與患者的組織分型、臨床表現(xiàn)及生存率呈現(xiàn)正相關(guān)。本研究首次揭示了SOX5 在人口腔癌腫瘤組織中的表達(dá)，并與患者的臨床表現(xiàn)呈現(xiàn)出惡性相關(guān)，即SOX5 的表達(dá)水平增加可能導(dǎo)致了人口腔癌的惡化與預(yù)后不良。

為了檢測SOX5 表達(dá)水平改變的上游調(diào)控機(jī)制，筆者把研究目標(biāo)轉(zhuǎn)向了miRNA 水平。miRNA 通過與靶基因mRNA 的3′-非翻譯區(qū)（3′-UTR）互補(bǔ)結(jié)合從而誘導(dǎo)靶基因mRNA 的直接降解，進(jìn)而導(dǎo)致靶蛋白表達(dá)下降。目前的研究發(fā)現(xiàn)，超過30%的人類基因受miRNA 調(diào)控，而同一種miRNA 可以調(diào)控?cái)?shù)百種mRNA 的降解[10]。miRNA通過調(diào)節(jié)靶向基因的表達(dá)來參與細(xì)胞增殖與分化、發(fā)育、細(xì)胞凋亡、炎癥及腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移等過程[10?11]。研究表明，miRNA 可以做為原癌基因或腫瘤抑制物來調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)及旗下有信號(hào)通路的傳導(dǎo)[12]。越來越多的研究表明正常組織與癌組織中的miRNA 表達(dá)譜是不一樣的。研究發(fā)現(xiàn)，不同類型的組織或細(xì)胞中都有特異表達(dá)的miRNA，不同癌組織中的特異miRNA 表達(dá)譜可為臨床診斷與治療提供重要的信息。miRNA 參與口腔癌的發(fā)生與發(fā)展過程，越來越多的研究表明，針對特異miRNA，如miR-196a-5p 和miR-145，具有抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌的潛在作用[13?14]，因此，對口腔癌中miRNA 的表達(dá)變化以及其調(diào)控基因的研究，有助于推進(jìn)筆者對口腔癌發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)；同時(shí)miRNA 介導(dǎo)的治療為臨床治療提供了全新的藥物治療靶點(diǎn)依據(jù)。而本研究發(fā)現(xiàn)miR-219-5p 通過特異性與SOX5 基因的3′-UTR 區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平實(shí)現(xiàn)了對SOX5 的表達(dá)沉默，在人口腔癌中靶向調(diào)控了SOX5 的表達(dá)。

值得注意的是，miR-219-5p 做為新的腫瘤相關(guān)miRNA 被證實(shí)參與了多種腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展。miR-219-5p 在包括卵巢癌、胃癌以及結(jié)直腸癌等癌組織中的表達(dá)下調(diào)[15?19]。miR-219-5p 通過調(diào)節(jié)Twist/Wnt/β-catenin 信號(hào)通路來抑制表皮卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲過程[15]；而在胃癌中，miR-219-5p 通過調(diào) 節(jié) LRH-1/Wnt/βcatenin 信號(hào)通路來抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲過程[16]；在結(jié)直腸癌中，miR-219-5p 通過下調(diào)calcyphosin 和PDGF 受體的表達(dá)來抑制癌細(xì)胞的增殖和侵襲過程[17?18]，同時(shí)可以通過下調(diào)LEBF1 的表達(dá)來抑制結(jié)直腸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程[19]。

結(jié)合本研究結(jié)果，miR-219-5p 在人口腔癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平顯著下降、而SOX5 的表達(dá)增加，miR-219-5p 表達(dá)水平下降與SOX5 的表達(dá)水平增加呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，miR-219-5p 模擬物處理后可誘導(dǎo)人口腔癌細(xì)胞中SOX5 的表達(dá)增加，而將SOX5 mRNA 上miR-219-5p 靶向調(diào)控的潛在區(qū)域進(jìn)行突變處理后可以消除miR-219-5p 對SOX5 的表達(dá)調(diào)控。這些結(jié)果提示miR-219-5p 可能通過特異性靶向結(jié)合SOX5 基因的3′非編碼區(qū)調(diào)控了SOX5 的表達(dá)；在口腔癌中miR-219-5p 的表達(dá)缺失，導(dǎo)致SOX5 表達(dá)失控而異常增加，可能與口腔癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果為口腔癌靶點(diǎn)基因的甄選及開展臨床靶向治療奠定了基礎(chǔ)。