天然藥物蘇木對人工脫礦釉質(zhì)齲的再礦化作用

李茹芳 ，李秋艷 ，崔 霞 ，趙 霞 ，王麗梅 ，藍 海

（1）大理大學藥學院，云南 大理 671000;2）大理白族自治州人民醫(yī)院口腔科，云南 大理 671000）

齲病的發(fā)生是由于口腔細菌失衡引起牙體硬組織慢性破壞的感染性疾病。目前最有效的防齲藥物是氟制劑[1]，但長期使用會導致抗酸耐氟菌株的產(chǎn)生，且容易引起氟中毒[2]。防齲疫苗也在飛速發(fā)展，其安全性和臨床運用還有差距。因此，天然藥物的防齲備受關(guān)注。

近年來，關(guān)于蘇木（Caesalpinia sappanL.）活性研究主要集中在抗腫瘤[3?4]和免疫抑制[5]方面，尤其在抗器官移植排斥反應方面的報道較多[6]，同時，蘇木還具有良好的抑菌、殺菌效果[7?10]。課題組前期實驗證實蘇木對口腔致齲菌有抑制效果，但對牙齒硬組織生物礦化的研究還未見報道，本實驗將研究蘇木對釉質(zhì)齲的再礦化作用，為開發(fā)天然防齲藥物奠定理論和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑

蘇木藥材2018 年購于大理市中藥材批發(fā)市場，產(chǎn)地：廣西，分裝日期：20180409。經(jīng)大理大學藥學院張德全教授鑒定為豆科云實屬蘇木植物。

冰乙酸、氯化鉀（天津市風船化學試劑科技有限公司）；二水氯化鈣（國藥集團化學試劑有限公司）；磷酸二氫鉀（天津市化學試劑研究所）；75%乙醇、石油醚、正丁醇、乙酸乙酯（上海申博化工有限公司）。以上試劑均為分析純。

變形鏈球菌菌種（S.m）（廣東微生物菌種保藏中心）；TPY 液體培養(yǎng)基（青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司）；氯己定（國藥集團）；人工唾液（上海源葉生物科技有限公司）。

1.2 主要儀器

高速多功能粉碎機（上海塞耐機械有限公司）；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海-恒科技有限公司）；自動轉(zhuǎn)塔數(shù)顯顯微維氏硬度計（依工測試測量儀器儀器上海有限公司）；YMP-2B 金相試樣磨拋機（蘇州歐卡精密光學儀器有限公司）；ZQX-1 全自動金相試樣鑲嵌機（蘇州歐卡精密光學儀器有限公司）；日立S-3400N 掃描電子顯微鏡。

1.3 方法

1.3.1 藥材的萃取藥材粉碎，75% 乙醇加熱回流提取3 次，2 h/次，提取液合并，減壓濃縮至無醇味。將部分濃縮液加適量的水，依次使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水萃取，得到乙酸乙酯、正丁醇和水3 個萃取部位，減壓濃縮并冷凍干燥得各萃取部位凍干粉備用，石油醚萃取部位量太少棄去。

1.3.2 菌液的制備菌種在TPY 固體培養(yǎng)基中復蘇48 h，體視顯微鏡觀察無雜菌后在TPY 液體培養(yǎng)基中增菌18 h，離心，沉積菌用無菌生理鹽水稀釋，得到大約1.5×108cfu/mL 菌液備用[11]。

1.3.3 最低抑菌濃度（MIC）值的測定將蘇木乙醇提取物及各萃取物分別溶于TPY 液體培養(yǎng)基中，二倍稀釋法配制濃度為10.0 0，5.00 0，2.50 0，1.25 0，0.625 0，0.312 5，0.156 2 mg/mL，取配好的菌液20 μL 和不同濃度藥液2 mL 于12 孔板中培養(yǎng)48 h，體視顯微鏡觀察沒有菌落生長的含藥液濃度為MIC[11?12]。陽性對照為0.05%的氯己定，陰性對照為TPY 培養(yǎng)基。以上實驗重復3 次，見表1。

表1 不同溶劑萃取物對變形鏈球菌的MIC 值（mg/mL，n=3）Tab.1 MIC values of different solvent extracts against Streptococcus mutans（mg/mL，n=3）

1.3.4 牙釉質(zhì)硬度的測量[13?15]試液的配制脫礦液：0.15 mol/L KCl，調(diào) pH 至 4.50，定容至1000 mL。酸性緩沖液：50 mmol/L HAc，1.35 mmol/L KH2PO4，2.25 mmol/L CaCl2，130 mmol/L KCl，調(diào)pH 至5.50，定容至1000 mL。牙釉質(zhì)樣本的準備 ：新鮮牛牙齒，剔除軟組織，分離牙冠和牙根，牙冠用超聲清洗器超聲30 min，選取無裂痕、齲損、氟斑的牙冠去離子水沖洗、晾干。開窗（5 mm×5 mm），用磨拋機將牙冠表面打磨成光滑平面，用自動轉(zhuǎn)塔數(shù)顯顯微維氏硬度計測牙釉質(zhì)硬度，篩選硬度值（330±10）kg/mm2（P>0.05）的樣本，得到初始硬度值SMH0。

牙釉質(zhì)的脫礦 ：樣本隨機分為8 個組（有1組不脫礦），每組10 顆牙齒（6 顆用于硬度測試，4 顆用于掃描電鏡觀察），分別浸泡在等量的脫礦溶液中，37℃恒溫，每天更換新配脫礦液，連續(xù)脫礦10 d。按2.4.2 的方法測牙釉質(zhì)脫礦后的硬度值，得到SMH1。牙釉質(zhì)的再礦化 ：脫礦后的樣本取出編號，A 組是脫礦前，B 組脫礦后，C 組是陰性組（去離子水），D 組是陽性組（NaF 20 mg/mL），E 組是乙醇提取物，F(xiàn) 組是乙酸乙酯萃取部位，G 組是正丁醇萃取部位，H 組是水萃取部位，以上4 個實驗組用藥濃度為變形鏈球菌的MIC 值，開窗脫礦面按間隔3 h 的時間節(jié)點用藥，用藥時間10 min/次，去離子水沖樣本后，酸性緩沖液中浸泡30 min，再放入人工唾液30 min，每天循環(huán)3 次，共14 d。各組隨機取出6 顆牛切牙測牙釉質(zhì)再礦化后的硬度值，得到SMH2。

SMH0為初始硬度值，SMH1為脫礦后硬度值，SMH2為再礦化后硬度值。?SMH1=SMH2-SMH1，是初步評估蘇木的再礦化能力。硬度恢復率SMHR%表示牙齒再礦化后硬度的恢復情況。SMHR%=[（SMH2-SMH1）÷（SMH0-SMH1）]×100%。

1.4 掃描電鏡（SEM）觀察脫礦釉質(zhì)表面[16?17]

釉質(zhì)樣本4 顆，干燥，2 次噴鉑后置掃描電鏡（SEM）15.0 KV，放大5000 倍下觀察釉質(zhì)樣本表面形態(tài)變化，見圖1。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件對樣本顯微硬度值進行統(tǒng)計處理，計量資料以（）表示，組間比較采用SNK-q 檢驗，組內(nèi)比較采用配對t檢驗（α=0.05），P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 蘇木萃取物MIC 值

蘇木4 種萃取物對變形鏈球菌的MIC 均為2.500 mg/mL。以下實驗的藥物濃度為此濃度，見圖1。

圖1 SEM 觀察釉質(zhì)齲再礦化后的表面形態(tài)Fig.1 Surface morphology of enamel caries after remineralization observed by SEM

2.2 牙釉質(zhì)脫礦及再礦化后硬度測量

脫礦前選取硬度值在（330±10）kg/mm2左右的樣本，各組樣本顯微硬度值無顯著性差異（P>0.05）；脫礦后各組間顯微硬度值也無顯著性差異（P>0.05）。各實驗組的 ?SMH1與陰性組相比有統(tǒng)計學意義（P<0.05），效果最好的是水萃取部位組。各實驗組對釉質(zhì)齲都有提高硬度恢復率的作用，與陰性組相比均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其中水萃取部位組硬度恢復率高于其它實驗組（P<0.05），達到66.9%，但低于陽性組（P<0.05），見表2。

表2 各實驗組對牙釉質(zhì)硬度的影響（，n=6）Tab.2 Effects of different experimental groups on enamel hardness（，n=6）

表2 各實驗組對牙釉質(zhì)硬度的影響（，n=6）Tab.2 Effects of different experimental groups on enamel hardness（，n=6）

與陽性組比較，*P < 0.05；與陰性組比較，#P < 0.05；任意兩實驗組比較，&P < 0.05。

2.3 牙釉質(zhì)脫礦及再礦化SEM 觀察

脫礦前牙體表面平整光滑無異物。經(jīng)過10 d脫礦處理后釉質(zhì)表面出現(xiàn)凹坑，釉質(zhì)被溶解，表面呈現(xiàn)較大間隙。陽性對照組可見釉質(zhì)表面有球形礦物質(zhì)沉積，相對光滑。陰性對照組牙體表面出現(xiàn)規(guī)則凹坑，有少量沉積物。乙醇提取物組釉質(zhì)表面有礦物質(zhì)沉積，鱗片狀凹陷變淺，沉積物疏松；乙酸乙酯萃取部位組、正丁醇萃取部位組和水萃取部位組表面均有不同程度的顆粒狀沉積物，覆蓋脫礦縫隙，凹陷不同程度變淺，見圖1。

3 討論

齲病是一種常見的口腔疾病，疾病的發(fā)生與發(fā)展和致齲菌過度生長有關(guān)[18]。致齲菌利用碳水化合物無氧條件下產(chǎn)生乳酸，同時使口腔環(huán)境pH 下降，導致牙釉質(zhì)脫礦繼而發(fā)生齲病[19]。正常情況下，釉質(zhì)脫礦和再礦化過程不是獨立過程，而是相互交替的動態(tài)平衡過程。

有研究證實從中藥蘇木中分離得到了包括蘇木素類、原蘇木素類、高異黃酮類、黃酮類、查耳酮類等多種成分[20?21]。本研究發(fā)現(xiàn)蘇木乙醇提取物和各萃取部位均有良好的抑菌效果。在生物礦化實驗中，各實驗組對牙釉質(zhì)都有良好的修復作用，其中水萃取部位硬度恢復率可達66.9%。SEM 觀察發(fā)現(xiàn)，脫礦牙釉質(zhì)表面呈現(xiàn)典型早期釉質(zhì)齲，牙體表面出現(xiàn)凹陷及不規(guī)則鱗狀突起。經(jīng)蘇木各提取部位再礦化處理后的釉質(zhì)表面均有顆粒狀沉積物，牙體表面的凹陷減少且變淺，從形態(tài)學上證明蘇木乙醇提取物和各萃取部位能夠促進脫礦牙釉質(zhì)的再礦化。

綜上所述，中藥蘇木對口腔致齲菌有明顯的抑制作用同時對齲齒有明顯的修復作用，具有的潛在防齲效果，從而可以抑制齲病的發(fā)生和發(fā)展。