營養(yǎng)液臭氧消毒頻次對水培苗用大白菜（快菜）生長及微生物環(huán)境的影響

賈姊薇 王麗萍 季延海 王學瑾 武占會 王素娜 王 星 梁 浩*

（1 河北工程大學園林與生態(tài)工程學院，河北邯鄲 056009；2 北京市農(nóng)林科學院蔬菜研究所，北京 100097；3 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點實驗室，北京 100097）

快菜（Brassica rapavar.glabraRegel）是一種早熟苗用型大白菜，生長速度快，且營養(yǎng)豐富，受到種植戶的喜愛。以水培方式進行快菜種植，產(chǎn)量高，品質(zhì)穩(wěn)定，便于自動化管理，能夠?qū)崿F(xiàn)周年多茬生產(chǎn)（王麗紅，2010）。管道式水培是輕簡高效無土栽培方式之一，栽培管道連接營養(yǎng)液儲蓄桶，24 h 循環(huán)供應營養(yǎng)液，其標準化程度高，葉菜產(chǎn)品接近凈菜標準。在蔬菜生產(chǎn)過程中，除了對環(huán)境、營養(yǎng)供給等精準調(diào)控外，也有必要對循環(huán)營養(yǎng)液的微生物環(huán)境進行調(diào)控（Miller et al.，2013；Fan，2021）。由于反復使用的營養(yǎng)液可能出現(xiàn)有害生物，包括病原微生物（細菌、真菌）、浮游動植物（藻類、原生動物）、線蟲等（陳磊夫 等，2020），通過空氣、水、種子、基質(zhì)、器具、人工操作等途徑進入栽培系統(tǒng)，生產(chǎn)過程中容易引起營養(yǎng)液環(huán)境污染，特別是夏季高溫常伴隨細菌性病害發(fā)生，存在潛在的商品性下降及食品安全風險（Carvajal-Yepes et al.，2019），而目前尚缺乏安全可行的處理方法。前人針對水培或基質(zhì)栽培系統(tǒng)中病原菌的傳播規(guī)律做了大量研究，因營養(yǎng)液一直處在循環(huán)中，容易滋生細菌等，又因營養(yǎng)液在整個栽培系統(tǒng)中循環(huán)，容易導致大面積病害發(fā)生，嚴重時導致整批次作物死亡（王冬華 等，2005）。借鑒李倩（2019）的研究結(jié)果可預判病原菌在潮汐式灌溉過程中的發(fā)病規(guī)律。Runia 和Amsing（1996）在種植玫瑰的苗圃進行試驗，使用未滅菌的營養(yǎng)液在巖棉塊無土栽培系統(tǒng)中循環(huán)利用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病原體迅速擴散，且玫瑰植株越小越易感染病菌。

臭氧消殺技術(shù)是通過外源臭氧氣體對營養(yǎng)液進行接觸式消滅病原菌（Guo &Wang，2017；袁也等，2019），在控制細菌性病害的同時，多余臭氧分子可快速分解為氧氣，無污染、無殘留，在合理濃度下不會對植株造成影響（王海明，2005；呂武軒，2006），是一種安全的廣譜性消殺方法（宋衛(wèi)堂 等，2007；劉照啟 等，2020）。本試驗設計的營養(yǎng)液消毒系統(tǒng)由管道式水培系統(tǒng)、營養(yǎng)液儲蓄桶、循環(huán)水泵、臭氧發(fā)生器組成，以快菜品種京研快菜4 號為試材，采用在循環(huán)營養(yǎng)液中通入臭氧曝氣的方式（潘劍蕾，2019），研究不同頻次臭氧消毒對快菜細菌性病害的抑制作用以及對產(chǎn)量和品質(zhì)的影響，以期解決水培系統(tǒng)水體微生物環(huán)境的潛在危害，為水培凈菜生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2022 年6—7 月在北京市農(nóng)林科學院蔬菜研究所的連棟溫室內(nèi)進行。試驗期內(nèi)，溫室白天平均溫度為34.9 ℃，最高達到43.9 ℃；夜間平均溫度為26.5 ℃，最低至19.5 ℃；白天平均空氣相對濕度為35.1%，夜間為65.2%；循環(huán)營養(yǎng)液白天平均溫度為32.4 ℃，夜間為26.9 ℃。

供試快菜品種為北京市農(nóng)林科學院蔬菜研究所（原北京市農(nóng)林科學院蔬菜研究中心）培育的京研快菜4 號（余陽俊 等，2013）。將種子點播至充分泡水的海綿塊中，暗處理2 d 后放置在盛有營養(yǎng)液的苗床上進行育苗；幼苗四葉一心期定植于管道式水培架上，管道式水培系統(tǒng)如圖1 所示。臭氧發(fā)生器購自青島奧宗尼爾凈化設備有限公司，型號為SW-003-30G，臭氧輸出量為30 g·h-1，功率為350 W，輸出端配置曝氣頭；該臭氧發(fā)生器是利用雷擊放電產(chǎn)生臭氧的原理，以空氣為原料，采用沿面陡變放電技術(shù)釋放高濃度臭氧，曝氣時臭氧濃度達到20 mg·m-3。營養(yǎng)液使用北京市農(nóng)林科學院蔬菜研究所研發(fā)的無土栽培營養(yǎng)液改良配方，并使用凈化水進行配制，主要成分為：TN 119.2 mg ·L-1，NO3--N 107.5 mg·L-1，NH4+-N 11.7 mg·L-1，P2O555.0 mg·L-1，K2O 185.6 mg·L-1，Mg 27.5 mg ·L-1，Ca 105.4 mg·L-1，F(xiàn)e 1.4 mg·L-1，EC 值1.17 dS·m-1。

圖1 管道式水培系統(tǒng)

1.2 試驗設計

將臭氧發(fā)生器前端的曝氣頭置入營養(yǎng)液儲蓄桶中，產(chǎn)生臭氧對循環(huán)營養(yǎng)液進行消毒。設置3 個消毒頻次處理：T1，每1 d 通1 次；T2，每3 d 通1 次；T3，每7 d 通1 次；從定植日開始，至采收結(jié)束，每次通臭氧的時長為10 min。以不通臭氧為對照（CK），采用完全隨機排列，3 次重復，每重復50株。植株生長期間，調(diào)查各處理由高溫引起的細菌性病害（本試驗中主要是軟腐病）發(fā)生情況；定植后30 d 采收、取樣，進行各項指標的測定。

1.3 項目測定

1.3.1 快菜軟腐病發(fā)病情況 定植后，采用計數(shù)法每5 d 統(tǒng)計1 次植株發(fā)病情況，計算發(fā)病率；至快菜采收（定植后30 d）共統(tǒng)計了6 次。

1.3.2 營養(yǎng)液中細菌含量 使用滅菌的容量瓶分別從各處理營養(yǎng)液儲蓄桶中相同位置取10 mL 營養(yǎng)液，在無菌操作臺上稀釋至1 × 108倍，使用接種環(huán)在肉汁凍培養(yǎng)基（NA）上采用涂布的方式培養(yǎng)24 h，采用平板計數(shù)法進行計數(shù)，計算營養(yǎng)液中的細菌含量。

1.3.3 營養(yǎng)液中微生物種類 使用滅菌的容量瓶分別從各處理營養(yǎng)液儲蓄桶中相同位置取500 mL 營養(yǎng)液，將0.22 μm 醋酸纖維微孔濾膜固定在抽濾瓶中，并連接真空抽濾泵，對營養(yǎng)液進行真空抽濾；然后用鑷子將濾有微生物的濾膜取出，放入凍存管中，液氮處理后保存于-80 ℃冰箱，之后送至上海歐易生物醫(yī)學科技有限公司進行16S 生物多樣性分析。

循環(huán)營養(yǎng)液中的微生物環(huán)境是非常復雜的，通過高通量測序技術(shù)對序列可變區(qū)域進行檢測與對比，分析不同頻次臭氧消毒后循環(huán)營養(yǎng)液中縱向微生物群落結(jié)構(gòu)的變化（董志龍，2020）。使 用QIIME 2 軟 件（Bolyen et al.，2019）中 的DADA2 經(jīng)過降噪，去除嵌合體后，對序列進行去重，得到的ASVs（amplicon sequence variant，擴增子序列變異）代表序列，然后進行分類學分析。

1.3.4 快菜農(nóng)藝性狀及生理指標 每處理隨機選取3 株長勢均勻的植株，記錄單株葉片數(shù)；使用直尺測量葉長（L）和葉寬（W），運用橢圓面積公式（S=π ×L×W）估算葉面積；分別稱量地上部和根部鮮質(zhì)量，然后105 ℃殺青30 min，75 ℃烘干至恒重，分別稱量地上部和根部干質(zhì)量；采用乙醇浸提比色法測定葉片光合色素含量，采用2，6-二氯酚靛酚滴定法測定VC 含量，采用蒽酮比色法測定可溶性糖含量，采用考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白含量（王學奎，2006）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 20.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素分析，差異性則通過Duncan 法分析比較及LSD（P＜0.05）判斷。采用Microsoft Excel 2010 軟件統(tǒng)計分析試驗數(shù)據(jù)及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 營養(yǎng)液不同臭氧消毒頻次對快菜軟腐病發(fā)病率的影響

由圖2 可知，未進行臭氧消毒的對照快菜軟腐病發(fā)病率采收期達到70%，而通入臭氧消毒后發(fā)病率顯著降低，并隨著消毒頻次的增加發(fā)病率逐漸降低，T3（每7 d 通1 次）處理的采收期發(fā)病率僅為6%，T2（每3 d 通1 次）和T1（每1 d 通1次）處理整個生長期均未發(fā)病。表明，在循環(huán)營養(yǎng)液中通入臭氧消毒可有效控制快菜細菌性軟腐病的發(fā)生。

圖2 營養(yǎng)液不同臭氧消毒頻次對快菜軟腐病發(fā)病率的影響

2.2 不同臭氧消毒頻次對營養(yǎng)液中細菌含量的影響

由圖3 可知，3 個頻次臭氧消毒處理的營養(yǎng)液中細菌含量均顯著低于對照；同時，隨著臭氧消毒頻次的增加，營養(yǎng)液中細菌含量亦顯著降低。

圖3 不同臭氧消毒頻次對營養(yǎng)液中細菌含量的影響

2.3 不同臭氧消毒頻次對營養(yǎng)液中微生物群落多樣性的影響

由ASVs 分布花瓣圖可以看出（圖4），通入臭氧會對快菜營養(yǎng)液中微生物種類產(chǎn)生明顯影響，微生物種類比對照降低了約50%，但3 個頻次臭氧處理的快菜營養(yǎng)液中微生物種類差異不大，ASVs數(shù)量CK ＞ T1 ≈ T2 ≈ T3，其中共同含有105 條ASVs。說明通入臭氧對快菜營養(yǎng)液的微生物環(huán)境有一定的抑制作用，但通入臭氧的頻次對快菜營養(yǎng)液的微生物環(huán)境并無較大影響。

圖4 不同臭氧消毒頻次處理的營養(yǎng)液中微生物種類ASVs 分布

2.4 營養(yǎng)液不同臭氧消毒頻次對快菜生長指標的影響

由表1 可知，T2（每3 d 通1 次）處理的快菜各生長指標均最高，地上部鮮質(zhì)量和干質(zhì)量顯著高于對照，比對照分別提高了2.71%與0.97%；根鮮質(zhì)量和干質(zhì)量、葉片數(shù)、葉面積各處理間無顯著差異。

表1 營養(yǎng)液不同臭氧消毒頻次對快菜生長指標的影響

2.5 營養(yǎng)液不同臭氧消毒頻次對快菜葉片光合色素含量的影響

由表2 可知，不同頻次臭氧處理對快菜葉片光合色素含量無顯著影響，其中T2（每3 d 通1次）處理的葉片葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b、類胡蘿卜素含量均為最高，比對照分別增加了24.69%、16.73%、22.52%、38.62%。

表2 營養(yǎng)液不同臭氧消毒頻次對快菜葉片光合色素含量的影響

2.6 營養(yǎng)液不同臭氧消毒頻次對快菜品質(zhì)的影響

由表3 可知，不同頻次臭氧處理的快菜VC 含量均低于對照，其中T2（每3 d 通1 次）處理的VC 含量與對照差異不顯著；3 個頻次臭氧處理的可溶性糖含量均顯著高于對照，T2 處理的可溶性蛋白含量也顯著高于對照。

表3 營養(yǎng)液不同臭氧消毒頻次對快菜品質(zhì)的影響

3 討論與結(jié)論

由于北京市農(nóng)林科學院蔬菜研究所快菜種植區(qū)的管道式水培系統(tǒng)中營養(yǎng)液為循環(huán)使用，且栽培系統(tǒng)不易清理，日光溫室內(nèi)的溫度又非常適合細菌生長，營養(yǎng)液儲蓄桶中的微生物環(huán)境無法得到有效控制，病原菌進入循環(huán)系統(tǒng)后迅速繁衍，當快菜長至壯苗期時，葉柄底端與管道式水培架上的栽培孔產(chǎn)生摩擦形成傷口，循環(huán)營養(yǎng)液中的病原菌由傷口處進入快菜植株，從而導致快菜細菌性病害的發(fā)生。本試驗結(jié)果表明，在高溫夏季對水培快菜循環(huán)營養(yǎng)液進行臭氧消毒處理，隨著通入臭氧頻次的增加，營養(yǎng)液中細菌含量顯著降低，快菜植株的軟腐病發(fā)病率也逐漸降低，T2（每3 d 通1 次）和T1（每1 d 通1 次）處理整個生長期均未發(fā)??；3 個頻次臭氧處理的營養(yǎng)液中微生物種類均較對照降低了約50%。表明使用臭氧對循環(huán)營養(yǎng)液進行消毒殺菌，可以通過控制潛在發(fā)病菌的種類和數(shù)量來控制高溫引起的快菜細菌性病害的發(fā)生。需要注意的是，通入臭氧的濃度過高可能會對快菜植株造成消極影響，從而出現(xiàn)高濃度臭氧水處理的植株生長量低于較低濃度臭氧水處理的現(xiàn)象（張涵 等，2021）；此外，通入臭氧的位置不宜距離植株過近，否則容易對植株葉片造成傷害，短時間內(nèi)表現(xiàn)為葉綠素的破壞（韓偉 等，2019）。

本試驗中，在對水培快菜循環(huán)營養(yǎng)液達到殺菌目的的同時，向營養(yǎng)液中通入臭氧也對快菜植株生長和品質(zhì)改善有促進作用。綜合植株生理指標及節(jié)能考慮，T2（每3 d 通1 次，每次10 min）處理為最優(yōu)處理方式，快菜植株地上部鮮質(zhì)量和干質(zhì)量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量均顯著高于對照，根鮮質(zhì)量和干質(zhì)量、葉片數(shù)、葉面積、葉綠素a 含量、葉綠素b 含量、葉綠素a+b 含量、葉綠素a/b、類胡蘿卜素含量也高于對照；但對VC 的累積表現(xiàn)消極影響。

在本試驗條件下，采用對循環(huán)營養(yǎng)液通入臭氧的方式進行殺菌，用于防治快菜細菌性軟腐病具有可行性。但后續(xù)研究及應用仍存在以下問題：一方面，臭氧水雖然可以迅速殺滅病原微生物，但不具有選擇性，有益微生物與病原微生物都可能被殺滅，因此有必要對造成夏季高溫關(guān)聯(lián)腐生病害的致病菌進一步進行分離、鑒定，系統(tǒng)研究特定致病菌的發(fā)病機理；另一方面，臭氧在水中溶解率低，難以穩(wěn)定溶解于營養(yǎng)液中從而會外溢至周圍空氣中，空氣臭氧濃度積累過多可能會對人和植物造成潛在傷害。