一碳資源在酵母中的利用與轉(zhuǎn)化

郭峰，張尚杰，蔣羽佳，姜萬(wàn)奎，信豐學(xué)，2，章文明，2，姜岷，2

（1 南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211816；2 南京工業(yè)大學(xué)江蘇先進(jìn)生物與化學(xué)制造協(xié)同創(chuàng)新中心(SICAM)，江蘇 南京 211816）

煤、石油、天然氣等化石燃料是當(dāng)今人類社會(huì)生產(chǎn)生活中必不可少的能源。然而由于化石燃料的有限性以及在利用過(guò)程中難以避免帶來(lái)的環(huán)境污染問(wèn)題，傳統(tǒng)的石化行業(yè)在實(shí)現(xiàn)“雙碳”目標(biāo)的當(dāng)下面臨著更大的挑戰(zhàn)。近年來(lái)，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)生物基產(chǎn)品的綠色生物制造吸引了越來(lái)越多的關(guān)注，發(fā)展生物制造已經(jīng)成為了我國(guó)的重要戰(zhàn)略需求。傳統(tǒng)的生物發(fā)酵過(guò)程主要以谷物等農(nóng)作物為原料，存在“與民爭(zhēng)糧”的問(wèn)題[1]。在當(dāng)前日趨復(fù)雜的國(guó)際形勢(shì)下，尋找利用非糧原料作為生物發(fā)酵過(guò)程的原料，避免與“與民爭(zhēng)糧”“與糧爭(zhēng)地”，對(duì)于保障我國(guó)的糧食安全具有非凡的意義[2]。

以甲醇、甲酸和二氧化碳為代表的非糧一碳原料具有儲(chǔ)量豐富、來(lái)源廣泛以及價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，通過(guò)CO2催化加氫合成甲醇和甲酸的技術(shù)日趨成熟，相比于限制碳排放，對(duì)CO2的轉(zhuǎn)化和再利用不僅能夠緩解溫室效應(yīng)，也是助力碳達(dá)峰、碳中和目標(biāo)的重要手段[3]。通過(guò)微生物利用一碳原料并將它們轉(zhuǎn)化為生物燃料以及化學(xué)品能夠減少發(fā)酵行業(yè)對(duì)傳統(tǒng)糖基碳源的依賴，是未來(lái)綠色生物制造的重要方向（圖1）。自然界中天然的甲基營(yíng)養(yǎng)菌主要包括甲基營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌與酵母兩大類。天然甲基營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌以甲醇芽孢桿菌和扭脫甲基桿菌為代表，分別通過(guò)核酮糖?5?磷酸循環(huán)以及絲氨酸循環(huán)進(jìn)行甲醇同化。近年來(lái)，通過(guò)將天然的原核甲醇同化途徑引入模式菌株，并結(jié)合適應(yīng)性馴化的手段，已經(jīng)在大腸桿菌[4]和谷氨酸棒桿菌[5]中成功實(shí)現(xiàn)了甲醇的同化。2020年，Chen等[6]通過(guò)代謝途徑的理性設(shè)計(jì)結(jié)合適應(yīng)性馴化，首次實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中以甲醇為唯一碳源的生長(zhǎng)，標(biāo)志著人工甲基營(yíng)養(yǎng)菌的構(gòu)建有了突破性的進(jìn)展。類似地，在甲酸和CO2的利用方面，Kim 等[7]以及Gleizer 等[8?9]分別通過(guò)在大腸桿菌中表達(dá)還原性甘氨酸途徑以及Calvin?Benson Bassham（CBB）循環(huán)實(shí)現(xiàn)了以一碳原料為唯一碳源下的生長(zhǎng)。然而不同于細(xì)菌，對(duì)于甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母的關(guān)注則較為有限。例如，作為天然的甲基營(yíng)養(yǎng)菌，畢赤酵母長(zhǎng)期被用作生產(chǎn)重組蛋白的優(yōu)秀菌株，但是以其作為底盤細(xì)胞生產(chǎn)生物基化學(xué)品的潛力卻長(zhǎng)期被低估，直到近年來(lái)才得到有限的關(guān)注[10]。另一方面，開(kāi)發(fā)人工甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母的研究也是相對(duì)滯后的。盡管已經(jīng)成功在釀酒酵母[11?12]以及解脂耶氏酵母[13]中構(gòu)建了甲醇同化途徑，但是這些工程菌株目前仍難以在不添加酵母粉或木糖等輔助底物的前提下以甲醇作為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)。

圖1 一碳資源的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程

與細(xì)菌相比，酵母宿主生長(zhǎng)速率更慢，培養(yǎng)條件更高，且成本更高[14]。然而，酵母也擁有許多細(xì)菌不具備的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。①酵母對(duì)極端條件尤其是酸堿性的耐受性更強(qiáng)。例如在有機(jī)酸的生產(chǎn)過(guò)程中，隨著有機(jī)酸的不斷積累，發(fā)酵菌株會(huì)面臨低pH 脅迫。因此，細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)有機(jī)酸的過(guò)程需要始終監(jiān)視pH 的變化并不斷補(bǔ)堿[15]。與之相反，酵母的耐酸性使得其可以在較低的pH 條件下依舊保持較好的活力，甚至在發(fā)酵過(guò)程中不必補(bǔ)堿調(diào)控pH[10]。②酵母作為真核生物，具有細(xì)菌所不具有的細(xì)胞器。以甲醇酵母畢赤酵母為例，甲醇的同化被定位在過(guò)氧化物酶體中，避免了一碳原料及其代謝過(guò)程中產(chǎn)生的有害中間代謝物如甲醇、甲醛和甲酸等進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)造成影響。綜上，開(kāi)發(fā)酵母作為甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，盡管目前尚未得到充分的重視。本文將系統(tǒng)地總結(jié)酵母利用一碳原料中的甲醇、甲酸和二氧化碳的最新研究進(jìn)展，并探討一碳原料利用的瓶頸以及將其轉(zhuǎn)化為生物基化學(xué)品所面臨的機(jī)遇與挑戰(zhàn)。

1 酵母細(xì)胞利用甲醇進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化

1.1 天然甲醇酵母利用甲醇生產(chǎn)化學(xué)品

在眾多一碳原料中，甲醇的生物轉(zhuǎn)化較為容易。相比于甲烷、二氧化碳和一氧化碳等氣態(tài)的一碳原料，液態(tài)的甲醇更易儲(chǔ)存和運(yùn)輸，避免了氣體底物存在的傳質(zhì)問(wèn)題[16]。天然的甲醇酵母主要包括巴斯德畢赤酵母（Komagataella phaffii）、多形漢遜酵母（Ogataea polymorpha）以及博伊丁假絲酵母（Candida boidinii）[17]。由于具有嚴(yán)格調(diào)控以及高表達(dá)的甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，甲醇酵母尤其是巴斯德畢赤酵母被廣泛用于重組蛋白的表達(dá)。然而，以甲醇酵母作為底盤細(xì)胞構(gòu)建高效的微生物細(xì)胞工廠，利用甲醇作為底物進(jìn)行化學(xué)品的生產(chǎn)目前仍處于起步階段。由于基因操作工具的限制，目前的報(bào)道主要集中于巴斯德畢赤酵母中，而較少涉及其他甲醇酵母（表1）。

開(kāi)發(fā)甲醇酵母利用甲醇生產(chǎn)化學(xué)品的主要挑戰(zhàn)在于兩個(gè)方面。

（1）甲醇酵母作為Crabtree?negative 菌株，其攝取的底物幾乎全部用于細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，而極少產(chǎn)生乙醇等溢出代謝物[18]。這樣的特性使得甲醇酵母能夠快速地積累較高的生物量，對(duì)于以重組蛋白為代表的與生物量積累緊密相關(guān)的產(chǎn)品是極為有利的。然而，有限的碳通量幾乎全部被用于細(xì)胞生長(zhǎng)和生物量的積累，導(dǎo)致甲醇酵母的代謝物積累減少，不利于化學(xué)品的生產(chǎn)。一個(gè)代表性的例子是，盡管在甲醇酵母巴斯德畢赤酵母[19]、多形漢遜酵母[20]和博伊丁假絲酵母[21]均嘗試過(guò)構(gòu)建乙醇合成途徑，然而獲得的乙醇產(chǎn)量（<20g/L）均遠(yuǎn)低于釀酒酵母中能夠達(dá)到的水平（>90g/L）。因此，選擇合適的目標(biāo)產(chǎn)物對(duì)于甲醇酵母細(xì)胞工廠的開(kāi)發(fā)是極為重要的。鑒于甲醇酵母高密度發(fā)酵以及甲醇代謝過(guò)程中能夠產(chǎn)生大量還原力的特點(diǎn)，利用甲醇酵母生產(chǎn)脂肪酸是一個(gè)理想的選擇。Cai 等[22]通過(guò)敲除長(zhǎng)鏈脂肪?；o酶A 合成酶Faa1 和Faa2，工程畢赤酵母菌株能夠分別以葡萄糖和甲醇作為碳源積累860mg/L 和415mg/L 的游離脂肪酸。通過(guò)進(jìn)一步地增強(qiáng)乙酰輔酶A 通量、強(qiáng)化輔因子NADPH 供給以及表達(dá)磷酸二羥丙酮合酶（Das2）緩解甲醇代謝的壓力，最終的工程菌株能夠以甲醇作為唯一碳源生產(chǎn)23.4g/L的游離脂肪酸，收率為0.078g/g甲醇。這一收率已經(jīng)接近以葡萄糖作為底物時(shí)在釀酒酵母中生產(chǎn)游離脂肪酸的水平。類似地，以甲醇作為底物生產(chǎn)游離脂肪酸的嘗試在多形漢遜酵母中取得了成功[23]。值得關(guān)注的是，不同于畢赤酵母，在多形漢遜酵母中敲除Faa1 后，重組菌株盡管能夠以葡萄糖作為碳源積累游離脂肪酸，卻失去了以甲醇作為底物生長(zhǎng)的能力。對(duì)此，該作者通過(guò)18 代連續(xù)的適應(yīng)性馴化，使重組菌株恢復(fù)了在甲醇最小培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的能力，同時(shí)能夠積累280～450mg/L游離脂肪酸。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過(guò)代謝通路優(yōu)化以及輔因子調(diào)控，最終菌株能夠全程以甲醇作為唯一碳源積累15.9g/L 游離脂肪酸。除了脂肪酸及其衍生物（脂肪醇[22]、蓖麻油酸[24]、長(zhǎng)鏈α?烯烴[25]等）以外，另一類能夠充分利用甲醇代謝產(chǎn)生的還原力的化學(xué)品是萜類化合物，如番茄紅素[26]、諾卡酮[27]和達(dá)瑪烯二醇[28]等。然而遺憾的是，以甲醇酵母作為底盤生產(chǎn)這類天然產(chǎn)物的產(chǎn)量幾乎都遠(yuǎn)低于釀酒酵母以及解酯耶氏酵母中的產(chǎn)量。盡管甲醇代謝能夠提供充足的還原力，但是對(duì)于這類長(zhǎng)代謝途徑的天然產(chǎn)物的生產(chǎn)，僅僅考慮輔因子的供給是不夠的，系統(tǒng)地對(duì)代謝通路進(jìn)行調(diào)節(jié)和平衡往往需要對(duì)多基因多途徑進(jìn)行編輯，這就對(duì)開(kāi)發(fā)更高效、精準(zhǔn)、可控的基因編輯技術(shù)提出了要求?？上驳氖?，近年來(lái)基于CRISPR?Cas9系統(tǒng)，已經(jīng)在畢赤酵母[29]與多形漢遜酵母[30]中建立了相對(duì)精準(zhǔn)高效的遺傳操作平臺(tái)，并鑒定識(shí)別了許多中性位點(diǎn)，代謝工程改造工具已不再是改造甲醇酵母改造的主要障礙，目前的難點(diǎn)更在于改造策略與改造靶點(diǎn)的尋找上。此外，對(duì)于這類生物合成途徑復(fù)雜冗長(zhǎng)的化學(xué)品，通過(guò)將長(zhǎng)代謝途徑拆分到多個(gè)菌株中勞動(dòng)分工能夠有效地分擔(dān)代謝負(fù)擔(dān)。例如，Liu等[31]通過(guò)選擇恰當(dāng)?shù)拇x節(jié)點(diǎn)，將洛伐他汀的合成途徑拆分到兩株畢赤酵母中，混菌發(fā)酵使得洛伐他汀的產(chǎn)量相比于單菌培養(yǎng)提高了71%。事實(shí)上，借助混菌體系，或許可以選擇一個(gè)合適的中間代謝物對(duì)代謝路徑進(jìn)行拆分以實(shí)現(xiàn)甲醇到高附加值產(chǎn)品的高效轉(zhuǎn)化。譬如上游甲醇酵母利用甲醇生產(chǎn)中間代謝物，下游菌株則利用中間代謝物生產(chǎn)最終產(chǎn)物。在理想化的該體系中，甲醇酵母能夠充分發(fā)揮其甲醇利用能力，而其次級(jí)代謝物合成能力弱的特點(diǎn)則被下游菌株所彌補(bǔ)（表1）。

表1 改造甲醇酵母利用甲醇合成部分化學(xué)品

（2）除了底盤細(xì)胞本身的限制外，甲醇同化途徑效率低，碳通量難以被用于化學(xué)品的生產(chǎn)是另一大瓶頸。例如，Guo 等[10]在畢赤酵母中構(gòu)建了蘋果酸的合成途徑，能夠以葡萄糖作為碳源生產(chǎn)8.39g/L的蘋果酸。然而，該菌株直接利用甲醇進(jìn)行發(fā)酵則幾乎不能積累蘋果酸（0.02g/L）。研究發(fā)現(xiàn)，在甲醇利用過(guò)程中，絕大多數(shù)的碳原子通過(guò)甲醇異化最終被轉(zhuǎn)化為CO2，而難以用于產(chǎn)品的合成（圖2）。一個(gè)可能的策略是敲除甲醇的異化途徑從而迫使更多的甲醇進(jìn)入同化途徑，用于產(chǎn)品的合成。然而，對(duì)產(chǎn)蘋果酸的畢赤酵母中甲酸脫氫酶（Fdh）的敲除不僅導(dǎo)致甲酸的積累以及細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制，也幾乎沒(méi)有提高目標(biāo)產(chǎn)物蘋果酸的產(chǎn)量[10]。考慮到甲醇異化為細(xì)胞提供了生長(zhǎng)所需的能量和NADH，對(duì)異化途徑的敲除往往會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝。因此，一個(gè)替代方案是通過(guò)引入甲酸或二氧化碳同化途徑，將通過(guò)甲醇異化損失的碳原子重新固定。除此之外，對(duì)甲醇同化途徑的調(diào)節(jié)同樣被證明能夠促使甲醇同化的碳通量進(jìn)入下游產(chǎn)品合成路徑。通過(guò)對(duì)產(chǎn)蘋果酸的畢赤酵母6?磷酸葡萄糖異構(gòu)酶（Gpi）的敲除，重組菌株能夠以甲醇作為唯一碳源積累0.75g/L蘋果酸。作為對(duì)照，未敲除Gpi的菌株幾乎無(wú)法以甲醇作為碳源生產(chǎn)蘋果酸（0.02g/L）[10]。這表明，通過(guò)對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)的理性設(shè)計(jì)，能夠人為地調(diào)控甲醇的代謝流量用于代謝物的合成。隨著對(duì)甲醇代謝過(guò)程的進(jìn)一步解析，有理由期待更多的化學(xué)品能夠在甲醇酵母中以甲醇作為唯一碳源進(jìn)行生產(chǎn)。

圖2 在酵母中表達(dá)一碳資源利用途徑

1.2 轉(zhuǎn)化非甲基營(yíng)養(yǎng)酵母成為人工甲基營(yíng)養(yǎng)酵母

天然的甲醇酵母能夠利用甲醇作為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，并且已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了部分化學(xué)品的生產(chǎn)。然而通過(guò)上述方式獲得的化學(xué)品的產(chǎn)量、收率以及生產(chǎn)強(qiáng)度往往遠(yuǎn)不及模式菌株如釀酒酵母。此外，相比于釀酒酵母，甲醇酵母的基因編輯及操作手段相對(duì)落后，使得對(duì)于多途徑多基因的調(diào)節(jié)以及全局代謝優(yōu)化尚存在困難。因此，開(kāi)發(fā)以釀酒酵母為代表的非甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母作為人工甲醇酵母是甲醇生物轉(zhuǎn)化的另一個(gè)熱門方向。Dai 等[11]首次嘗試在釀酒酵母中分別引入來(lái)源于原核和真核甲基營(yíng)養(yǎng)菌的甲醇同化途徑。通過(guò)表達(dá)來(lái)源于畢赤酵母中的甲醇同化模塊，重組釀酒酵母能夠消耗甲醇用于細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)生產(chǎn)0.26g/L 丙酮酸（表2）。最近的研究表明，盡管缺少甲醇同化途徑，釀酒酵母也存在天然的吸收利用甲醇的機(jī)制。對(duì)甲醇培養(yǎng)下釀酒酵母的轉(zhuǎn)錄水平分析表明，部分基因包括乙醇脫氫酶（Adh）、甲酸脫氫酶（Fdh）和全局碳源特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Mig3 的表達(dá)水平明顯上調(diào)。盡管具體的機(jī)制尚不明確，上述結(jié)果證明釀酒酵母或許能夠通過(guò)Adh將甲醇氧化為甲醛并進(jìn)一步將甲醛轉(zhuǎn)化為丙酮酸等中心代謝物[12,34]。

表2 改造非甲基酵母為人工甲基酵母利用一碳原料

相較于釀酒酵母，解脂耶氏酵母具有更好的溶劑耐受性，這有助于抵抗甲醇對(duì)細(xì)胞的毒害。同時(shí)，作為產(chǎn)油酵母，解脂耶氏酵母能夠形成更大的過(guò)氧化物酶體用于甲醇的同化。因此，解脂耶氏酵母也被認(rèn)為是構(gòu)建人工甲基營(yíng)養(yǎng)菌的良好底盤。Wang 等[13]通過(guò)一系列理性設(shè)計(jì)的手段包括表達(dá)雜合的核酮糖?5 磷酸（Ru5P）和木酮糖?5 磷酸（Xu5P）循環(huán)基因，敲除內(nèi)源甲醛脫氫酶，強(qiáng)化Ru5P 前體再生，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)室馴化策略，使解脂耶氏酵母能夠同化1.1g/L的甲醇，并且能夠利用甲醇為唯一碳源維持細(xì)胞活動(dòng)。作為對(duì)照，未經(jīng)馴化的代謝工程改造菌株無(wú)法在甲醇最小培養(yǎng)基上維持細(xì)胞活動(dòng)。通過(guò)對(duì)甲醇酵母的甲醇利用途徑的分析以及多年來(lái)構(gòu)建人工甲基營(yíng)養(yǎng)菌的研究，已經(jīng)提出并證明了許多甲醇同化的關(guān)鍵瓶頸，例如：①甲醇氧化酶的活性；②關(guān)鍵前體Ru5P 和Xu5P 的供給；③甲醛積累導(dǎo)致的細(xì)胞毒性；④以甲醇為碳源時(shí)氨基酸合成不足等[16]。事實(shí)上，由于甲醇代謝的復(fù)雜性以及其對(duì)細(xì)胞的毒性，其對(duì)細(xì)胞的影響是全局的，要使細(xì)胞獲得利用甲醇維持生長(zhǎng)能力僅靠理性設(shè)計(jì)并引入若干甲醇代謝直接相關(guān)的途徑與元件是不夠的。因此，實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性馴化這一手段是必要且有效的。對(duì)于馴化菌株的基因表型能夠幫助人們進(jìn)一步分析甲醇代謝中存在的問(wèn)題以及挖掘甲醇代謝元件，這其中很大一部分往往并非是甲醇同化直接相關(guān)的基因，而是全局調(diào)控因子，細(xì)胞膜組分相關(guān)蛋白，乃至一些尚未鑒定功能的蛋白[12,23,34]。

2 酵母細(xì)胞利用甲酸進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化

甲酸是一種高度可溶且不易燃的化學(xué)物質(zhì)，可以作為微生物細(xì)胞中CO2固定的潛在電子供體[39]。此外，與甲醇相比，甲酸對(duì)細(xì)胞的毒性作用更低，且更易通過(guò)電催化還原CO2所制備。目前通過(guò)電化學(xué)技術(shù)將CO2還原為甲酸的法拉第效率在實(shí)驗(yàn)室水平已接近100%，未來(lái)隨著成本的降低，有望實(shí)現(xiàn)CO2到甲酸的工業(yè)化生產(chǎn)[40]。這些因素使得甲酸逐漸成為生物技術(shù)行業(yè)最有吸引力的一碳化合物之一。然而，甲酸的生物轉(zhuǎn)化還處于起步階段。因此，本節(jié)主要介紹了目前天然微生物中已發(fā)現(xiàn)的甲酸代謝途徑及其瓶頸問(wèn)題，以及最具前景的人工設(shè)計(jì)甲酸代謝途徑（還原性甘氨酸途徑）及其在酵母中的開(kāi)發(fā)應(yīng)用。

2.1 天然甲酸代謝途徑

在自然界中，微生物主要通過(guò)兩種方式代謝甲酸。①甲酸異化：甲酸通過(guò)甲酸脫氫酶氧化為CO2，這一反應(yīng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生1 分子的NADH 為細(xì)胞生長(zhǎng)提供還原力，但該途徑會(huì)造成碳原子損失[41]；②甲酸同化：甲酸首先與四氫葉酸（THF）縮合生成10?甲酰基THF，隨后進(jìn)一步被還原為5,10?亞甲基?THF 進(jìn)入下游代謝途徑[42]。目前已知天然甲酸代謝路徑主要包括還原性戊糖磷酸循環(huán)途徑（即 Calvin?Benson?Bassham，CBB 循環(huán)途徑）、絲氨酸循環(huán)與還原性乙酰輔酶A途徑[39]。然而，這些天然途徑都包含復(fù)雜的代謝機(jī)制且涉及酶的催化活性較低，導(dǎo)致了甲酸的天然同化效率較差。

CBB循環(huán)最初在Cupriavidus necator中發(fā)現(xiàn)，也是目前唯一已知能夠用于甲酸自養(yǎng)生長(zhǎng)的天然同化途徑[43]。如圖3(a)所示，在CBB 循環(huán)中，甲酸首先被氧化為CO2，隨后通過(guò)還原性戊糖磷酸循環(huán)提供還原力來(lái)進(jìn)行碳固定。然而，這種通過(guò)氧化反應(yīng)來(lái)提供還原力的方式效率低下，因?yàn)樵陔娮訌募姿徂D(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)氧化還原載體的過(guò)程中會(huì)造成能量的浪費(fèi)。因此，依賴這種甲酸利用途徑的微生物生長(zhǎng)速率、生物量積累和產(chǎn)品效價(jià)都相對(duì)較低。在CBB循環(huán)中，1mol乙酰輔酶A 的合成需要大約11mol甲酸分子，其中4mol 用于NAD(P)H 的再生，7mol 用于ATP的生產(chǎn)[41]。

圖3 天然與人工甲酸代謝途徑

許多甲基營(yíng)養(yǎng)菌能夠通過(guò)絲氨酸循環(huán)來(lái)同化還原性一碳化合物，如甲醇、甲酸等[圖3(b)]。在絲氨酸循環(huán)中，亞甲基?THF的C1部分被轉(zhuǎn)移給甘氨酸，然后甘氨酸被轉(zhuǎn)化為絲氨酸，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為甘油酸、磷酸烯醇丙酮酸（PEP）、草酰乙酸、蘋果酸和蘋果酰輔酶A。最終，蘋果酰輔酶A被分解為乙醛酸和乙酰輔酶A并進(jìn)入細(xì)胞中心碳代謝。通過(guò)絲氨酸循環(huán)合成1mol乙酰輔酶A需要7mol甲酸，其中1mol甲酸與CO2縮合形成乙酰輔酶A，3mol用于提供NAD(P)H，約3mol是用于ATP合成[44]。絲氨酸循環(huán)雖然能夠直接同化甲酸，但其利用效率仍然很低，難以支持高水平的菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成。

甲酸還可以通過(guò)還原性乙酰輔酶A途徑進(jìn)行同化，該途徑主要存在于產(chǎn)乙酸和產(chǎn)甲烷微生物中[圖3(c)]。在還原性乙酰輔酶A 途徑中，亞甲基?THF 首先被還原為甲基?THF，而甲基?THF 又將其C1部分提供給CO，然后將其連接到輔酶A上生成乙酰輔酶A，隨后進(jìn)入中心碳代謝途徑中。相較于CBB循環(huán)與絲氨酸循環(huán)，還原性乙酰輔酶A途徑不僅可以避免ATP 的浪費(fèi)，還可以通過(guò)多電子分支機(jī)制和質(zhì)子/鈉泵輸送復(fù)合物來(lái)維持能量守恒[44]。在還原性乙酰輔酶A途徑中，1mol乙酰輔酶A的合成只需要4mol 甲酸，其中1mol 被同化，3mol 用于合成NAD(P)H 和ATP[7]。事實(shí)上，許多產(chǎn)乙酸菌和產(chǎn)甲烷菌可以通過(guò)還原性乙酰輔酶A途徑利用甲酸作為唯一的碳源。然而，與模式工業(yè)微生物相比，這些菌株的培養(yǎng)與基因工程改造難度要大得多，而且它們的產(chǎn)品范圍仍然有限。令人遺憾的是，由于還原性乙酰輔酶A途徑高度復(fù)雜，且需要多種輔助酶，其中部分酶甚至對(duì)氧敏感。因此該途徑并不適合在模式菌株中進(jìn)行外源表達(dá)。

2.2 人工設(shè)計(jì)甲酸代謝途徑及其在酵母中的應(yīng)用

針對(duì)天然甲酸同化途徑存在效率低、碳浪費(fèi)嚴(yán)重等問(wèn)題，研究人員開(kāi)發(fā)了一系列更加高效的人工甲酸代謝途徑。這不僅能夠提高甲酸同化效率，還能增加底物或目標(biāo)產(chǎn)物的濃度。目前為止，雖然有多種人工甲酸途徑被成功開(kāi)發(fā)，且在甲酸利用效率與ATP 消耗上要優(yōu)于天然甲酸代謝途徑，但僅有還原性甘氨酸途徑被證實(shí)能夠支持模式菌株利用甲酸作為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)（最近已被證明天然存在于硫酸鹽還原菌Desulfovibrio desulfuricans中[45]）。

還原性甘氨酸途徑主要由三個(gè)模塊組成[圖3(d)]。第一模塊是來(lái)源于還原性乙酰輔酶A途徑中甲酸到5,10?亞甲基?THF的合成模塊。首先，甲酸與四氫葉酸通過(guò)甲基四氫葉酸連接酶縮合生成10?甲?；臍淙~酸，隨后經(jīng)過(guò)5,10?亞甲基?四氫葉酸?環(huán)化水解酶與5,10?亞甲基?THF 脫氫酶的催化形成5,10?亞甲基?四氫葉酸。在第二模塊中，5,10?亞甲基?四氫葉酸、CO2與NH3通過(guò)反向甘氨酸裂解系統(tǒng)生成甘氨酸。隨后，第三模塊將甘氨酸首先轉(zhuǎn)化為絲氨酸，該步驟由絲氨酸?甘氨酸循環(huán)中的羥甲基轉(zhuǎn)移酶催化，絲氨酸進(jìn)一步通過(guò)絲氨酸脫氨酶催化生成丙酮酸進(jìn)入中心碳代謝[46]。由于還原性甘氨酸途徑涉及的酶對(duì)氧不敏感且在微生物體內(nèi)廣泛存在，因此，其更適合在模式菌株中進(jìn)行強(qiáng)化表達(dá)。Kim 等[7]通過(guò)在大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)來(lái)自扭脫甲基桿菌的甲基四氫葉酸連接酶、5,10?亞甲基?四氫葉酸?環(huán)化水解酶、5,10?亞甲基?THF 脫氫酶和絲氨酸脫氨酶以及內(nèi)源性甘氨酸裂解系統(tǒng)的3種蛋白質(zhì)（H蛋白、T蛋白與P蛋白)，首次實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌這一模式菌株中利用甲酸作為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)。

然而，甲酸也具有一定的細(xì)胞毒性。微生物對(duì)甲酸的耐受性主要取決于胞內(nèi)甲酸脫氫酶的活性。例如，大腸桿菌由于胞內(nèi)甲酸脫氫酶活性較低，在甲酸濃度高于100mmol/L時(shí)細(xì)胞活性會(huì)受到嚴(yán)重抑制[7]。而真核生物釀酒酵母由于具有高活性的甲酸脫氫酶，在500mmol/L甲酸環(huán)境下依然具有較高的生物活性[35]。因此從底物耐受性角度出發(fā)，酵母相比于細(xì)菌更適合作為底盤細(xì)胞進(jìn)行甲酸利用。有趣的是，釀酒酵母本身就具有還原性甘氨酸途徑所需的酶，但其甲酸同化能力卻相當(dāng)?shù)托?，這可能是胞內(nèi)編碼相關(guān)酶的基因表達(dá)水平較低所導(dǎo)致。為了探究釀酒酵母對(duì)于甲酸的同化能力，González 等[35]在甘氨酸缺陷型釀酒酵母中利用強(qiáng)啟動(dòng)子來(lái)強(qiáng)化表達(dá)了內(nèi)源性還原性甘氨酸途徑中甲酸到甘氨酸的合成模塊。由于甘氨酸缺陷型釀酒酵母無(wú)法利用葡萄糖合成生長(zhǎng)所必需的甘氨酸，因此只有當(dāng)培養(yǎng)基中添加甲酸時(shí)，細(xì)胞才能利用甲酸通過(guò)還原性甘氨酸途徑合成甘氨酸來(lái)維持生長(zhǎng)。值得注意的是，還原性甘氨酸途徑只有在較高的CO2濃度下（約10%）才會(huì)驅(qū)動(dòng)甲酸到甘氨酸的合成。雖然目前尚未在酵母中實(shí)現(xiàn)以甲酸作為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，但是這一工作也為后續(xù)更多的甲酸利用型酵母的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

3 酵母細(xì)胞利用二氧化碳進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化

近年來(lái)，隨著雙碳戰(zhàn)略的提出，以CO2為底物的生物轉(zhuǎn)化成為綠色生物制造的研究熱點(diǎn)。尤其是近年來(lái)在CO2捕獲、利用和儲(chǔ)存方面取得的技術(shù)進(jìn)步，都有望極大地促進(jìn)碳中和以及碳清除[47?48]。天然自養(yǎng)微生物能夠固定大氣中的CO2，這其中一部分，例如藍(lán)藻已被開(kāi)發(fā)用于燃料化學(xué)品的生產(chǎn)包括乙醇、2, 3?丁二醇等。然而，這些天然的CO2固定微生物往往固碳效率低下、生長(zhǎng)速率較慢，且缺乏成熟高效的遺傳改造工具。近年來(lái)，通過(guò)外源引入CBB 循環(huán)的關(guān)鍵酶Rubisco，已經(jīng)在諸多酵母如釀酒酵母[36?37]、畢赤酵母[38]、馬克斯克魯維酵母[49]實(shí)現(xiàn)了功能表達(dá)。

CBB 循環(huán)是自然界七種CO2天然固定途徑之一。在該循環(huán)中，Prk和RuBisCO是兩個(gè)關(guān)鍵的酶，前者催化5?磷酸核糖（R5P）轉(zhuǎn)化為1,5?核酮糖二磷酸（RuBP），后者則將RuBP 進(jìn)一步羧化成3?磷酸甘油酸（3?PGA）從而進(jìn)入中心代謝（圖2）。Guadalupe?Medina 等[36]通過(guò)在釀酒酵母中引入CBB循環(huán)的一部分基因提高了乙醇的產(chǎn)量，同時(shí)顯著降低副產(chǎn)物甘油的積累。由于在厭氧發(fā)酵過(guò)程中，呼吸鏈無(wú)法重新氧化NADH，因此通過(guò)糖酵解產(chǎn)生的NADH僅能通過(guò)甘油的生成實(shí)現(xiàn)再氧化。而通過(guò)引入CBB 循環(huán)，可以將1mol 的R5P 和CO2轉(zhuǎn)化為2mol 的3?PGA，并且繞過(guò)NADH 的生成，使甘油的積累下降了90%，乙醇的產(chǎn)量提高了10%。類似地，通過(guò)在一株木糖利用釀酒酵母中引入部分CBB循環(huán)，副產(chǎn)物木糖醇的產(chǎn)量減少了23%。而乙醇的產(chǎn)量增加了4%[37]。這些研究表明了CBB 循環(huán)不僅能夠通過(guò)固定CO2提高產(chǎn)物的碳收率，更能夠明顯降低還原性副產(chǎn)物的積累。然而，這些工程釀酒酵母均無(wú)法利用CO2作為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)。

最近，以畢赤酵母作為底盤細(xì)胞，通過(guò)引入完整的CBB循環(huán)，實(shí)現(xiàn)了以CO2作為唯一碳源的人工自養(yǎng)微生物的構(gòu)建。由于畢赤酵母的甲醇利用途徑XuMP 循環(huán)具有與天然CBB 循環(huán)類似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，因此僅需在畢赤酵母中引入6個(gè)酶即可實(shí)現(xiàn)完整的CBB 循環(huán)。在該構(gòu)建菌株中，甲醇同化的關(guān)鍵酶Das1 與Das2 被敲除使細(xì)胞失去利用甲醇進(jìn)行生長(zhǎng)的能力。因此，添加的甲醇僅通過(guò)異化途徑用于為細(xì)胞生長(zhǎng)提供還原力和能量，而CO2則用于生物質(zhì)的合成。最后，在使用CO2作為唯一碳源的216h分批培養(yǎng)中，重組畢赤酵母菌株的細(xì)胞干重（DCW）增長(zhǎng)到 0.89g/L。通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性進(jìn)化，工程菌株的比生長(zhǎng)速率從0.008h?1提高至0.018h?1[38]。

除了CBB 循環(huán)外，酵母可以通過(guò)磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（Pepc）和丙酮酸羧化酶（Pc）等羧化酶固定CO2，并直接用于下游產(chǎn)物的合成。最近的研究表明，在酵母中表達(dá)各種羧化酶能夠有效提高化學(xué)品的產(chǎn)量與收率。然而，由于CO2是碳的最高氧化態(tài)，對(duì)于CO2的固定均需額外的能量供給。如上所述，作為能量利用效率最低的固碳途徑，CBB循環(huán)每固定3 分子的CO2生成1 分子的丙酮酸需要消耗7 個(gè)ATP[50]。天然的自養(yǎng)微生物能夠通過(guò)光能或者氧化還原態(tài)的化合物為CO2固定提供能量。鑒于此，可以設(shè)計(jì)光合生物雜交系統(tǒng)將生物合成途徑與無(wú)機(jī)光吸收材料相結(jié)合，通過(guò)光吸收材料捕獲光生成電子并將其轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中為CO2固定提供能量[51?52]。類似地，添加還原性的底物如甲醇[38]、甲酸[9]和甘油[53]，借助其異化途徑產(chǎn)生的能量與還原力也能夠彌補(bǔ)CO2固定過(guò)程所需的能量缺口，實(shí)現(xiàn)人工半自養(yǎng)微生物的構(gòu)建。另一方面，由于天然的固定途徑往往羧化效率低下，人工設(shè)計(jì)并合成固定途徑有望顯著提高羧化酶的催化效率。Schwander等[54]設(shè)計(jì)了一條合成CO2的固定途徑，命名為CETCH循環(huán)。該循環(huán)由來(lái)自九種不同生物的17種酶組成，并在體外進(jìn)行了功能評(píng)估。對(duì)CETCH 循環(huán)性能的計(jì)算分析表明其在釀酒酵母中引入該循環(huán)可以更經(jīng)濟(jì)高效地生產(chǎn)CO2驅(qū)動(dòng)的化學(xué)品[55]。然而，復(fù)雜代謝途徑的引入難以避免地會(huì)對(duì)細(xì)胞天然代謝途徑造成影響。因此，自養(yǎng)釀酒酵母菌株的開(kāi)發(fā)需要更廣泛的工程策略來(lái)微調(diào)超過(guò)17 種異源基因的表達(dá)及其與天然代謝途徑的協(xié)調(diào)。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

隨著我國(guó)雙碳戰(zhàn)略的提出，化工行業(yè)對(duì)于傳統(tǒng)化石燃料的依賴性必將持續(xù)地降低。一碳原料的生物轉(zhuǎn)化既是國(guó)家戰(zhàn)略需求，也是大勢(shì)所趨。作為一碳原料生物轉(zhuǎn)化的底盤，酵母具有相比細(xì)菌獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，細(xì)胞器的存在能夠隔絕一碳化合物代謝過(guò)程中產(chǎn)生的有毒物質(zhì)滲入細(xì)胞質(zhì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害。因此，利用酵母實(shí)現(xiàn)一碳資源的高值化轉(zhuǎn)化成為了近年來(lái)的一大研究熱點(diǎn)。

由于天然甲醇酵母的存在，甲醇的生物轉(zhuǎn)化更為容易。已有許多報(bào)道實(shí)現(xiàn)了利用天然甲醇酵母生產(chǎn)一些化學(xué)品包括脂肪酸、有機(jī)酸以及萜類化合物等。盡管目前以甲醇作為底物合成化學(xué)品的產(chǎn)量與以葡萄糖相比還有較大差距，隨著對(duì)甲醇代謝了解的逐漸深入以及更多更便捷的遺傳操作工具的開(kāi)發(fā)，它們的產(chǎn)量還有極大的提高空間。另一方面，對(duì)于人工甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母的開(kāi)發(fā)在近年來(lái)也取得了突破性的進(jìn)展。通過(guò)在酵母中引入還原性甘氨酸途徑以及CBB 循環(huán)并結(jié)合適應(yīng)性進(jìn)化，已經(jīng)陸續(xù)構(gòu)建了能夠以甲酸和CO2為唯一碳源的半自養(yǎng)型酵母。然而，即使能夠?qū)崿F(xiàn)一碳資源的吸收與利用，極低的底物利用速率以及細(xì)胞生長(zhǎng)速率都表明這些人工甲基酵母距離工業(yè)應(yīng)用還有極大的差距。過(guò)去的研究證明，僅僅通過(guò)代謝途徑的理性設(shè)計(jì)難以獲得以一碳原料為唯一碳源的人工甲基營(yíng)養(yǎng)菌。迄今為止獲得的能夠以一碳原料為唯一碳源的人工甲基營(yíng)養(yǎng)菌中，適應(yīng)性進(jìn)化均發(fā)揮了極為關(guān)鍵的作用[6?8]。在這一點(diǎn)上，酵母細(xì)胞較慢的生長(zhǎng)速率顯得尤為不利，這使馴化過(guò)程成倍延長(zhǎng)。對(duì)此，高效、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的菌株突變和篩選方式或許能夠顯著減少馴化的周期。鑒于酵母的自然選擇與進(jìn)化較慢，通過(guò)建立基因突變文庫(kù)，對(duì)潛在的關(guān)鍵基因進(jìn)行定向進(jìn)化或許能夠大大縮短自然馴化的過(guò)程。此外，近年來(lái)，利用自動(dòng)化的儀器分析技術(shù)開(kāi)發(fā)的高通量篩選平臺(tái)突破了人工篩選在速度、效率和標(biāo)準(zhǔn)化方面的限制，尤其是基于微流控芯片的檢測(cè)和篩選技術(shù)使對(duì)單個(gè)細(xì)胞的分析和篩選成為了可能，這也將極大地助力人工甲基酵母的構(gòu)建與篩選。

相較于甲醇，甲酸與二氧化碳并不能天然地被酵母底盤利用。目前，構(gòu)建以甲酸和二氧化碳為唯一碳源的大腸桿菌工程菌株的目標(biāo)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)。而對(duì)于酵母，目前僅可實(shí)現(xiàn)以二氧化碳提供生物質(zhì)實(shí)現(xiàn)半自養(yǎng)，尚無(wú)法完全脫離輔助碳源實(shí)現(xiàn)完全的自養(yǎng)。因此，仍需要通過(guò)合理設(shè)計(jì)代謝途徑以適配底盤細(xì)胞。隨著高通量測(cè)序和生物信息學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多物種的基因組和酶促反應(yīng)信息正被快速挖掘，使用基因組規(guī)模的代謝網(wǎng)絡(luò)模型數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)新途徑進(jìn)行建模和設(shè)計(jì)有望獲得更為高效的一碳資源利用途徑。

綜上所述，近年來(lái)針對(duì)一碳資源的生物轉(zhuǎn)化，無(wú)論是對(duì)于天然甲基營(yíng)養(yǎng)菌的下游產(chǎn)品合成途徑，或是非甲基營(yíng)養(yǎng)菌的上游一碳資源利用模塊的設(shè)計(jì)與構(gòu)建，均取得了出色的成果。盡管目前仍存在一碳資源利用速率低、產(chǎn)品收率低等瓶頸，隨著一碳原料市場(chǎng)的不斷擴(kuò)大，下游合成和轉(zhuǎn)化行業(yè)的不斷發(fā)展以及生物技術(shù)的不斷提高，以天然和人工甲基營(yíng)養(yǎng)酵母為基礎(chǔ)的一碳資源生物煉制必將具有愈發(fā)廣闊的前景，為我國(guó)的環(huán)保和能源事業(yè)做出巨大的貢獻(xiàn)。