基于形變距離和受壓質(zhì)量混合模式測定藍莓果實硬度的方法建立和優(yōu)化

沈朱俐　顧莉莉　李曉誼　李永強　宗宇　徐麗珊　郭衛(wèi)東

關鍵詞：藍莓；果實硬度；形變；受力

中圖分類號：S663.2 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）01-0169-11

果實硬度是果樹非常重要的育種性狀，它對果實的機械采收、內(nèi)在品質(zhì)、可運輸性和貨架期都有直接影響。果實硬度與細胞壁結(jié)構(gòu)、細胞膨壓和角質(zhì)層等的生理生化變化密切相關，一般會隨著果實的發(fā)育、成熟或貯藏時間延長而逐漸下降。軟化是肉質(zhì)果實最典型的成熟特征之一，合適的成熟硬度可以提升果實的消費口感，而過度軟化不僅會降低果實內(nèi)在品質(zhì)，還會增加采收、運輸和貯藏過程中的果實損耗。雖然在自然情況下伴隨果實成熟的硬度下降不可避免，但發(fā)育期擁有更高硬度的果實在成熟時傾向于保持其硬度特征。

果實硬度的測定在番茄屬、蘋果屬、草莓屬、獼猴桃屬等植物的大果型果實方面已有較多報道。量化測定包括質(zhì)構(gòu)分析法、近紅外光譜技術、高光譜成像技術、聲特征檢測法等方法。質(zhì)構(gòu)分析法是將果實去皮后使用硬度計或質(zhì)構(gòu)儀對果實進行穿刺或擠壓測定其硬度，是實驗室常用的果實硬度量化方法；穿刺式硬度測定使用的探針存在直徑和長度的差異，測定結(jié)果通常受果實類型、測定模式和參數(shù)條件等因素的影響較大，在葡萄、櫻桃和藍莓等小果型硬度測定中表現(xiàn)尤為明顯。若照搬穿刺式方法測定小果型果實的硬度，不僅會造成測定結(jié)果不準確，也會影響同一類果實硬度測定標準的制定。

藍莓是杜鵑花科越橘屬植物，因其果實中富含花青苷且具有很高的保健價值而被廣泛栽培，目前已成為全球發(fā)展最快的果樹之一。全世界藍莓總產(chǎn)量的70%為鮮食果，果實硬度對鮮食藍莓的消費起關鍵作用，它直接反映了果實的新鮮程度。高硬度的藍莓果實在咀嚼時有更大的回彈力，給消費者帶來更好的脆度口感。雖然已有基于質(zhì)構(gòu)儀、硬度檢測儀、無損傷預測模型等方式測定藍莓果實硬度的報道，但前人的研究主要關注藍莓的成熟時期和采后貯藏階段，果實發(fā)育期硬度的報道較少；而近期的研究結(jié)果表明果實的早期發(fā)育階段對硬度有非常重要的影響。此外，無論采用哪種測量方式，取樣數(shù)量和測定模式仍然是藍莓果實硬度測定中尚未明確的問題。

筆者分析了不同取樣量對藍莓果實硬度測定的影響，基于不同形變距離和受壓質(zhì)量兩種模式測定了藍莓發(fā)育時期的果實硬度，建立了準確度高和重復性好的藍莓果實硬度測定方法；在此基礎上對我國主栽藍莓品種的果實硬度進行了測定。筆者在本研究中建立和優(yōu)化的方法可以為藍莓及其他小果型果實硬度標準化測定提供參考，為硬肉型藍莓新品種的選育打下基礎。

1材料和方法

1.1材料

藍莓果實采自浙江師范大學藍莓種質(zhì)資源圃。選擇長江中下游地區(qū)主栽的艾美瑞（Emerald）、巨優(yōu)（Jewel）、奧尼爾（ONeal）和夏普藍（Sharpblue）4個藍莓品種，每個品種選擇10株長勢相近的6年生藍莓樹，于5月中旬采集健康的成熟果實各600個。在室溫條件下放置th去除田間熱，挑選大小和成熟狀態(tài)相似的400個果實用于硬度測定。參考Zifkin等對藍莓果實發(fā)育時期的劃分方式，依據(jù)果實大小和果面顏色采集奧尼爾6個發(fā)育時期（圖1）的足量（≥150個）果實，室溫條件下放置1h去除田間熱，各時期挑選出大小和發(fā)育狀態(tài)相似的100個果實用于硬度測定。

1.2藍莓果實硬度測定采樣量的確定

使用Firmtech FT7果實硬度檢測儀（UP GmbH Firmensitz，德國）測定艾美瑞、巨優(yōu)、奧尼爾和夏普藍4個藍莓品種成熟果實的硬度。選擇形變閾值（deflection threshold）模式，設置2 mm為硬度檢測儀擠壓果實產(chǎn)生形變的閾值，其他參數(shù)保持默認。將測定的400個成熟果實的硬度平均值作為“真值”，對400個測量值進行隨機再抽樣，設置抽樣量分別為5、10、15、25、35、45、60、75、90和200個果實的分組。每個抽樣量隨機重復抽樣1000次，每次再抽樣的平均值作為該樣本量情況下的一個虛擬測定值，以“真值”的±5%誤差作為置信區(qū)間，記錄每組抽樣量虛擬測定值落入置信區(qū)間的比例，統(tǒng)計分析后確定滿足可重復性和準確度的最優(yōu)采樣量。

1.3藍莓不同發(fā)育時期果實硬度測定條件的優(yōu)化

取奧尼爾藍莓S3到S8共6個發(fā)育時期的足量果實，使用Firmtech FT7果實硬度檢測儀測定不同發(fā)育時期果實的硬度，采用形變閾值和壓力閾值（force threshold）兩種測定模式。形變閾值模式是指預設果實受壓后赤道面產(chǎn)生垂直形變的距離最大值，分別設置為0.5、1.0、1.5和2.0 mm。壓力閾值模式是指預設果實受壓質(zhì)量的最大值，分別設置為200、300和400 g。硬度檢測儀探頭垂直于果實的赤道面進行測量，利用FT7 Control軟件（UP GmbH Firmensitz，德國）記錄果實形變距離和受壓質(zhì)量并繪制回歸曲線，分別分析果實硬度與形變距離（形變閾值模式）和受壓質(zhì)量（壓力閾值模式）的相關性。

1.4藍莓不同品種成熟果實的硬度測定

采集36個藍莓品種（表1）的足量果實，利用方法1.2和1.3中確定的采樣量和測定模式進行果實硬度測量。

1.5數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2013軟件（Microsoft，美國）對數(shù)據(jù)進行初步處理并作圖，利用SPSS 23.0軟件（IBM，美國）進行方差和相關性分析。

2結(jié)果與分析

2.1果實不同采樣量對果實硬度測定的影響

測定了篩選后的艾美瑞、巨優(yōu)、奧尼爾和夏普藍各400個果實的硬度，平均值分別為239.9、210.9、168.9和262.0 g.mm^-1，將該平均值作為每個品種果實硬度的“真值”。對每個品種400個硬度測定值隨機再抽樣，當抽樣量為5時，果實硬度測定值上下四分位數(shù)相差最大，數(shù)據(jù)離散值多（圖2）；巨優(yōu)、奧尼爾和夏普藍約50%的果實硬度數(shù)據(jù)不屬于“真值”95%的置信區(qū)間，艾美瑞有超過25%的數(shù)據(jù)不滿足準確度要求（圖3）。隨著抽樣量增加，測定值的離散值逐漸減小，精確度提高（圖2）。當抽樣量超過60時，離散值和異常值的數(shù)量趨于飽和。在抽樣量為75時，4個藍莓品種果實硬度測定值在“真值”95%的置信區(qū)間的比例超過99%。雖然抽樣量為90和200時的測定值精確度和準確度更高，但在實際測定過程中會顯著增加測定的時間和成本。

對不同抽樣量的測定值進行了變異系數(shù)分析（圖4），結(jié)果表明隨著抽樣量的增加，果實硬度測量值的變異系數(shù)快速降低。果實抽樣量為5個時，硬度測量值的變異系數(shù)最大，4個品種均超過了0.050。當抽樣量為10到25個時，變異系數(shù)迅速下降，當抽樣量為25個時，巨優(yōu)、奧尼爾和夏普藍測量值的變異系數(shù)約為0.030，艾美瑞變異系數(shù)最低，為0.023。當抽樣量是35到60時，變異系數(shù)下降趨勢變緩，除艾美瑞為0.020外，其他3個品種均接近0.025。當抽樣量≥60個時，4個品種的變異系數(shù)均小于0.020，并且抽樣量增加至90個（含）之前，變異系數(shù)沒有顯著性差異。當抽樣量為200個時，艾美瑞果實硬度測定值的變異系數(shù)最低，為0.0082，奧尼爾最高，為0.011，其他2個品種為0.010。綜合考慮品種多樣性、準確度、精確度和測量成本等因素，藍莓果實硬度測定的取樣量應設置為60～75個。

2.2形變距離與藍莓果實硬度的相關性

以不同形變閾值（0.5、1.0、1.5和2.0 mm）對奧尼爾不同發(fā)育時期果實（圖1）的硬度進行了測定，對形變距離和果實硬度進行相關性分析（圖5）。結(jié)果表明，當形變閾值為0.5、1.0和1.5 mm時，S3時期的果實硬度與形變距離的相關系數(shù)無顯著差異，形變閾值為2.0 mm時的相關系數(shù)顯著低于其他3種距離。但閾值為0.5和2.0 mm時，其硬度顯著低于形變閾值為1.0和1.5 mm模式下的硬度。S4時期果實硬度的測定值和相關系數(shù)都隨著形變閾值的增加呈現(xiàn)下降趨勢，硬度測定值在4種形變距離下存在顯著差異。隨著形變閾值的增加，S5到S8時期果實硬度測量值及其與形變距離之間的相關系數(shù)呈現(xiàn)上升趨勢，在形變閾值≥1.0 mm時趨于平緩。當形變閾值為0.5 mm時，S5到S8時期的硬度測量值與形變距離之間的相關系數(shù)顯著低于其他形變距離，當形變閾值≥1.0 mm時，S5、S7和S8時期果實硬度和形變距離之間的相關系數(shù)無顯著差異。果實硬度測量值變化較大，形變閾值為0.5和1.0 mm時的硬度測量值顯著低于1.5和2.0 mm時，在1.5和2.0 mm形變閾值時，S5到S8時期果實硬度測量值無顯著差異。綜上，形變閾值1.0 mm更適合用于測定硬度較高的S3和S4時期藍莓果實，1.5和2.0 mm更適宜測定硬度逐漸下降的S5到S8時期的藍莓果實。

2.3果實受壓質(zhì)量與藍莓果實硬度的相關性

以不同壓力閾值模式（200、300和400 g）對奧尼爾不同發(fā)育時期果實（圖1）的硬度進行了測定，對果實硬度和過程壓力值進行相關性分析（圖6）。隨著壓力閾值的增加，果實硬度測定值及其與壓力值的相關系數(shù)呈上升趨勢。壓力閾值為200 g時的果實硬度測定值與過程壓力值的相關系數(shù)均顯著低于300和400 g時的相關系數(shù)。但只有在S3、S4和S6時期，壓力閾值300 g和400 g模式下果實硬度測定值與過程壓力值之間的相關系數(shù)存在顯著性差異。3種壓力閾值模式下測定的S3和S5時期果實硬度均存在顯著性差異，400 g模式的測定值顯著大于200和300 g模式下的測定值。在S3到S5時期，隨著壓力閾值的增加，硬度測定值顯著提高，過程壓力值和果實硬度之間的相關系數(shù)增大。在S6到S8時期，壓力閾值越高，過程壓力值和果實硬度之間的相關系數(shù)越高，且閾值超過300 g后，硬度測定值在3個時期中沒有顯著性差異，硬度測定值及其與過程壓力值的相關系數(shù)趨于平緩。綜上，400g壓力閾值模式適于測定S3到S8時期的果實硬度。

2.4藍莓不同品種的果實硬度及硬度育種趨勢

形變閾值2.0 mm（209.5±2.0 g·mm^-1）和壓力閾值400 g（198.7±2.5 g·mm^-1）模式下的奧尼爾S8時期果實硬度相似，但形變閾值模式下的相關系數(shù)（0.9988）略高于壓力閾值模式（0.9984），綜合考慮硬度測定值及硬度與形變距離、壓力值之間的相關系數(shù)，使用形變閾值2.0 mm模式測定了17個南高叢藍莓品種、9個北高叢藍莓品種和10個兔眼藍莓品種的成熟果實硬度（表1），果實硬度變化范圍是161.7～263.1g.mm^-1。南高叢藍莓品種平均硬度為205.0 g·mm^-1，其中明星硬度最大，為263.1 g.mm^-1，奧尼爾果實硬度最小，為165.9 g·mm^-1。北高叢藍莓果實硬度為161.7～258.5 g·mm^-1，平均硬度為203.9 g·mm^-1，硬度最大和最小的藍莓品種分別是德雷伯和伊利沙白。兔眼藍莓品種平均硬度為202.6 g·mm^-1，其中梯芙藍硬度最大，為226.5g·mm^-1，紅珍珠品種果實硬度最小，為175.7 g·mm^-1（圖7）。綜合分析果實硬度與藍莓品種育成時間之間的趨勢特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)果實硬度隨品種選育時間呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢（圖7-A）。南高叢藍莓和北高叢藍莓近期育成品種的果實硬度一般大于年代久遠的品種，這種趨勢在南高叢藍莓品種群中表現(xiàn)得更為突出（圖7-B）。

3討論

藍莓已經(jīng)成為僅次于草莓的全球第二大漿果類型，近些年栽培面積和產(chǎn)量不斷增加，但鮮食果價格仍居高不下，主要原因在于人工采摘勞動成本高，鮮果生產(chǎn)過程損耗大，而機械化采收和果實硬度增大是有效的解決途徑。果實硬度對藍莓鮮食、儲運和貨架期都有重要影響，準確的果實硬度測定是果實品質(zhì)評價和市場質(zhì)量分級的前提。筆者利用Firmtech FT7果實硬度檢測儀探討了藍莓發(fā)育期果實硬度準確測定所需的樣本數(shù)量和檢測模式，發(fā)現(xiàn)果實取樣數(shù)量為60～75個時能獲得準確度高、可重復性好的果實硬度測量值。前人在藍莓硬度相關研究中采用的果實取樣范圍為5～100個，多數(shù)研究的取樣量為20～30個，也有一些研究沒有明確指出用于硬度測定的果實數(shù)量。盡管Cappai等指出用于硬度測量的藍莓果實數(shù)量為25個時，異常值可以降至10%，但為了獲得更加可靠的果實硬度數(shù)據(jù)，建議在條件允許的情況下測定≥60個果實作為品種的果實硬度特征值。

早期大多使用手持式硬度計、通用測試機（in-stron testing machine）測定蘋果、梨和桃等果實的硬度，但由于藍莓果實直徑遠小于上述果實，無法直接使用大果型果實的硬度測定方法。目前在藍莓果實硬度測定中最常用的儀器是Firmtech果實硬度檢測儀，雖然質(zhì)構(gòu)儀和無損檢測等儀器或方法也多有使用，但質(zhì)構(gòu)儀的探頭大小和形狀多種多樣，使得硬度的測定過程難以標準化，在大規(guī)模測定中費時費力。藍莓果實在生長發(fā)育直至成熟的過程中內(nèi)含物變化非常大，果實質(zhì)地處于動態(tài)變化的過程中，而果實硬度的測定一般是基于擠壓或穿刺等單一模式得到的反饋值，對發(fā)育期果實采用單一模式進行硬度測定會影響準確度。筆者對硬度測定的兩種常用模式進行了比較，發(fā)現(xiàn)400 g壓力閾值模式比形變閾值更適合測定坐果期（S3）和膨大期（S4）的藍莓果實。對于白綠期（S5）之后的藍莓果實硬度測定，2.0mm的形變閾值模式優(yōu)于壓力閾值模式。

藍莓的馴化栽培和品種選育開始于20世紀初的美國，近30年選育的藍莓品種比最初育成的藍莓品種有更高的果實硬度。藍莓品種的遺傳背景涉及常綠藍莓（V.darrowii）、高叢藍莓、矮叢藍莓和兔眼藍莓等多個種，前人整理分析了多個藍莓品種的果實硬度，發(fā)現(xiàn)遺傳背景中以常綠藍莓和兔眼藍莓為主的品種果實硬度更大，而以矮叢藍莓為親本種選育的品種果實更軟，這與筆者在本研究中得到的結(jié)果基本一致。果實硬度是藍莓育種長期備受關注的關鍵性狀之一，在栽培品種果實硬度改良過程中，充分利用硬度大的越橘屬近緣野生種，將其與栽培品種藍莓雜交，選育更適合機械采收和耐貯藏的新品種將是未來藍莓育種的主要趨勢。

4結(jié)論

果實硬度在藍莓果實不同發(fā)育時期變化較大。當使用Firmtech FT7果實硬度計測定藍莓果實硬度時，果實數(shù)量≥60個測定的硬度值可以作為品種的特征值，最優(yōu)測定模式為400 g壓力閾值與2.0 mm形變閾值混合模式，或1.0和2.0 mm結(jié)合的形變閾值模式。高硬度的藍莓品種如南高叢藍莓明星和密斯蒂、北高叢藍莓德雷伯、兔眼藍莓沃農(nóng)和梯芙藍可以作為硬肉型藍莓品種選育的備選親本。