山核桃油體蛋白o(hù)leosin基因家族鑒定和表達(dá)模式分析

董茗秀　易芳　胡帥　高燕麗

關(guān)鍵詞：山核桃；薄殼山核桃；Oleosin基因；生物信息學(xué)；亞細(xì)胞定位

中圖分類號(hào)：S664.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980（2023）01-0035-13

油脂是生物體能量代謝的主要來(lái)源，在生物膜合成、能量穩(wěn)定、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面發(fā)揮重要作用。植物細(xì)胞中油脂以三酰甘油（Triacylglycerol，TAG）的形式合成于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，通過(guò)出芽的形式存儲(chǔ)于特定細(xì)胞器油體（Lipid Droplet，LD）中。油體主要由三酰甘油（TAG）、磷脂（Phospholipid）和內(nèi)嵌蛋白（In-trinsic proteins）組成。TAG是植物種子中能量存儲(chǔ)的有效形式之一，可以為種子萌發(fā)和幼苗初期生長(zhǎng)提供必要的能量。由親水性的磷酸基團(tuán)和疏水性的?；鶊F(tuán)組成的磷脂是油體生物膜結(jié)構(gòu)的主要組分，內(nèi)嵌蛋白則主要負(fù)責(zé)維持油體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。油體表面的內(nèi)嵌蛋白包括油體蛋白（Oleosin，OLEO），油體鈣蛋白（Caleosin，CLO）、甾醇蛋白（Steroleosin，SLO）和油體相關(guān)蛋白（Lipid Droplet Associated Proteins，LDAP）等。油體蛋白最早在綠藻中被發(fā)現(xiàn)，是油體含量最豐富的膜蛋白，約占種子總蛋白的8%。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，目前擬南芥（Arabidopsis thaliana）、油菜（Bras-sica napus）、大豆（Glycine max）和芝麻（Sesa-mum indicum）等物種中的油體蛋白均被研究。不同物種中oleosin基因具有相似的理化性質(zhì)：蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為15～26 ku，蛋白結(jié)構(gòu)包含1個(gè)疏水環(huán)區(qū)，具體由3個(gè)脯氨酸殘基和1個(gè)絲氨酸殘基（-PXsub>5SPXsub>3P-）組成的“脯氨酸結(jié)”，該結(jié)構(gòu)域?qū)τ腕w蛋白靶向定位到油體至關(guān)重要。

Oleosin是種子油體表面表達(dá)豐度最高的蛋白，另外發(fā)現(xiàn)oleosin也定位于花粉的表面和茸毛層。目前在擬南芥中鑒定到16個(gè)oleosin蛋白，其中5個(gè)主要在種子中表達(dá)，8個(gè)在花藥中表達(dá)，以及3個(gè)同時(shí)在種子和花藥中表達(dá)，其中在種子中表達(dá)的oleo-sin蛋白主要功能是調(diào)節(jié)油體大小和影響種子萌發(fā)。研究發(fā)現(xiàn)，oleosin蛋白在種子干燥過(guò)程中對(duì)油體的穩(wěn)定性和融合有一定的影響；另外在種子過(guò)冬階段，oleosin蛋白調(diào)控油體大小和種子活力，在種子萌發(fā)過(guò)程中oleosin蛋白調(diào)控脂質(zhì)代謝。擬南芥AtOlel基因敲除后，突變體種子油體形態(tài)異常，油體異常積累，導(dǎo)致種子萌發(fā)延緩。水稻中過(guò)表達(dá)黃豆oleosin基因，轉(zhuǎn)基因水稻籽粒中油體蛋白數(shù)量增多、體積變小，種子含油量顯著增加，但三酰甘油的脂肪酸組成并未發(fā)生變化，表明油體大小與總含油量呈負(fù)相關(guān)。擬南芥olel ole2雙突變體中，發(fā)現(xiàn)種子細(xì)胞中具有不規(guī)則且增大的含油結(jié)構(gòu)，同時(shí)，油體蛋白可通過(guò)防止低溫自吸脹過(guò)程中油體的異常融合，提高種子細(xì)胞活力。oleosin基因可以維持油體的大小和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，影響脂類物質(zhì)的積累，從而調(diào)節(jié)植物種子的含油量，并且種子活力可能與含油量相關(guān)。由此可見，油體蛋白o(hù)leosin在種子生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要作用。

山核桃（Carya cathayensis），也稱中國(guó)山核桃，屬于胡桃科山核桃屬，主要分布于浙江和安徽一帶，已有500多年的種植歷史。薄殼山核桃（Carya illinoinensis），也屬于胡桃科山核桃屬，是世界著名的胡桃科堅(jiān)果樹種，原產(chǎn)于美國(guó)。山核桃與薄殼山核桃分別是東亞和北美洲東部的胡桃科山核桃屬代表，也是胡桃科山核桃屬中僅有的兩種商業(yè)栽培的樹種。山核桃的堅(jiān)果較小，外殼較硬，而且缺乏對(duì)非生物脅迫如高溫、洪水、干旱和鹽堿的耐受性，極大地限制了山核桃全世界范圍內(nèi)的商業(yè)化種植。山核桃與薄殼山核桃含油量都高達(dá)70%，其中不飽和脂肪酸占90%以上，且具有補(bǔ)腦、降低血脂、預(yù)防心腦血管疾病等功效。筆者以商業(yè)栽培山核桃屬堅(jiān)果樹種的2個(gè)代表（山核桃與美國(guó)山核桃）為研究對(duì)象，根據(jù)已公開發(fā)表的山核桃和薄殼山核桃基因組信息，通過(guò)生物信息學(xué)手段分析ole-osin基因家族，主要包括保守基序、系統(tǒng)進(jìn)化、啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件、表達(dá)模式及亞細(xì)胞定位研究等方面，為進(jìn)一步篩選山核桃oleosin候選基因并進(jìn)行功能分析提供一定的參考依據(jù)。

1材料和方法

1.1 0leosin基因鑒定

通過(guò)擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)TAIR（https：//www.arabidop-sis.org）獲取擬南芥oleosin基因家族蛋白序列，作為參照序列，通過(guò)BioEdit進(jìn)行本地BlastP從山核桃以及薄殼山核桃數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//ngdc.cncb.ac.cn/data-basecommons/database/id/4151）中獲取oleosin蛋白序列，利用Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pfam.xfam.org）篩選包含oleosin結(jié)構(gòu)域的蛋白序列。

1.2 Oleosin蛋白的理化性質(zhì)分析

利用ProtParam （https：//web.expasy.org/prot-param）數(shù)據(jù)庫(kù)分析山核桃和薄殼山核桃oleosin蛋白理化性質(zhì)，并且利用WoLF PSORT （https：//wolf-psort.hgc.jp）在線工具進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析。

1.3 Oleosin蛋白保守基序和系統(tǒng)進(jìn)化分析

山核桃與薄殼山核桃oleo sin蛋白保守基序分析參考徐胤等的方法。利用MEME Suite 5.4.1（https：//meme-suite.org/meme/doc/meme.html）對(duì)山核桃和薄殼山核桃oleosin蛋白保守基序進(jìn)行分析，最后利用TBtools軟件進(jìn)行優(yōu)化。利用DNAMAN軟件對(duì)oleosin基因家族氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)分析。通過(guò)Uniprot（UniProt）數(shù)據(jù)庫(kù)下載油菜、花生（Arachis hypogaea）和大豆的oleosin蛋白序列，結(jié)合已獲得的擬南芥、山核桃、薄殼山核桃oleosin蛋白序列，利用MEGA 7.0軟件通過(guò)鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，校對(duì)參數(shù)Bootstrap設(shè)置為1000，進(jìn)一步利用Evolview （https：//www.evol-genius.info/evolview-v2）在線工具進(jìn)行優(yōu)化。

1.4 Oleosin基因家族啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件分析

利用TBtools軟件從山核桃和薄殼山核桃基因組中導(dǎo)出oleosin基因上游2000bp啟動(dòng)子區(qū)域序列，然后利用Plant CARE （https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）預(yù)測(cè)山核桃和薄殼山核桃oleosin蛋白啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件。

1.5山核桃oleosin基因在胚發(fā)育不同階段的表達(dá)模式分析

為了研究山核桃oleosin基因在胚發(fā)育不同階段的表達(dá)豐度，利用NCBI Short Read Archive data-base（SRA） （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/）獲得山核桃胚發(fā)育不同階段轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（檢索號(hào)為PRJ-NA687050），獲得oleosin基因RPKM （Reads Per Kilobase Per Million Mapped Reads）數(shù)值，利用MEV4.9.0繪制熱圖。

1.6低溫脅迫及ABA處理下山核桃oleosin基因的表達(dá)模式分析

研究材料為浙江農(nóng)林大學(xué)張啟香教授課題組已成功誘導(dǎo)的山核桃愈傷組織。每個(gè)愈傷培養(yǎng)皿直徑為90mm，高度為20mm，培養(yǎng)皿中愈傷個(gè)數(shù)平均為9個(gè)。3個(gè)愈傷培養(yǎng)皿為1個(gè)重復(fù)。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。對(duì)生長(zhǎng)狀況良好的山核桃愈傷組織進(jìn)行4℃低溫和100μmol·L^-1ABA處理，并分別在處理0、2、4、6、8和12 h后取0.5 g愈傷組織，液氮速凍，利用Trizol法提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用于后續(xù)qRT-PCR檢測(cè)。反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptT-MRTreagent Kit，RR047A）和TB green試劑（RR820A）購(gòu)于TaKaRa公司。

利用Primer Primer 5軟件設(shè)計(jì)山核桃oleosin基因序列的特異性定量引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，以山核桃CCARF基因?yàn)閮?nèi)參基因（具體引物序列如下表1）?；蛳鄬?duì)表達(dá)量計(jì)算采用2-^ΔΔCt方法。

1.7山核桃oleosin蛋白亞細(xì)胞定位分析

載體與試劑：pBI221-UBQlO-GFP載體由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存；DNA聚合酶（Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，P505）購(gòu)于南京諾唯贊生物科技有限公司；瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒（E.Z.N.A.Gel Extraction Kit，OMEGA）購(gòu)于南京百思禾生物科技有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒（TIANGEN Mini Plasmid Kit）購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司；限制性內(nèi)切酶QuickCut^TMXbaI和QuickCut^TMBamH Ⅰ與T4 DNA連接酶均購(gòu)于TaKaRa公司；質(zhì)粒測(cè)序由北京擎科生物技術(shù)有限公司完成。

用SnapGene軟件分別在山核桃oleosin基因CCA0520S0025和CCA0791S0002的CDS序列兩端設(shè)計(jì)引物（CCA0520S0025-F：GGGTC TAGAATGTCT-GATCACTCAAGGCCATTGCCA0520S0025- R：GG-GGGATCCTGTCCTCCTTCCCTCTTGGGCCCA07-91S0002-F：GGGTCTAGAATGGCCGAGAACCAA-CAGCA和CCA0791S0002-R：GGGGGATCCGCC-CTGTGCACCAGAGACAT）。引物下劃線的為酶切位點(diǎn)Xba Ⅰ（TCTAGA）和BamH Ⅰ（GGATCC）。利用Trizol法提取山核桃胚RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TRAN，北京，P30702）獲得cDNA。以cDNA為模板，用CCA0520S0025-F與CCA0520S0025-R和CCA0791S0002-F與CCA0791S0002-R引物對(duì)山核桃oleosin基因CCA0520S0025和CCA0791S0002的CDS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系50μL：2×Phanta Max Buffer 25μL，10μmol·L^-1正反向引物各2μL，10 mmol·L^-1dNTP 1μL，模板cDNA 4μL，ddH₂O 15μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Poly-merase 1μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性15 s，58℃退火15 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。利用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒回收目的基因片段。利用限制性內(nèi)切酶Xba Ⅰ和BamH Ⅰ對(duì)pBI221-UBQ10-GFP載體與回收的目的基因片段進(jìn)行雙酶切。通過(guò)酶切連接的方法，構(gòu)建表達(dá)載體pBI221-UBQlO-CCA0520S0025-GFP和pBI221-UBQ10-CCA0791S0002-GFP，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確后，提取質(zhì)粒。

擬南芥懸浮細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系參考Zeng等的方法。將培養(yǎng)Sd的擬南芥懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)至50 mL離心管中，1000r·min^-1離心2 min，棄上清液，加入酶解液置于25℃搖床解離2h后，750r·min^-1離心10min，棄上清液，加入2倍的EP Buffer重懸細(xì)胞，750r·min^-1離心10 min，2次重復(fù)，吸取500μL擬南芥懸浮細(xì)胞至電擊杯，加入一定濃度的質(zhì)粒，如pBI221-UBQ10-CCA0520S0025-GFP和pBI221-UBQ10-CCA0791S0002-GFP分別與AtOLEO2-RFP（擬南芥oleosin基因）共轉(zhuǎn)化，靜置5～10 min，以130V和1000·F電壓電擊后，加入2mL TEX Buffer重懸細(xì)胞，倒入35 mm培養(yǎng)皿置于25℃培養(yǎng)12 h。利用激光共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP8）觀察亞細(xì)胞定位情況，具體分析山核桃oleosin基因與擬南芥oleosin標(biāo)志基因AtOLE02的亞細(xì)胞共定位情況，綠色熒光（GFP）接收波長(zhǎng)范圍為488～510 nm，紅色熒光（RFP）接收波長(zhǎng)范圍為532～588 nm。試驗(yàn)所用的擬南芥oleosin基因（AtOLEO2-RFP）質(zhì)粒由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

2結(jié)果與分析

2.1 Oleosin基因家族成員鑒定及理化性質(zhì)分析

以擬南芥oleosin基因作為參照，在山核桃和薄殼山核桃基因組中分別鑒定到7個(gè)和8個(gè)具有脯氨酸發(fā)卡結(jié)構(gòu)域的oleosin基因，進(jìn)一步利用Prot-Param軟件對(duì)15個(gè)oleosin蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示（表2），山核桃和薄殼山核桃oleosin基因編碼139～166個(gè)氨基酸；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為14.54～17.51ku；等電點(diǎn)范圍為9.33～10.36，蛋白不穩(wěn)定系數(shù)介于28.71～63.13之間，脂肪系數(shù)為88.86～112.11，平均親水性介于0.098～0.467之間。對(duì)亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CCA0520S0025、CCA0779S0183、CIL1212S0020、CIL093 8S0150可能定位于葉綠體，CCA0514S0208和CIL0009S0029可能定位于液泡膜，其余9個(gè)山核桃oleosin蛋白可能定位于細(xì)胞質(zhì)膜。綜上，山核桃與薄殼山核桃的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量均小于25 ku，具有較高的等電點(diǎn)和脂肪系數(shù)，即山核桃和薄殼山核桃具有相似的理化性質(zhì)。

2.2 Oleosin蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域及啟動(dòng)子順式作用元件分析

通過(guò)氨基酸多重序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)山核桃和薄殼山核桃oleosin蛋白都具有一個(gè)典型的且高度保守的“脯氨酸結(jié)”基序（圖1-A），即包含1個(gè)絲氨酸殘基和3個(gè)脯氨酸殘基，可簡(jiǎn)化為PX5SPX3P，該結(jié)構(gòu)是油體中特有的結(jié)構(gòu)。對(duì)山核桃與薄殼山核桃oleosin基因結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)oleosin基因家族成員均含有一個(gè)外顯子，無(wú)內(nèi)含子。山核桃與薄殼山核桃oleosin蛋白保守基序分析顯示，山核桃和薄殼山核桃15個(gè)oleosin基因均包含motif 1、motif2、motif3和motif4基序，推測(cè)該4個(gè)基序在oleosin蛋白序列中高度保守；從基序結(jié)構(gòu)和基序位置來(lái)看，CIL0938S0150、CCA0791S0002與CIL0252S0009的基序位置相似，而CIL0938S0150蛋白序列存在額外的motif 15基序，可能具有特異性的功能；類似的，CCA0656S0072、CCA0656S0074與CIL094S01193個(gè)蛋白具有一致的保守基序，暗示蛋白結(jié)構(gòu)和功能可能相似（圖1-B）。

通過(guò)PlantCARE在線工具對(duì)山核桃和薄殼山核桃oleosin基因啟動(dòng)子順式作用元件進(jìn)行功能預(yù)測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)山核桃和薄殼山核桃oleosin基因啟動(dòng)子均含有激素響應(yīng)和脅迫響應(yīng)元件。在山核桃和薄殼山核桃中分別有5個(gè)和7個(gè)oleosin基因啟動(dòng)子中含有MeJA響應(yīng)元件、分別有5個(gè)和4個(gè)oleosin基因啟動(dòng)子中含有GA響應(yīng)元件、分別有5個(gè)和6個(gè)oleosin基因啟動(dòng)子中含有ABA響應(yīng)元件。除了CCA0520S0025、CIL0922S0190和CIL0252S0009外，其余oleosin基因均含有光周期響應(yīng)元件。同時(shí)發(fā)現(xiàn)CCA0779S0183、CIL0009S0029、CIL1212S0020、CIL0212S0015與CIL0252S0009啟動(dòng)子中含有干旱響應(yīng)元件。CCA0779S0183、CIL0009S0029與CIL1494S0045啟動(dòng)子中含有低溫響應(yīng)元件（圖1-C）。在15個(gè)oleosin基因啟動(dòng)子中均檢測(cè)到應(yīng)對(duì)環(huán)境變化和激素信號(hào)相關(guān)的順式作用元件，因此推測(cè)山核桃和薄殼山核桃oleosin基因響應(yīng)逆境及激素信號(hào)而參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育。

2.3 Oleosin基因家族系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析

利用MEGA7.0軟件對(duì)山核桃（7個(gè)）和薄殼山核桃（8個(gè)）、擬南芥（17個(gè)）、油菜（17個(gè)）、花生（17個(gè)）和大豆（14個(gè)）的oleosin基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果表明，以上80個(gè)基因可劃分為4個(gè)亞家族，包括T-Oleosin、U-Oleosin、SH-Oleosin和SL-Oleosin（圖2）。山核桃與薄殼山核桃15個(gè)oleosin基因分布在U-Oleosin，SH- Oleosin，SL-Oleosin 3個(gè)亞家族。SL-Oleosin是最大亞族分支，約占山核桃和薄殼山核桃oleosin基因成員的1/2。在SL-Oleosin亞家族中，山核桃和薄殼山核桃oleosin基因分布在2個(gè)分支中，CCA0791S0002、CIL0938S0150與CIL0252S0009處于同一分支，親緣關(guān)系最近。另一分支中CCA0520S0025與CIL1494S0045、CCA0779S0183和CIL0922S0190匯聚。在U-Oleosin亞家族中，山核桃和薄殼山核桃oleosin基因同樣分布在2個(gè)分支中，CCA0674S0096和CIL0212S0015聚在同一分支，親緣關(guān)系最近；CIL1212S0020分布在另一分支中，未發(fā)現(xiàn)親緣關(guān)系較近的山核桃oleosin基因。在SH-Oleosin分支中，山核桃與薄殼山核桃oleosin基因聚在同一分支，親緣關(guān)系較近，先與花生和大豆oleosin基因匯聚在一個(gè)分支，最后與十字花科的油菜和擬南芥oleosin基因匯聚在一起。

2.4山核桃oleosin基因在胚發(fā)育不同階段的表達(dá)模式分析

利用山核桃胚發(fā)育不同階段轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，分析oleosin基因在胚發(fā)育不同階段（S1、S2、S3、S4、S5）的表達(dá)模式（圖3）。從oleosin基因表達(dá)水平分析，CCA0674S0096、CCA0779S0183、CCA0514S0208與CCA0520S0025表達(dá)趨勢(shì)一致可聚為一類；CCA0791S0002、CCA0656S0072與CCA0656S0074表達(dá)趨勢(shì)一致可聚為一類。從山核桃胚發(fā)育階段分析，oleosin基因表達(dá)模式在胚發(fā)育的Sl、S2和S3階段可聚為一類，S4和S5階段可聚為一類。

相對(duì)Sl時(shí)期，山核桃oleosin基因在胚發(fā)育不同階段均呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)表達(dá)；在CCA0656S0072與CCA0656S0074中oleosin基因在S5階段顯著上調(diào)表達(dá)；S2到S3階段，CCA0520S0025和CCA0791S0002中oleosin基因表達(dá)量顯著增加，因此推測(cè)oleosin基因在胚發(fā)育不同階段具有功能多樣性。

2.5山核桃oleosin基因在ABA處理與低溫脅迫下的表達(dá)模式分析

山核桃oleosin基因啟動(dòng)子區(qū)域含有1個(gè)至多個(gè)不等的ABA響應(yīng)元件和低溫脅迫響應(yīng)相關(guān)元件。挑選山核桃6個(gè)oleosin基因，利用qRT-PCR分析ABA和低溫脅迫條件下的基因表達(dá)模式。結(jié)果顯示（圖4-A），在ABA處理?xiàng)l件下，山核桃oleosin基因均呈現(xiàn)出上升表達(dá)趨勢(shì)。CCA0791S0002、CCA050S0025、CCA0514S0208和CCA0674S0096基因表達(dá)模式相近，呈現(xiàn)上升表達(dá)趨勢(shì)，CCA0791S0002和CCA050S0025均在ABA處理2h達(dá)到表達(dá)峰值；CCA0656S0074在ABA處理后呈現(xiàn)持續(xù)上升表達(dá)趨勢(shì)，表達(dá)量在處理12h后達(dá)到最高值；CCA0779S0183在ABA處理4h后出現(xiàn)下降表達(dá)趨勢(shì)，表達(dá)量在2h達(dá)到表達(dá)峰值。

在低溫脅迫處理?xiàng)l件下，山核桃oleosin基因表達(dá)呈現(xiàn)出3種不同的表達(dá)模式（圖4-B），分別呈現(xiàn)上升表達(dá)趨勢(shì)（CCA0791S0002和CCA0520S0025）、先下降后上升再下降的雙峰表達(dá)趨勢(shì)（CCA0514S0208）以及下降表達(dá)趨勢(shì)（CCA0656S0074、CCA0674S0096和CCA0779S0183）。

2.6 Oleosin蛋白亞細(xì)胞定位分析

為進(jìn)一步研究oleosin蛋白的亞細(xì)胞定位，分別構(gòu)建融合GFP標(biāo)簽的oleosin蛋白CCA0520S0025和CCA0791S0002瞬時(shí)轉(zhuǎn)化表達(dá)載體（pBI221-UBQ10-CCA0520S0025-GFP和pBI221-UBQ10-CCA0791S0002-GFP）（圖5）。利用擬南芥懸浮細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系，以擬南芥AtOLE02-RFP為陽(yáng)性對(duì)照，觀察oleosin蛋白的亞細(xì)胞定位情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CCA0520S0025-GFP和CCA0791S0002-GFP均與AtOLE02-RFP共定位，且都定位于油體，表明CCA0520S0025和CCA0791S0002均是油體蛋白。

3討論

本研究從山核桃和薄殼山核桃基因組中分別鑒定到7個(gè)和8個(gè)含有完整開放閱讀框的oleosin基因。目前已從擬南芥和油菜基因組中分別鑒定到了17個(gè)和48個(gè)oleosin基因。在四倍體棉種陸地棉（Gossypium hirsutum）和巴巴登棉（Gossypium bar-badense）中分別鑒定出25個(gè)和24個(gè)oleosin基因，而在二倍體棉種樹木棉（Gossypium arboreum）和雷蒙地棉（Gossypium raimondii）中分別鑒定出12個(gè)和13個(gè)oleosin基因。相對(duì)于油菜oleosin蛋白序列末端的高度可變性，導(dǎo)致其理化性質(zhì)存在一定差異性，屬于兩親性蛋白。通過(guò)理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，山核桃和薄殼山核桃oleosin蛋白屬于堿性蛋白。源自于不同物種的油體蛋白可劃分為6大類譜系：P-Oleosin，U-Oleosin， SL-Oleosin， SH-Oleosin， T-Oleo-sin和M-Oleosin。其中M-Oleosin存在于花椰菜，T-Oleosin僅存在于十字花科物種，P-Oleosin主要分布于綠藻，是U-Oleosin的來(lái)源，P-Oleosin可進(jìn)一步進(jìn)化為SL-Oleosin和SH-Oleosin。通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化分析，CIL12125S0020、AT3G18570和ATIG48990聚在同一分支，親緣關(guān)系較近，推測(cè)具有相似的生物學(xué)功能。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，CCA0656S0072與CCA0656S0074、CCA0520S0025與CIL149480045、CCA0779S0183與CIL092280190的蛋白序列、基因結(jié)構(gòu)及進(jìn)化上較為相近，分別可歸類為山核桃與薄殼山核桃的同源蛋白。

油體蛋白o(hù)leosin是存在于油體表面的一類重要蛋白，在油體形成、油體形態(tài)穩(wěn)定性、種子萌發(fā)及響應(yīng)逆境脅迫等方面具有重要調(diào)控作用。油體蛋白o(hù)leosin調(diào)控油體形成。研究發(fā)現(xiàn)，墨西哥鱷梨中油體蛋白PaOlel是中果皮特有的，與果實(shí)成熟相關(guān)，在青果期高表達(dá)，并且與果實(shí)含油量相關(guān)。在山核桃胚發(fā)育過(guò)程中，胚含油量在S1到S5階段不斷增加，其中S2到S3階段為快速積累階段。分析發(fā)現(xiàn)山核桃oleosin基因在胚發(fā)育不同階段也呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，其中CCA0520S0025和CCA07-91S0002在S2到S3階段的表達(dá)量顯著上調(diào)，推測(cè)在胚發(fā)育含油量快速積累階段發(fā)揮重要作用。油體蛋白o(hù)leosin調(diào)控油體大小與脂肪酸含量。在煙草中過(guò)表達(dá)油用芍藥Po Olel7.5基因，煙草種子百粒質(zhì)量和脂肪酸含量顯著增加；在擬南芥中超表達(dá)油菜oleosin基因（BnaOLEl-BnaOLE4），除Bna OLE1外，轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的油體均顯著大于野生型；同時(shí)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系脂肪酸組成改變，主要表現(xiàn)為亞油酸含量增加而花生酸含量降低。

油體蛋白o(hù)leosin響應(yīng)逆境脅迫。研究發(fā)現(xiàn)，甘藍(lán)型油菜經(jīng)30μmol·L^-1JA處理后，oleosin基因表達(dá)量增高；在干旱狀態(tài)下，野生型擬南芥經(jīng)ABA和山梨醇處理后，oleosin基因表達(dá)量增高；高梁（Sorghum bicolor）oleosin基因通過(guò)調(diào)節(jié)膜滲透性，可參與ABA響應(yīng)；0.5μmol·L^-1ABA處理擬南芥AtSAG突變體時(shí)，OLE2基因的表達(dá)量顯著上升。油體蛋白能維持低溫脅迫下油體的完整性，進(jìn)而提高種子的抗寒力，保證種子經(jīng)過(guò)低溫脅迫后仍然能正常萌發(fā)。研究發(fā)現(xiàn)，在油體蛋白缺失的突變體中，油體蛋白水平影響了種子的發(fā)芽和耐凍性；擬南芥單突變體種子olel和ole2在低溫處理后，萌發(fā)率降低；雙突變體種子olel ole2和olel ole3經(jīng)過(guò)4℃低溫處理后加快了油體的融合，使種子出現(xiàn)致死現(xiàn)象。在擬南芥oleosinl突變體中超表達(dá)飼用高梁oleosin基因（Sb Ole）并進(jìn)行冷凍處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超表達(dá)SbOle基因植株提高了擬南芥的發(fā)芽率。

綜上所述，油體蛋白o(hù)leosin在油體形成、種子萌發(fā)以及逆境脅迫中發(fā)揮重要作用，對(duì)于山核桃oleosin蛋白功能分析是下一步重要工作內(nèi)容，特別是CCA0520S0025和CCA0791S0002響應(yīng)山核桃油脂積累，響應(yīng)ABA以及低溫誘導(dǎo)，可能參與調(diào)控山核桃種子形成含油量積累、種子萌發(fā)等生物學(xué)過(guò)程。

4結(jié)論

對(duì)山核桃和薄殼山核桃基因組中oleosin基因家族成員進(jìn)行了基因結(jié)構(gòu)分析；系統(tǒng)進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)oleosin基因家族成員主要分布在U-Oleosin、SL-Oleosin和SH-Oleosin 3個(gè)亞家族；順式作用元件分析，結(jié)果顯示oleosin基因家族成員可能參與逆境脅迫和激素調(diào)控。熒光定量PCR結(jié)果表明山核桃ole-osin基因CCA0520S0025和CCA0791S0002響應(yīng)ABA和低溫脅迫?；谵D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明oleo-sin基因家族成員在山核桃胚發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。亞細(xì)胞定位分析進(jìn)一步表明CCA0520S0025和CCA0791S0002蛋白均定位于油體，可能在油脂合成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。