蓯蓉舒痙顆粒對(duì)帕金森病模型大鼠延髓的保護(hù)作用

林 瑤，唐嵐芳，李茜羽，黃佩珍，許 茜，王 林，袁明洲，蔡 晶*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)修園臨床醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350122）

帕金森?。≒arkinson” s disease，PD）是一種中老年人常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要臨床表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)遲緩、靜止性震顫、肌強(qiáng)直等，典型的病理變化是中腦黑質(zhì)區(qū)致密部多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的大量變性缺失，臨床主要治療方法是左旋多巴替代療法。但已有研究表明，當(dāng)患者出現(xiàn)典型臨床癥狀時(shí)，黑質(zhì)紋狀體區(qū)域的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞已經(jīng)丟失60%～70%，而左旋多巴替代療法只補(bǔ)充減少的多巴胺，并不能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活，故只能減輕癥狀，并不能延緩病情的進(jìn)展，且長(zhǎng)期使用左旋多巴會(huì)出現(xiàn)多種運(yùn)動(dòng)并發(fā)癥［1］。因此，如果能在神經(jīng)細(xì)胞變性的早期給予神經(jīng)保護(hù)，則可以盡可能地保護(hù)更多神經(jīng)細(xì)胞，減少或者延后左旋多巴的使用，達(dá)到較好的成本-效益比。

蓯蓉舒痙顆粒由肉蓯蓉、制黃精、丹參、赤芍、牡丹皮等藥物按比例濃縮制成，是課題組多年臨床經(jīng)驗(yàn)方。前期臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)其對(duì)早期PD 患者的運(yùn)動(dòng)癥狀有一定改善作用［2］，進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其君藥肉蓯蓉對(duì)PD 模型大鼠行為學(xué)及黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞凋亡均有減輕作用［3-4］。由于延髓是PD 發(fā)病過(guò)程中最早受影響的部位，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)觀察蓯蓉舒痙顆粒對(duì)PD 模型大鼠延髓的影響，為PD 的早期神經(jīng)保護(hù)治療提供實(shí)驗(yàn)支持。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)6～7 月齡健康雄性SD 大鼠50 只，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK（浙）2019-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（閩）2019-0007。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度20～22 ℃，相對(duì)濕度60%～65%，光照/黑暗周期為12 h，飲水?dāng)z食自由。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 蓯蓉舒痙顆粒由肉蓯蓉6 g，制黃精12 g，丹參15 g，赤芍12 g，牡丹皮10 g 組成，由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院提供。取蓯蓉舒痙顆粒5 g 溶于100 mL 煮沸的蒸餾水中，配成濃度為50 mg/mL 的蓯蓉舒痙顆粒藥液，分裝后置于4 ℃冰箱中保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 美多芭（上海羅氏制藥有限公司，批號(hào)：H10930198）；魚(yú)藤酮、葵花油（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)：R8875、S5007）；電鏡固定液（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號(hào)：G1102）；酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）、α-突觸核蛋白（α-synuclein）、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPARγ）、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ 共激活因子-1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-α，PGC-1α）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated X，Bax）、激活型半胱氨酸蛋白酶3（cleaved caspase-3）、β-actin 抗體（美國(guó)Abcam 公司，批號(hào)：ab51134、ab138501、ab178860、ab145641、ab32124、ab32503、ab2302、ab8226）；TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA 裂解液（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：T2190、PC0020、R0010）；TH免疫組化試劑盒（福建邁新技術(shù)有限公司，批號(hào)：KIT-9720）；ECL 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Bio-RAD 公司，批號(hào)：1705060）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 H-7650 透射電子顯微鏡（日本Hitachi 公司）；RM2235 石蠟切片機(jī)、UC6 超薄切片機(jī)、MDL 光學(xué)顯微鏡（德國(guó)Leica 公司）；ELX800 多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-TEK 公司）；Universal Hood Ⅱ化學(xué)發(fā)光成像儀、PowerPac Basic 電泳儀、PowerPac Basic轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；Motic Med 6.0 組織細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）。

2 方 法

2.1 模型建立及評(píng)價(jià) PD模型制備采用SHERER［5］創(chuàng)立的經(jīng)典方法：將魚(yú)藤酮溶于葵花油乳化液，配置終濃度為1.5 mg/mL 的魚(yú)藤酮葵花油乳化液，按1.5 mg/（kg·d）于大鼠頸背部進(jìn)行皮下注射，連續(xù)注射14 d。觀察大鼠的行為學(xué)改變，參照VOITENKO［6］的行為學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，2～8 分者為合格的PD 模型大鼠。

2.2 動(dòng)物分組及干預(yù) 將50 只健康SD 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組10 只和造模組40 只。造模組大鼠按“2.1”項(xiàng)下的造模方法建立PD 模型，對(duì)照組大鼠于頸背部皮下注射等體積葵花油。造模結(jié)束后，行為學(xué)評(píng)分1 分有3 只，10 分有7 只，予剔除，最終造模成功的大鼠共30 只。將造模成功的30 只大鼠再次隨機(jī)分為模型組、蓯蓉舒痙組、美多芭組，每組各10 只。蓯蓉舒痙組按50 mg/（kg·d）予蓯蓉舒痙藥液灌胃，美多芭組按5 mg/（kg·d）予美多芭混懸液灌胃，對(duì)照組和模型組予等量生理鹽水灌胃，每日灌胃1 次，連續(xù)灌胃14 d。

2.3 標(biāo)本采集 灌胃14 d 后各組大鼠以20%烏拉坦按5 mL/kg 腹腔注射麻醉后取材。各組取3 只大鼠心臟灌流后分離中腦黑質(zhì)與延髓，4%多聚甲醛固定過(guò)夜，作石蠟包埋切片，用于免疫組化及TUNEL觀察。各組另取3 只大鼠冰上迅速剝離延髓，用于超微結(jié)構(gòu)觀察。各組剩余4 只大鼠，待其完全麻醉后迅速斷頭取腦，冰盤(pán)上分離延髓，用預(yù)冷的0.9%氯化鈉反復(fù)沖洗，除去組織中血液，濾紙吸干，置于-80 ℃冰箱保存，用于蛋白含量檢測(cè)。

2.4 觀察指標(biāo)

2.4.1 行為學(xué)檢測(cè) 觀察各組大鼠每天進(jìn)食、飲水、活動(dòng)、精神情況，并做好記錄。分別于造模后和干預(yù)第7、14 天在同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)各組大鼠進(jìn)行網(wǎng)格實(shí)驗(yàn)和斜板實(shí)驗(yàn)。① 網(wǎng)格實(shí)驗(yàn)：將大鼠以倒立姿勢(shì)置于一個(gè)與地面垂直的金屬網(wǎng)格（長(zhǎng)80 cm、寬50 cm、格間距1 cm）中央，待其四肢抓牢網(wǎng)格后，開(kāi)始記錄大鼠從靜止?fàn)顟B(tài)到任意一肢開(kāi)始活動(dòng)所需的時(shí)間，即為移動(dòng)潛伏期。每只大鼠重復(fù)測(cè)3 次，每次間隔5 min。② 斜板實(shí)驗(yàn)：依次將各組大鼠置于覆蓋了2 mm 厚橡膠墊的平板中央，注意不讓大鼠前后肢抓住木板邊緣，初始平板與地面夾角為25°，當(dāng)大鼠在該角度的平板上停留時(shí)間≥5 s，斜板向上增加 5°；當(dāng)大鼠在斜板上的靜止時(shí)間＜5 s 時(shí)，記錄該傾斜角度。每只大鼠重復(fù)測(cè)3 次，每次間隔5 min。

2.4.2 免疫組化檢測(cè)TH 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)上述中腦黑質(zhì)石蠟切片進(jìn)行免疫組化染色，200 倍顯微鏡下觀察，以棕黃色或淡黃色顆粒染色為陽(yáng)性表達(dá)。每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)視野，應(yīng)用麥克奧迪組織細(xì)胞圖像系統(tǒng)分析圖片，計(jì)算TH陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)。

2.4.3 TUNEL 檢測(cè)大鼠延髓細(xì)胞凋亡率 按試劑盒說(shuō)明書(shū)將各組大鼠延髓石蠟切片進(jìn)行TUNEL 染色，200 倍顯微鏡下觀察大鼠延髓區(qū)細(xì)胞凋亡情況，TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞核即凋亡細(xì)胞核在鏡下呈現(xiàn)棕色，正常細(xì)胞核為藍(lán)色。每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)視野統(tǒng)計(jì)TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞及細(xì)胞總數(shù)。

細(xì)胞凋亡率＝TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)×100%

2.4.4 透射電子顯微鏡觀察大鼠延髓線粒體超微結(jié)構(gòu) 將修整過(guò)的蠟塊置于3%戊二醛固定液中，乙醇梯度脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，制作超薄切片，醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛染色，透射電鏡下觀察延髓線粒體超微結(jié)構(gòu)并攝片。

2.4.5 Western blot法檢測(cè)大鼠黑質(zhì)區(qū)及延髓相關(guān)蛋白表達(dá) 取相應(yīng)腦組織50 mg，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。經(jīng)過(guò)蛋白變性、SDS-PAGE電泳、濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂牛奶封閉1 h。加一抗α-synuclein（1∶1 000）、PPARγ（1∶1 000）、PGC-1α（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、cleaved caspase-3（1∶1 000）、β-actin（1∶2 000），4 ℃搖床過(guò)夜。TBST 洗滌，加入二抗稀釋液（1∶5 000），室溫孵育2 h，TBST 洗滌，ECL 顯影并成像，Image Lab 4.0 軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與β-actin 條帶灰度值的比值做為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，多組間比較進(jìn)行單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法或Games-Howell 法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié) 果

3.1 4 組大鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠造模后和干預(yù)7、14 d 后移動(dòng)潛伏期明顯縮短，斜板傾斜角度明顯減?。≒＜0.05）；與模型組比較，蓯蓉舒痙組和美多芭組大鼠干預(yù)7、14 d后移動(dòng)潛伏期明顯延長(zhǎng)，斜板傾斜角度明顯增大（P＜0.05）。見(jiàn)表1、表2。

表1 4 組大鼠網(wǎng)格實(shí)驗(yàn)移動(dòng)潛伏期比較（±s） s

表1 4 組大鼠網(wǎng)格實(shí)驗(yàn)移動(dòng)潛伏期比較（±s） s

注：與對(duì)照組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

組別對(duì) 照 組模 型 組蓯蓉舒痙組美多芭組造模后2.93±0.21 1.55±0.131）1.60±0.10 1.58±0.13干預(yù)7 d 2.93±0.21 1.55±0.121）2.03±0.152）2.17±0.152）干預(yù)14 d 3.03±0.21 1.53±0.131）2.60±0.202）2.67±0.232）

表2 4 組大鼠斜板實(shí)驗(yàn)傾斜角度比較（±s） °

表2 4 組大鼠斜板實(shí)驗(yàn)傾斜角度比較（±s） °

注：與對(duì)照組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

組別對(duì) 照 組模 型 組蓯蓉舒痙組美多芭組造模后60.00±4.88 44.77±4.451）43.00±3.80 44.40±3.14干預(yù)7 d 59.43±6.78 42.47±3.201）50.43±4.072）50.33±3.232）干預(yù)14 d 60.10±5.90 42.10±3.151）55.40±4.412）56.60±3.912）

3.2 4 組大鼠中腦TH 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠黑質(zhì)區(qū)TH 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯降低；經(jīng)蓯蓉舒痙顆粒與美多芭干預(yù)后，黑質(zhì)區(qū)TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較模型組明顯增多（P＜0.05）。見(jiàn)圖1、圖2。

3.3 4 組大鼠延髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況比較 模型組大鼠延髓神經(jīng)細(xì)胞TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯增加（P＜0.05）；經(jīng)蓯蓉舒痙顆粒及美多芭干預(yù)后，TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.05）。見(jiàn)圖3、圖4。

3.4 4 組大鼠線粒體超微結(jié)構(gòu)比較 模型組大鼠延髓線粒體腫脹，雙層膜結(jié)構(gòu)不清，嵴排列紊亂，部分發(fā)生斷裂和空泡化；蓯蓉舒痙組和美多芭組大鼠延髓大部分線粒體形態(tài)基本正常，腫脹少見(jiàn)，雙層膜結(jié)構(gòu)清晰，嵴排列相對(duì)整齊。見(jiàn)圖5。

圖1 4 組大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)TH 免疫組化圖（×200）

圖2 4 組大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)TH 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較

圖3 4 組大鼠延髓細(xì)胞凋亡率比較

圖4 4 組大鼠延髓神經(jīng)細(xì)胞TUNEL 染色圖（×200）

圖5 4 組大鼠延髓神經(jīng)細(xì)胞線粒體透射電鏡圖（×50 000）

3.5 4 組大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)和延髓相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)α-synuclein 和延髓cleaved caspase-3、Bax 蛋白表達(dá)明顯提高（P＜0.05），延髓Bcl-2、PPARγ 和PGC-1α 蛋白明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，蓯蓉舒痙組和美多芭組組大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)α-synuclein 和延髓cleaved caspase-3、Bax蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05），延髓Bcl-2、PPARγ 和PGC-1α 蛋白明顯提高（P＜0.05）。見(jiàn)圖6～8。

圖6 4 組大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)α-synuclein 蛋白表達(dá)比較

圖7 4 組大鼠延髓Bcl-2、cleaved caspase-3、Bax 蛋白表達(dá)比較

圖8 4 組大鼠延髓PPARγ、PGC-1α 蛋白表達(dá)比較

4 討 論

中醫(yī)學(xué)將PD 歸入“顫證”范疇，認(rèn)為其病位雖然在腦，但實(shí)則肝腎虧虛，氣血不足，筋脈失養(yǎng)，痰瘀內(nèi)生，阻滯腦絡(luò)，發(fā)為顫振［7］。蓯蓉舒痙顆粒中肉蓯蓉為君藥，補(bǔ)益肝腎、填精益髓；制黃精為臣藥，健脾益氣、滋養(yǎng)腎陰；丹參、赤芍、牡丹皮為佐藥，祛瘀生新、清熱涼血、舒痙止痛。諸藥配伍，充實(shí)腦髓，濡潤(rùn)筋脈。課題組前期研究也證實(shí)蓯蓉舒痙顆粒能減輕帕金森患者的癥狀，提高帕金森綜合評(píng)分量表評(píng)分［2］。

BRAAK 等［8］通過(guò)尸檢發(fā)現(xiàn)，PD 最早累及的部位是延髓，之后依次進(jìn)展至橋腦、中腦，最后累及間腦和皮層。當(dāng)患者出現(xiàn)典型臨床癥狀時(shí)，延髓、中腦黑質(zhì)等部位均已受累，且多巴胺神經(jīng)細(xì)胞丟失超過(guò)60%。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用網(wǎng)格實(shí)驗(yàn)評(píng)估各組大鼠肌肉僵直狀態(tài)，移動(dòng)潛伏期越短說(shuō)明肌肉越僵直；應(yīng)用斜板實(shí)驗(yàn)評(píng)估大鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力，斜板傾斜角度越大表示運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力越強(qiáng)。TH 陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)可反映腦內(nèi)存活的多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)量，而αsynuclein 的過(guò)度堆積是PD 的重要病理特征，二者均為PD 動(dòng)物模型造模是否成功的重要標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠移動(dòng)潛伏期縮短，斜板傾斜角度減小，黑質(zhì)區(qū)TH 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少，α-synuclein 蛋白表達(dá)提高，提示造模成功；與模型組比較，蓯蓉舒痙組大鼠移動(dòng)潛伏期延長(zhǎng)，斜板傾斜角度增加，黑質(zhì)區(qū)TH 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加，αsynuclein 蛋白表達(dá)降低，且與陽(yáng)性對(duì)照的美多芭組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示蓯蓉舒痙顆粒能改善PD 模型大鼠肌肉僵直狀態(tài)和運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，對(duì)PD 模型大鼠具有治療作用。

線粒體功能障礙是PD 多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞凋亡的核心機(jī)制，PPARγ 及其輔助激活因子PGC-1α 是重要的細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄因子，主要表達(dá)于高能量需求且富含線粒體的組織中，如腦、脂肪組織、心臟、肝臟等，廣泛參與線粒體生物合成及能量代謝［9］。PGC-1α作為PPARγ 的輔助激活因子，與PPARγ 相結(jié)合，能調(diào)節(jié)腦組織線粒體基因表達(dá)，促進(jìn)線粒體氧化磷酸化，維持線粒體形態(tài)，從而正性調(diào)節(jié)線粒體功能與代謝［10］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蓯蓉舒痙干預(yù)后，線粒體腫脹、嵴排列紊亂、斷裂等現(xiàn)象較模型組有所緩解，PPARγ、PGC-1α 的蛋白表達(dá)量有明顯增加，延髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯下降，提示蓯蓉舒痙顆粒可能通過(guò)提高延髓PPARγ、PGC-1α 表達(dá)來(lái)保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)，從而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。

中醫(yī)學(xué)講求“辨證論治”和“整體觀念”，具有毒副作用相對(duì)較小的優(yōu)勢(shì)，中西醫(yī)結(jié)合治療PD，可以減少或者延后西藥的使用。本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典的魚(yú)藤酮PD 模型，主要病理?yè)p傷在黑質(zhì)紋狀體，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其延髓神經(jīng)細(xì)胞也會(huì)出現(xiàn)一定損傷，蓯蓉舒痙顆?？赏ㄟ^(guò)提高延髓PPARγ、PGC-1α 表達(dá)來(lái)保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)，為蓯蓉舒痙顆粒應(yīng)用于早期PD 的治療提供了理論基礎(chǔ)與依據(jù)。