血漿循環(huán)游離DNA 含量及完整性在乳腺癌中的臨床價(jià)值

樊麗壯，王博，徐愛蘭，劉艷佳

（佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科，黑龍江 佳木斯 154000）

乳腺癌（breast cancer）是發(fā)病率最高的癌癥，也是癌癥死亡的主要原因[1]。研究顯示[2，3]，轉(zhuǎn)移性乳腺癌的生存率下降至25%以下，早期診斷可以降低20%的死亡率。循環(huán)游離DNA（circulating cell-free DNA，cf-DNA）是一種血液或體液中游離于細(xì)胞之外的DNA[4]。cf-DNA 檢測(cè)屬于液體活檢的一種，對(duì)于診斷原發(fā)性腫瘤或難以提取樣本的組織轉(zhuǎn)移性病變的階段，可以提供可靠的替代方案[5]；同時(shí)也可以與乳房X 線檢查相結(jié)合作為一種有價(jià)值的臨床實(shí)踐工具，從而更好地篩選出適合活檢或隨訪乳腺癌候選者。近年來(lái)，隨著基因組測(cè)序自動(dòng)化，基因芯片技術(shù)日趨成熟，利用分子生物學(xué)技術(shù)作為乳腺癌的輔助診斷成為一種趨勢(shì)[6]。研究表明[7]，基因和分子生物標(biāo)記物進(jìn)行分類有助于預(yù)測(cè)單個(gè)腫瘤的病程，是腫瘤下一步采取治療的方法。目前，cf-DNA 在臨床應(yīng)用價(jià)值已得到證實(shí)[8-10]。但受初始樣本、提取及檢測(cè)方法、儀器靈敏度、實(shí)驗(yàn)操作等多方面的影響，cf-DNA 含量及完整性檢測(cè)結(jié)果各有不同，對(duì)臨床使用價(jià)值的判定也不同。本研究通過檢測(cè)乳腺癌患者外周血液中cf-DNA Alu 序列長(zhǎng)、短片段（241 bp、100 bp）含量及cf-DNA 完整性（Alu 241/100），探討循環(huán)游離DNA 在乳腺癌輔助診斷中的臨床價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2020 年9 月-2021 年7 月佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治的女性乳腺癌患者血液樣本56 例作為病例組，年齡35～75歲，平均年齡55歲；合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39 例、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)影像學(xué)及病理組織學(xué)穿刺活檢確診為乳腺癌患者；②臨床資料齊全且自愿入組；③無(wú)其他腫瘤病史；④術(shù)前均未接受放化療、內(nèi)分泌治療及靶向治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其它系統(tǒng)疾病或者惡性腫瘤者；②妊娠期或哺乳期者；③臨床資料不完整者。同時(shí)收集佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院體檢中心體檢健康者20 名的血液樣本作為對(duì)照組,均為女性，年齡25～65歲，平均年齡45 歲。兩組年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），可對(duì)比。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，所有研究對(duì)象均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 主要儀器和試劑 超低溫冰箱（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)），Qubit 4 Fluoromete（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)），離心機(jī)（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)），PCR 儀（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)），實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）,High Pure PCR Template Preparation Kit（Roch，中國(guó)），Qubit dsDNAHS Assay Kit（Invitrogen，美國(guó)）,探針引物（睿博興科生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集和DNA 提取 用檸檬酸鈉（1∶9）藍(lán)色真空采血管在手術(shù)前一天早晨7∶30 空腹收集10 ml 肘正中靜脈血液，室溫靜置30 min后，4 ℃3000 r/min離心10 min 粗離血漿；取上清血漿至1.5 ml 滅菌潔凈離心管中，4 ℃8000 r/min 第2 次離心15 min 獲得無(wú)血細(xì)胞成分的純血漿。用1.5 ml 滅菌潔凈離心管分裝（每管200 μl），采用High Pure PCR Template Preparation Kit，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作提取DNA，放置于-80 ℃?zhèn)溆谩２捎肣ubit dsDNAHS Assay Kit 對(duì)DNA 進(jìn)行濃度測(cè)定，同時(shí)采用Qubit 4 Fluoromete 測(cè)定吸光度（A260/280）值，取比值為1.6～1.8的DNA 樣本，提取的DNA-20 ℃保存。為保證試驗(yàn)精確性，均采用同一批號(hào)的試劑盒提取所有血漿標(biāo)本。

1.3.2 血漿循環(huán)游離DNA 完整性的檢測(cè) 引物序列由睿博興科生物技術(shù)有限公司合成，PCR 引物序列及循環(huán)參數(shù)[11]見表1。引物按照說明書操作完成，配置成10 μmol/ml 的溶液于-20 ℃保存。

表1 PCR 引物序列及循環(huán)參數(shù)表

1.3.3 配置標(biāo)準(zhǔn)品 用T-A 克隆技術(shù)，構(gòu)建不同hTERT DNA 片段的質(zhì)粒及內(nèi)參β-actin 的質(zhì)粒，提取質(zhì)粒DNA，測(cè)其濃度并換算成拷貝數(shù)，10 倍梯度稀釋后作為標(biāo)準(zhǔn)品。每個(gè)標(biāo)本檢測(cè)3 次后再取平均值。根據(jù)擴(kuò)增后得到的Ct 值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 熒光定量PCR 體系 按照表2 進(jìn)行配制體系，于冰上或冰盒中添加至qPCR 專用96 孔板中。

表2 配置PCR 反應(yīng)體系表

1.3.5 PCR 循環(huán)參數(shù) 95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸31 s，40 個(gè)循環(huán)擴(kuò)增；最后72 ℃延伸31 s 結(jié)束反應(yīng)，溶解曲線階段儀器默認(rèn)設(shè)置。為評(píng)估血漿DNA 含量及完整性指數(shù)，對(duì)乳腺癌的cf-DNA 分別擴(kuò)增其基于β-actin 和基因hTERT 長(zhǎng)、短片段質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線，并以長(zhǎng)、短片段擴(kuò)增產(chǎn)物比值作為DNA 完整性指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8 版軟件對(duì)所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)cf-DNA 分析和檢驗(yàn)、作圖。計(jì)量資料用[M（P25，P75）]表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。使用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線來(lái)評(píng)估血漿循環(huán)游離DNA 在乳腺癌診斷上的作用。使用Fisher 精準(zhǔn)檢驗(yàn)分析乳腺癌患者臨床病理參數(shù)與cf-DNA 完整性的關(guān)系。雙側(cè)P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組長(zhǎng)、短片段血漿cf-DNA 含量比較 長(zhǎng)片段241 bp 在病例組和對(duì)照組血漿中表達(dá)水平分別為[7.57（5.07，10.97）]和[3.72（1.08，6.56）]，組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；短片段100 bp 在病例組和對(duì)照組血漿中表達(dá)水平分別為[33.99（16.36，58.44）]和[14.22（12.11，16.61）]，組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 兩組長(zhǎng)、短片段血漿cfDNA 含量比較

2.2 兩組血漿cf-DNA 完整性比較 病例組血漿cf-DNA 完整性水平為[0.38（0.30，0.62）]，高于對(duì)照組的[0.24（0.08，0.36）]，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 兩組血漿cf-DNA 完整性比較

2.3 ROC 曲線分析 通過對(duì)血漿長(zhǎng)片段241 bp 和短片段100 bp 含量及cf-DNA 完整性的ROC 曲線分析，241 bp hTERT 區(qū)間曲線下面積為0.79（95%置信區(qū)間為0.64～0.94，P＜0.0001），cut-off 值為5.96，敏感度為70.00%，特異度為90.00%；100 bp hTERT區(qū)間曲線下面積為0.99（95%置信區(qū)間為0.98～1，P＜0.0001），cut-off 值為16.13，敏感度為100.00%，特異度為95.00%；cf-DNA 完整性曲線下面積為0.59（95%置信區(qū)間為0.46～0.73，P=0.1985），cut-off 值為0.29,敏感性44.46%，特異度85.00%，見圖3。

圖3 ROC 曲線分析圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 構(gòu)建成β-actin 及241 bp、100 bp 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線，β-actin 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性決定系數(shù)（R2）=0.9583，擴(kuò)增效率達(dá)93.40%；100 bp 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性決定系數(shù)R2=0.8745，擴(kuò)增效率達(dá)91.70%；241 bp 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性決定系數(shù)R2=0.9695，擴(kuò)增效率達(dá)99.30%。內(nèi)參β-actin 及100 bp 及241 bp 目的基因熔解曲線出現(xiàn)微量雜峰，見圖4。

圖4 目的基因擴(kuò)增曲線和熔解曲線圖

圖4 目的基因擴(kuò)增曲線和熔解曲線圖（續(xù)）

2.5 有、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌患者血漿cf-DNA 完整性比較 無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌患者血漿cf-DNA 完整性為[0.18（0.13，0.22）]，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者血漿cf-DNA 完整性為[0.33（0.22，0.63）],組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。

圖5 有、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移血漿cf-DNA 完整性比較

3 討論

癌癥會(huì)隨著時(shí)間的推移改變形狀和形式，故乳腺癌早期診斷對(duì)于降低癌癥相關(guān)死亡率至關(guān)重要[12，13]。血漿cf-DNA 被認(rèn)為是診斷癌癥的新型標(biāo)志物，可以提供潛在臨床相關(guān)信息的生物來(lái)源，滿足在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域上方便微創(chuàng)的進(jìn)步需要[14]。以上原因使得cf-DNA 分析成為腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。當(dāng)機(jī)體處于癌癥狀態(tài)時(shí),外周血漿cf-DNA 增多[15，16]。因此，可通過無(wú)創(chuàng)性血漿cf-DNA 檢測(cè)來(lái)早期診斷乳腺癌。

本研究選取Alu 序列241 bp 和100 bp hTERT目的基因作為擴(kuò)增的長(zhǎng)短片段，分析病例組與對(duì)照組中血漿cf-DNA 長(zhǎng)短片段的含量，發(fā)現(xiàn)病例組血漿cf-DNA 含量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與Miao Y等[17]研究結(jié)果一致，分析原因可能為自噬和壞死將更高濃度的基因組DNA 從腫瘤細(xì)胞釋放到循環(huán)中，此外癌癥患者血清中的DNA 酶活性受到抑制，而健康受試者則沒有。有學(xué)者報(bào)道[18]，高水平的血漿cf-DNA 與侵襲性分子腫瘤譜和癌癥的代謝活性有關(guān)。本研究對(duì)病例組和對(duì)照組血漿cf-DNA 完整性的進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，病例組cf-DNA 完整性高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其結(jié)論與Kamel AM等[19]結(jié)果相似，考慮可能歸因于腫瘤組織中的高壞死活性，吞噬細(xì)胞無(wú)法全部清除凋亡和壞死細(xì)胞，從而升高了血液中長(zhǎng)DNA 片段的濃度，引起血漿cf-DNA 完整性顯著升高。然后，使用ROC 曲線評(píng)估血漿循環(huán)游離DNA 在乳腺癌診斷上的作用，再分析血漿循環(huán)游離DNA 含量和完整性后發(fā)現(xiàn)，241 bp hTERT 區(qū)間曲線下面積為0.79，cut-off 值為5.96，敏感度為70.00%，特異度為90.00%；100 bp hTERT 區(qū)間曲線下面積為0.99，cut-off 值為16.13，敏感度為100.00%，特異度為95.00%；cf-DNA 完整性曲線下面積為0.59，cut-off值為0.29,敏感性44.46%，特異度85.00%，說明血漿cf-DNA 的長(zhǎng)短片段和完整性的敏感度、特異度均較高，與Cao G等[20]結(jié)果類似，其研究也發(fā)現(xiàn)血漿cf-DNA 的敏感性和特異性以及完整性高于傳統(tǒng)腫瘤生物標(biāo)志物，提示血漿cf-DNA 可以起到健康篩查與輔助診斷的作用。

研究表明[21]，在淋巴和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移性患者中，乳腺癌血漿cf-DNA 完整性直接定量顯示升高。本研究結(jié)果顯示，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌患者血漿cf-DNA 完整性為[0.18（0.13，0.22）]，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者血漿cf-DNA 完整性為[0.33（0.22，0.63）],組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），分析認(rèn)為發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移后腫瘤負(fù)荷、血管分布、細(xì)胞生長(zhǎng)更加旺盛[22]，提示cf-DNA 完整性可用作乳腺癌的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。不同的機(jī)構(gòu)未采用統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的操作前分析流程（樣本收集，DNA 提取方法，試劑盒的應(yīng)用），導(dǎo)致研究結(jié)果存在差異，因此對(duì)于血漿cf-DNA 片段大小、完整性與實(shí)體腫瘤、腫瘤標(biāo)志物及腫瘤分期、類型等的關(guān)系還需要深入研究。

綜上所述，血漿cf-DNA 作為液體活檢的一種標(biāo)志物，其含量和完整性可以作為乳腺癌輔助診斷的潛在生物學(xué)指標(biāo)，在乳腺癌臨床實(shí)踐中可提高乳腺癌患者的診斷率。同時(shí)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與完整性相關(guān)，乳腺癌淋巴結(jié)完整性高于無(wú)轉(zhuǎn)移者，但其機(jī)制仍尚未明確，且其診斷價(jià)值與腫瘤負(fù)荷的關(guān)系也存在爭(zhēng)議。癌癥中血漿cf-DNA 片段的大小分布可能是另一個(gè)信息參數(shù)，代表不同的釋放機(jī)制和細(xì)胞外代謝過程。采用不同的血漿循環(huán)游離定量方法導(dǎo)致缺乏標(biāo)準(zhǔn)水平范圍，并且與臨床數(shù)據(jù)和終點(diǎn)相比，會(huì)出現(xiàn)差異結(jié)果?？偠灾琧f-DNA 液態(tài)活檢是未來(lái)可期的技術(shù)，雖然目前面臨著一些研究和臨床應(yīng)用的難題，但隨著醫(yī)學(xué)相關(guān)技術(shù)的快速發(fā)展，相信cf-DNA在臨床疾病診斷方面具有應(yīng)用前景。