A20 對脂多糖誘導(dǎo)人樹突狀細(xì)胞成熟度及功能的影響

何躍，黃麗，姚天玉，張芷茹，陳潔

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院眼科1，風(fēng)濕免疫科2，四川 瀘州 646000）

20 世紀(jì)70 年代，Steinman RM等[1，2]在小鼠外周淋巴器官中鑒定出具有現(xiàn)代免疫學(xué)概念的樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）。DCs 不僅是天然免疫和適應(yīng)性免疫之間的橋梁，也能啟動免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)免疫耐受[3]。DCs8 是最重要抗原提呈細(xì)胞，其所誘導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答在腫瘤、免疫中具有重要意義[4，5]。A20又稱為腫瘤壞死因子-α（TNF-α）誘導(dǎo)的蛋白3，是泛素（Ub）依賴性信號的有效調(diào)節(jié)劑，其能夠通過去泛素化功能減弱NF-κB 信號系統(tǒng)的活性，從而發(fā)揮對天然免疫反應(yīng)的負(fù)性調(diào)節(jié)作用[6]。A20 在多種炎癥性和免疫性疾病中都發(fā)揮著重要的作用[7，8]，但其在免疫及感染性疾病中的作用機(jī)制尚未完全明確。本研究主要探討A20 對脂多糖誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞成熟度及功能的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對象及材料 收集2021 年5 月西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院14 名健康志愿者臨床資料；人淋巴細(xì)胞分離液購自上海生物工程有限公司；Trizol 購自美國Invitrogen 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒與熒光定量PCR 試劑盒均購自日本TaKaRa 公司；GM-CSF 和人重組IL-4 購自美國ACRO Biosystems 公司；CD14+磁珠購自德國Miltenyi 公司；細(xì)胞培養(yǎng)液1640 和胎牛血清購自美國Gibco 公司；腺病毒購自上海漢恒生物科技有限公司；Anti-human CD80、CD86 及HLADR 購自美國eBioscience 公司；LPS 購自美國Sigma公司；人IL-1β、IL-10、IL-27、IL-6 ELISA 檢測試劑盒購自美國R&D Systems 公司。

1.2 方法

1.2.1 DCs 的分離和培養(yǎng) 抽取健康志愿者靜脈血約10 ml，再緩慢加入10 ml 的磷酸緩沖鹽溶液，輕輕將二者混勻，然后將其加入至5 ml 人淋巴細(xì)胞分離液中，在溫度4 ℃，離心力800 g，按升4 降0 的升降速度進(jìn)行離心，離心26 min。離心后用巴氏管將單個核細(xì)胞吸出、洗滌、離心。加入磁珠buffer 和單核細(xì)胞磁珠（CD14+磁珠）。過MS 柱后得到CD14+T 細(xì)胞。按照1×106細(xì)胞/ml 接種到1640 培養(yǎng)基中，并加入人重組GM-CSF（100 ng/ml）和人重組IL-4（50 ng/ml）進(jìn)行DCs 誘導(dǎo)。細(xì)胞培養(yǎng)第6 天時，加入LPS（100 ng/ml）繼續(xù)培養(yǎng)24 h 獲得成熟的DCs 細(xì)胞。

1.2.2 腺病毒感染DCs 人A20 基因干擾（A20-shRNA）腺病毒的制備、包裝、擴(kuò)增和純化由上海漢恒生物科技有限公司完成（A20 基因ID：NM_001270508.1）。上述細(xì)胞培養(yǎng)至第3天，將細(xì)胞分為兩部分，一部分細(xì)胞加入腺病毒載體，培養(yǎng)2 h后換液，而另一部分細(xì)胞為對照，直接換液。48 h后，觀察GFP 綠色熒光的表達(dá)情況并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測DCs 表型 取出培養(yǎng)好的DCs，PBS 洗滌細(xì)胞、離心，加入抗CD80、CD86 及HLA-DR 流式抗體，孵育30 min后，用流式細(xì)胞儀檢測CD80、CD86 及HLA-DR 的表達(dá)情況。

1.2.4 定量RT-PCR 從細(xì)胞中提取總的RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用SYBR Green 進(jìn)行RT-PCR，參照試劑盒配置相應(yīng)的體系進(jìn)行擴(kuò)增，引物由上海生工生物有限公司合成，其中引物序列如下：A20 上游引物：5'-TGGCTGAACAAGTCCTTCCT-3′，下游引物：5'-CTTCAGGGTCACCAAGGGTA-3′；β-actin 上游引物：5'-CGAGAAGATGACCCAGATCATG-3'，下游引物：5' -CAGAGGCGTACAGGGATAGCA -3'。ABI7500 儀器上進(jìn)行RT-PCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μl。用2-△△CT法計算A20 的相對表達(dá)量。

1.2.5 細(xì)胞因子的測定 按照ELISA 的說明檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-1β、IL-6 和IL-27 的水平，所有分析都進(jìn)行3 次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腺病毒轉(zhuǎn)染DCs 情況 熒光顯微鏡下觀察到絕大部分DCs 被攜帶有GFP 熒光基團(tuán)標(biāo)記的腺病毒轉(zhuǎn)染，呈綠色熒光表達(dá)，見圖1。

圖1 帶GFP 熒光基團(tuán)標(biāo)記的腺病毒轉(zhuǎn)染DCs（×200）

2.2 腺病毒轉(zhuǎn)染DCs 后A20 的表達(dá)水平 攜帶有A20-shRNA 腺病毒轉(zhuǎn)染DCs后，定量RT-PCR 檢測顯示，轉(zhuǎn)染A20-shRNA 腺病毒的樹突狀細(xì)胞A20的表達(dá)低于未轉(zhuǎn)染腺病毒的樹突狀細(xì)胞（P＜0.05），見圖2。

圖2 腺病毒轉(zhuǎn)染DCs 后A20 的表達(dá)情況

2.3 沉默A20 后對DCs 成熟度的影響 沉默A20后，DCs 細(xì)胞表面的成熟標(biāo)記分子CD80、CD86 和HLA-DR 的表達(dá)水平?jīng)]有變化，見圖3。

圖3 沉默A20 后對DCs 成熟度的影響

2.4 A20 對DCs 分泌細(xì)胞因子的影響 LPS 刺激DCs后，通過ELISA 檢測DCs 分泌細(xì)胞因子的水平，結(jié)果顯示沉默A20 的DCs 分泌IL-1β 和IL-6的水平增加（P＜0.05），而IL-27 的水平降低（P＜0.05），見圖4。

圖4 A20 對DCs 分泌細(xì)胞因子的影響

3 討論

A20 是TNF-α 與臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)的一種誘導(dǎo)性表達(dá)蛋白，因此也被稱為TNF-α 誘導(dǎo)蛋白（3TNFAIP3）。A20 通過減弱NF-κB 信號通道，發(fā)揮對天然免疫反應(yīng)的負(fù)性調(diào)節(jié)作用[9]。DCs 是目前已知的最強(qiáng)大的抗原呈遞細(xì)胞，它除了能夠激活T細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答，還可以對體內(nèi)和體外的各種刺激做出應(yīng)答誘發(fā)免疫耐受。研究發(fā)現(xiàn)[10，11]，A20 在SLE、干燥綜合征等免疫性疾病中均發(fā)揮著重要的作用。另外，研究發(fā)現(xiàn)[12]，在嚙齒動物和非人靈長類動物的移植模型中，DCs 在同種異體免疫反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)中的具有核心作用。DCs 除了在自身免疫性疾病中發(fā)揮作用，在抗腫瘤免疫反應(yīng)中也起著關(guān)鍵作用。DCs 通過分泌IFN-λ，從而提高IL-12p70、IFN-γ和細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞募集趨化因子的水平，促進(jìn)TH1 微環(huán)境，最終在抗腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，而且IFN-λ 及其受體在乳腺腫瘤中與患者預(yù)后情況密切相關(guān)[13]。然而，對于DCs 在各種感染性疾病和免疫性疾病中的具體機(jī)制仍未明確。

A20 存在于多個免疫器官如脾臟、胸腺和腸相關(guān)免疫組織等，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A20 在DCs 中也有表達(dá)，因A20 沒有相應(yīng)的抑制劑或激動劑，為了研究A20 對DCs 成熟度及功能的研究，本研究將包裝好的人A20-shRNA 腺病毒轉(zhuǎn)染DCs，最終使DCs中A20 低表達(dá)，這也為后面研究A20 對DCs 的影響打下了基礎(chǔ)。DCs 有未成熟和成熟兩種類型，二者之間有明顯的差別，未成熟的DCs 具有較高的吞噬功能，抗原呈遞較弱，免疫刺激較弱[14]。成熟的DCs 表達(dá)高水平的MHC-Ⅰ類和MHC-Ⅱ類分子，具有強(qiáng)大的抗原遞呈能力。既往有文獻(xiàn)報道[15]，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等許多免疫性疾病中，DCs通過增加其成熟度發(fā)揮作用。為了證實(shí)A20 是否對DCs 成熟度有影響，本研究沉默A20，檢測DCs 成熟表面細(xì)胞因子CD80、CD86 及HLA-DR 的表達(dá)，結(jié)果表明沉默A20 對DCs 的成熟度無明顯影響，這也說明A20 對DCs 的作用與其他因子是不同的。研究報道[16]，miR-21 在腎缺血再灌注損傷中能夠增強(qiáng)DCs 的成熟，減輕腎臟缺血再灌注誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和急性腎損傷。而在Johnson DJ等[17]報道中表明，A20 對DCs 成熟度是沒有影響，考慮造成這種差異的原因可能是A20 是一種重組蛋白，而microRNA 是一種小RNA。

成熟DCs 作為主要抗原提呈細(xì)胞，根據(jù)刺激分泌不同的細(xì)胞因子，并通過Th1 或Th2 途徑使Naive T 細(xì)胞分化，從而造成炎癥或免疫抑制的環(huán)境。例如，DCs 分泌的IL-12 可以誘導(dǎo)Th1 分化，分泌的IL-6 和IL-1β 等細(xì)胞因子促進(jìn)免疫炎癥環(huán)境。本研究通過沉默A20，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DCs 分泌IL-1β 和IL-6 的水平增加，而IL-27 的水平降低。Javan MR等[18]使用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法發(fā)現(xiàn)，A20 能夠?qū)е翫Cs 分泌IL-10 和TGF-β 細(xì)胞因子的水平升高。另有研究報道[19]，A20 能夠通過NF-κB 和STAT1 信號途徑調(diào)控DCs 分泌TNF-α 和IL-6。由此可以發(fā)現(xiàn)，A20 對DCs 的作用主要是引起DCs 分泌不同的細(xì)胞因子。

綜上所述，A20 可抑制脂多糖誘導(dǎo)的人樹突狀細(xì)胞的免疫功能，其機(jī)制可能與其影響DCs 的分泌功能相關(guān)。