基于生物信息學(xué)分析擴(kuò)張型心肌病發(fā)病機(jī)制中潛在的自噬關(guān)鍵基因

倪勝南，陳一鳴

（江蘇省泗陽康達(dá)醫(yī)院檢驗科，江蘇 泗陽 223700）

擴(kuò)張型心肌病（dilated cardiomyopathy，DCM）是臨床上較為常見的心肌病，其是一種以左心室或雙心室收縮功能障礙為特征的原發(fā)性心肌疾病，通常與心臟舒張功能密切相關(guān)[1]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)[2]，DCM 在成人中的患病率約為1/2500，是導(dǎo)致心力衰竭的常見原因，并且其患病率存在明顯的年齡和地域差異。據(jù)報道[3]，DCM 患者隨訪52 個月的死亡率為42.24%。DCM 的發(fā)病機(jī)制包括導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能異常的基因突變、導(dǎo)致肌肉收縮力產(chǎn)生和傳遞缺陷的錯誤信號通路[4，5]。除此之外，血流動力學(xué)超負(fù)荷增加、心室肌重塑、過度神經(jīng)體液刺激、肌細(xì)胞鈣循環(huán)異常、心肌能量不足和炎癥反應(yīng)也會導(dǎo)致DCM[6]。但有研究認(rèn)為[7，8]，DCM 是一種家族性遺傳傾向疾病，與遺傳密切相關(guān)，對患者親屬進(jìn)行相關(guān)基因檢測，有利于潛在的DCM 患者識別。然而，目前DCM 的發(fā)病機(jī)制仍不明確，但較多的研究證據(jù)表明DCM 的致病涉及多種生理過程，包括凋亡、壞死和自噬等[9，10]，而在這些生物學(xué)過程中，自噬在DCM 的致病過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。雖然研究發(fā)現(xiàn)DCM 致病與自噬有相關(guān)性，但其具體的作用機(jī)制仍尚不明確?；诖耍狙芯坷蒙镄畔W(xué)方法，通過分析來自GEO 數(shù)據(jù)庫中的GSE3586 數(shù)據(jù)集，探索DCM 自噬相關(guān)基因的差異表達(dá)，對差異性表達(dá)的自噬相關(guān)基因利用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）、相關(guān)分析、基因本體（GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，從基因轉(zhuǎn)錄的層面分析自噬與DCM 的致病關(guān)系，為DCM 的治療及理論研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 自噬相關(guān)基因數(shù)據(jù)集和微陣列數(shù)據(jù) 通過人類自噬數(shù)據(jù)庫（http://www.autophagy.lu/index.html）檢索獲得67 個自噬基因。從GEO（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數(shù)據(jù)庫下載GSE3586 數(shù)據(jù)集中樣本為室間隔的mRNA 表達(dá)譜數(shù)據(jù)，其中包含13 個DCM室間隔樣本和15 個正常人群室間隔樣本。

1.2 自噬相關(guān)基因的差異表達(dá)分析 利用R 語言通過GEOquery 包從GEO 數(shù)據(jù)庫中下載GSE3586 數(shù)據(jù)，同時去除掉一個探針對應(yīng)多個分子的探針，當(dāng)遇到對應(yīng)同一個分子的探針時，僅保留信號值最大的探針。過濾后的數(shù)據(jù)將使用R 語言“sva”包的Com－Bat 函數(shù)去除批間差。然后，通過PCA 圖查看樣本分組間聚類情況，接著利用“l(fā)imma”包進(jìn)行兩組的差異分析，用于識別自噬相關(guān)差異基因。P值＜0.05 和絕對倍數(shù)變化值＞0.25 的基因被認(rèn)為是差異表達(dá)的基因。利用R 軟件的“heatmap”和“ggplot2”包繪制熱圖、火山圖和箱線圖。

1.3 自噬相關(guān)差異基因的PPI 分析和相關(guān)分析 將自噬相關(guān)差異基因上傳到STRING 數(shù)據(jù)庫（http://string-db.org）構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，并通過R 語言“igraph”包、“ggraph”包對自噬相關(guān)差異基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析。差異表達(dá)的自噬相關(guān)基因的相關(guān)性通過“ggraph”包進(jìn)行Spearman 相關(guān)性分析。

1.4 自噬相關(guān)差異基因的GO 和KEGG 通路富集分析 利用R 軟件中的“ggplot2”包、“clusterProfiler”包、“GOplot”包、“org.Hs.eg.db”包對自噬相關(guān)差異基因進(jìn)行GO 和KEGG 通路富集分析，并繪制相關(guān)氣泡圖、柱狀圖、弦圖等，其中包括生物過程（BP）、細(xì)胞成分（CC）、分子功能（MF）。

2 結(jié)果

2.1 DCM 自噬相關(guān)差異表達(dá)基因的分析 通過主成分分析（PCA）對數(shù)據(jù)集GSE3586 中組內(nèi)數(shù)據(jù)重復(fù)性進(jìn)行分析，結(jié)果表明數(shù)據(jù)集中的數(shù)據(jù)重復(fù)性良好，見圖1A。從以上數(shù)據(jù)集中共檢索得到15 494 個與DCM 相關(guān)的基因并與人類自噬數(shù)據(jù)庫檢索得到的67 個自噬基因可視化繪制韋恩圖，見圖1B。對兩者的155 個交集基因以|LogFC|＞0.25和P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)分析篩選得到21 個DCM 自噬相關(guān)表達(dá)差異基因，其中15 個上調(diào)基因和6 個下調(diào)基因。用R 軟件對GSE3586 數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，同時以火山圖和熱圖的形式對DCM 組和對照組之間DCM 自噬相關(guān)差異表達(dá)的21 個基因進(jìn)行可視化展示，見圖1C 和圖1D。此外，通過箱線圖對DCM 組和正常樣本之間自噬相關(guān)表達(dá)差異的21 個基因進(jìn)行顯示，見圖2。

圖1 DCM 和對照組差異表達(dá)的自噬相關(guān)基因

圖2 DCM 和正常樣本中21 個差異表達(dá)的自噬相關(guān)基因的箱線圖

2.2 DCM 自噬相關(guān)差異表達(dá)基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)及相關(guān)性分析 通過PPI 網(wǎng)絡(luò)分析確定DCM 差異表達(dá)的自噬相關(guān)基因之間的相互作用，結(jié)果表明DCM自噬相關(guān)差異表達(dá)基因之間存在相互作用，見圖3A，并且對每個差異基因的相互作用數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計，其中21 個自噬相關(guān)蛋白中HSPA8 和BCL2L1與其他蛋白的相互作用最強(qiáng)，有10 個節(jié)點，見圖3B。通過Spearman 相關(guān)性分析探索DCM 自噬相關(guān)差異表達(dá)基因的相關(guān)性，結(jié)果顯示GSE3586 數(shù)據(jù)集中21 個DCM 自噬相關(guān)差異表達(dá)基因之間的相互關(guān)系，見圖4。

圖3 21 個差異表達(dá)的自噬相關(guān)基因PPI 網(wǎng)絡(luò)及分析

圖4 29 個差異表達(dá)的DCM 自噬相關(guān)基因的Spearman 相關(guān)分析

2.3 DCM 自噬相關(guān)差異表達(dá)基因的GO 和KEGG 富集分析 GO 和KEGG 富集分析DCM 自噬相關(guān)差異表達(dá)基因的潛在生物學(xué)功能，GO 富集分析表明，細(xì)胞自噬通過自噬、利用自噬機(jī)制的過程、對表皮生長因子的反應(yīng)和細(xì)胞對細(xì)胞外刺激的反應(yīng)參與DCM的生物過程，通過自噬體、偽足、伴侶復(fù)合體和膜筏的過程參與細(xì)胞組成成分，同時通過泛素蛋白連接酶結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、β-微管蛋白結(jié)合和分子適配器活性參與分子功能，見圖5。KEGG 通路富集分析顯示，DCM 自噬相關(guān)差異基因主要通過參與自噬、凋亡和內(nèi)分泌抵抗等通路參與DCM 的致病過程，見圖6、表1。

表1 KEGG 通路分析表格

圖5 21 個差異表達(dá)的自噬相關(guān)基因的GO 富集分析

圖6 21 個差異表達(dá)的自噬相關(guān)基因KEGG 通路分析

3 討論

DCM 的致病機(jī)制研究主要涉及遺傳、基因突變、血流動力學(xué)異常、心肌重塑、神經(jīng)體液調(diào)節(jié)、心肌能量代謝異常、炎癥及感染、凋亡、自噬等各個方面[11]。自噬是真核生物中生物分子和受損細(xì)胞器降解和循環(huán)的一個高度進(jìn)化和高度保守的過程[12]，廣泛涉及病理生理過程，與癌癥以及心血管、神經(jīng)退行性、代謝、肺、腎臟、感染性、肌肉骨骼和眼部疾病等密切相關(guān)[13，14]。

本研究通過生物信息學(xué)工具分析得到21 個DCM 致病基因與自噬密切相關(guān)。Raf1 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[15]，本研究發(fā)現(xiàn)RAF 是擴(kuò)張型心肌病自噬過程中的重要靶基因。Li S等[16]研究發(fā)現(xiàn)，RAF 可以通過Raf1-ERK-Smad 通路促進(jìn)纖維化。IL1B 和TNF 等炎癥因子能促進(jìn)RAF1 蛋白的表達(dá)，過表達(dá)RAF1 反之通過RAF1-MAPK1-NF-B信號通路誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)的表達(dá)和分泌[17]。此外，研究發(fā)現(xiàn)[18]，MAPK1 可以通過mTOR 信號通路參與細(xì)胞自噬。本研究根據(jù)PPI 發(fā)現(xiàn)，RAF1 與MAPK1 存在相互作用關(guān)系，RAF1-ERK/MAPK1-mTOR 信號通路可能是DCM 自噬的潛在信號通路。

蛋白激酶（DAPK）2 是一種鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)蛋白激酶，其與程序性細(xì)胞死亡、自噬調(diào)節(jié)和多種發(fā)育過程有關(guān)。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，DAPK2 是DCM 的核心靶基因之一。Shiloh R等[19]研究發(fā)現(xiàn)，APMK 通過磷酸化激活DAPK2，被AMPK 磷酸化激活后可以磷酸化Beclin-1，從而促進(jìn)自噬。細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載可以直接調(diào)節(jié)DAPK2 與mTORC1 相互作用并使mTOR 磷酸化，磷酸化激活的mTOR 可以通過自噬、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡發(fā)揮作用[20]。而當(dāng)DAMK2去磷酸化后，可由Ca2+/CaM 信號通路抑制細(xì)胞自噬[21]。因此，DAPK2-Ca/CaM-mTOR 信號通路在DCM 病程中發(fā)揮著重要作用。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)BECN1 也是DCM 自噬相關(guān)核心基因。BECN1/Beclin1 是一種中心蛋白，它參與組裝形成BECN1-PIK3C3-PIK3R4 復(fù)合物輔助因子以觸發(fā)自噬蛋白級聯(lián)反應(yīng)，TRIM59-NFKB/TRAF6-BECN1-PIK3C3-PIK3R4 復(fù)合物通過觸發(fā)自噬蛋白級聯(lián)反應(yīng)調(diào)節(jié)自噬，TRIM59 通過負(fù)向調(diào)節(jié)NF-κB通路來調(diào)節(jié)BECN1 的轉(zhuǎn)錄。另一方面，TRIM59 調(diào)節(jié)TRAF6 誘導(dǎo)的K63 連接的BECN1 泛素化，從而影響B(tài)ECN1-PIK3C3 復(fù)合物的形成[22，23]。另有研究發(fā)現(xiàn)[24]，炎癥因子IL-6 也可通過JAK2/BECN1/PI3KC3復(fù)合物軸誘導(dǎo)激活BECN 誘導(dǎo)自噬。因此，IL-6 和NF-κB/TRAF6 通過BECN1-PIK3C3-PIK3R4 復(fù)合物信號通路在DCM 的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮作用。

PI3K-AKT-mTOR 信號通路是自噬的經(jīng)典通路，Tong X等[25]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OS 的持續(xù)激活通過PI3K-AKT 信號通路激活自噬，同時FOS 的過表達(dá)可以直接激活BECN1/Beclin1 誘導(dǎo)自噬，本研究也得到相同結(jié)果，分析認(rèn)為是FOS 可能通過PI3K-AKT-BECN1/Beclin1 信號通路在DCM 中發(fā)揮作用。

HSPA8 和HSPB8 主要參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的維持，兩者在自噬中發(fā)揮著重要作用。HSPA8 和HSPB8 與BAG3、STUB1/CHIP 蛋白一起形成伴侶輔助選擇性自噬（CASA）復(fù)合物，CASA 復(fù)合物能夠識別并結(jié)合錯誤折疊的蛋白質(zhì)，并將它們沿著微管驅(qū)動到微管組織中心（MTOC），以便插入自噬體并隨后被溶酶體降解[26]。Qiang L等[27]研究發(fā)現(xiàn)，CCL2 轉(zhuǎn)錄需要依賴于AMPK-BRAF-MAPK1/3/ERK-激活蛋白1（AP1）通路，而該通路與自噬密切相關(guān)。此外，GABARAP 通過正向調(diào)節(jié)ULK1 活性以及吞噬細(xì)胞和自噬體的形成參與自噬過程[28]。而TP53INP2 可以通過促進(jìn)與LC3B-ATG7 相互作用，進(jìn)一步在自噬體生物過程中發(fā)揮作用[29]。Mavrakis M等[30]研究發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶A（PRKAR1A）的調(diào)節(jié)亞基在自噬體成熟過程中發(fā)揮著重要作用。而VAMP3 與自噬小體在被識別和被吞噬密切相關(guān)[31]。Yamano K等[32]研究發(fā)現(xiàn)，EIF4G1 通過調(diào)節(jié)mTOR 的表達(dá)和磷酸化發(fā)揮自噬作用，而RA1CC1 通過CALCOCO2-RB1CC1-PRKN 介導(dǎo)的線粒體發(fā)揮自噬作用。此外，RB1CC1介導(dǎo)的自噬可以激活成纖維細(xì)胞，而抑制RB1CC1后在減輕自噬的同時可以起到抗纖維化的作用[33]。同時，Li F等[34]研究發(fā)現(xiàn)，ErbB2-AKT-FoxO3a 軸下調(diào)自噬后可以減輕細(xì)胞凋亡。因此，上述靶基因通過自噬小體的形成、成熟、識別降解過程在DCM 中發(fā)揮作用。

綜上所述，自噬通過多靶點、多通路在DCM 疾病發(fā)生及進(jìn)展中發(fā)揮作用。