不同民族前列腺癌患者癌組織miRNA 表達(dá)差異研究

王文光，王玉杰，劉強(qiáng)，馬軍，李前進(jìn)，木拉提·熱夏提，阿斯木江·阿不拉

（新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，新疆 烏魯木齊 830054）

前列腺癌（prostate cancer）已成為男性最常見的惡性腫瘤，居男性常見腫瘤第2位，僅次于肺癌。目前主要通過血清前列腺特異性抗原（PSA）的篩查來進(jìn)行疾病的診斷與預(yù)后判斷[1]。但由于PSA 水平容易受到炎癥水平、良性前列腺增生等因素的影響，存在特異性及敏感性不高的問題。因此，尋找侵入性更低、特異性及靈敏度更高的前列腺癌診斷標(biāo)志物成為研究人員關(guān)注的熱點(diǎn)。已有文獻(xiàn)報(bào)道[2-5]，miRNA 能通過調(diào)控多種靶基因及其信號通路調(diào)控前列腺癌發(fā)生與發(fā)展。近年來有研究發(fā)現(xiàn)[6，7]，miRNA 在乳腺癌、結(jié)腸癌等腫瘤患者中表達(dá)存在一定差異，而這種差異可能與不同民族癌癥的發(fā)病率及死亡率有一定相關(guān)性。本研究采用高通量技術(shù)對漢族、維吾爾族及哈薩克族前列腺癌患者及漢族前列腺增生患者進(jìn)行全面的miRNA 表達(dá)譜分析及驗(yàn)證，以獲得與民族相關(guān)的差異miRNA 表達(dá)譜，為該疾病在不同民族發(fā)病差異研究方面提供新的線索，同時(shí)驗(yàn)證其作為前列腺癌診斷標(biāo)志物的潛在價(jià)值，為下一步篩選疾病特異的診斷標(biāo)志物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 選取2020 年10 月-2021 年8 月新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的病理確診為前列腺腺癌患者39 例及前列腺增生患者18 例。將前列腺癌患者依據(jù)民族分為漢族18 例、維吾爾族18 例、哈薩克族3例，并分別設(shè)為漢族前列腺癌組（HANC）、維吾爾族前列腺癌組（WEIC）、哈薩克族前列腺癌組（HAC），而漢族前列腺增生患者設(shè)為漢族前列腺增生組（HANN）。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理確診為前列腺癌的初治患者；穿刺病理結(jié)果顯示13 針均為陽性患者；HANN 組為穿刺病理確診的良性前列腺增生患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：有其他部位腫瘤病史。

1.3 方法 收集前列腺癌患者穿刺標(biāo)本，置BD 凍存管中，液氮快速冷凍后，-80 ℃冰箱保存待測。根據(jù)納入及排除標(biāo)準(zhǔn)挑選符合要求的組織標(biāo)本。

1.3.1 RNA 的提取 總RNA 提取及文庫構(gòu)建由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成。取前列腺癌患者標(biāo)本漢族3 例、維吾爾族3 例、哈薩克族3 例及漢族前列腺增生標(biāo)本3 例。在液氮中分別將樣品研磨后，加1.5 ml TRIzol 裂解液，組織研磨后使組織細(xì)胞充分裂解，離心取上清液，抽提純化樣品的總RNA。采用Nanodrop 儀器（賽默飛，美國）定量，檢測A260/A280 的總RNA 純度。瓊脂糖凝膠電泳檢測，初步檢測完整性。經(jīng)Agilent 2100 Bioanalyzer（安捷倫科技，美國）檢測合格的RNA 樣本用于后續(xù)高通量miRNA 測序。

1.3.2 miRNA 文庫構(gòu)建及測序 用NEBNextSmall RNA Library Prep Set for Illumina（NEB，美國）構(gòu)建文庫：加入3′SR Adaptor for Illumina，70 ℃反應(yīng)2 min，迅速置冰上；加入3′Ligation Reaction Buffer（2×）和3′Ligation Enzyme Mix 進(jìn)行3′SR Adaptor 連接，反應(yīng)程序：25 ℃60 min；隨后加入SR RT Primer for Illumina 雜交逆轉(zhuǎn)錄引物，75 ℃5 min、37 ℃15 min、25 ℃15 min；加入5′SR Adaptor for Illumina（denatured）、5′Ligation Reaction Buffer（10×）和5′Ligation Enzyme Mix 連接5′SR Adaptor，25 ℃反應(yīng)60 min；加入First Strand Synthesis Reaction Buffer、Murine RNase Inhibiton 和ProtoScript II Reverse Transcriptase 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；隨后加入LongAmp Taq 2× Master Mix 進(jìn)行12～15 輪的PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為SR Primer for Illumina 和Index Primer，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性30 s、94 ℃變性15 s、62 ℃退火30 s、70 ℃延伸15 s；配制6%聚丙烯酰胺凝膠，150 V 電泳60 min，回收約147 bp 大小的文庫。文庫構(gòu)建完成后，用Qubit 定量和High-sensitivity DNA chip 檢測，確保文庫質(zhì)量。取約10 ng 的文庫，在NovaSeq S4 PE150 中進(jìn)行測序。

1.3.3 數(shù)據(jù)過濾及注釋 首先去掉原始reads 中的接頭序列，并進(jìn)行序列的長度過濾，去掉序列長度小于17 bp，以及序列長度大于35 bp 的序列。對序列進(jìn)行Q20 質(zhì)控，保留Q20 達(dá)到80%及以上的序列，最終得到高質(zhì)量的clean reads 并用于后續(xù)分析。對clean reads 的長度分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以初步評估樣本的小RNA 分布情況。根據(jù)參考基因組序列，將clean reads 比對到基因組，統(tǒng)計(jì)reads 比對到基因組的百分比。使用blastn 軟件，注釋出rRNA、snRNA、snoRNA、tRNA 等序列。最終將這些注釋到Rfam 數(shù)據(jù)庫的序列進(jìn)行過濾去除，并將能比對上轉(zhuǎn)錄本的序列且長度在小于17 bp 大于35 bp 的reads 進(jìn)行去除。接下來，將過濾后的序列同repeat 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，鑒定可能的重復(fù)序列。針對鑒定出的重復(fù)序列進(jìn)行過濾去除，并用于后續(xù)新的miRNA 預(yù)測分析。

1.3.4 生物信息學(xué)分析 ①miRNA 差異表達(dá)分析：根據(jù)鑒定的已知的成熟體miRNA 以及新預(yù)測的miRNA 的序列進(jìn)行表達(dá)量統(tǒng)計(jì)，miRNA 表達(dá)量計(jì)算采用TPM 計(jì)算度量指標(biāo)。采用DESeq 差異算法計(jì)算P值，并篩選出P值小于0.05 的miRNA；②差異miRNA 功能分析：針對差異的已知miRNA 以及新預(yù)測的miRNA，使用Target-Scan、miRDB 以及Miranda 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行差異miRNA 的靶基因預(yù)測。靶基因的KEGG 和GO 分析使用超幾何分布檢驗(yàn)進(jìn)行富集分析，P值經(jīng)Benjamini&Hochberg 多重檢驗(yàn)糾正后得到FDR，運(yùn)行環(huán)境為R。

1.4 候選差異miRNA 的驗(yàn)證 取漢族、維吾爾族前列腺癌組織和漢族前列腺增生標(biāo)本各15例，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)檢測差異表達(dá)的miRNA 的相對表達(dá)量，驗(yàn)證上述高通量測序的結(jié)果。根據(jù)高通量測序結(jié)果，篩選5 個(gè)在不同民族間及前列腺癌與前列腺增生中都有顯著差異的miRNA 進(jìn)行驗(yàn)證。

提取總RNA，使用miRNA 第一鏈cDNA 合成（加尾法）試劑盒（B532451，上海生工）獲得cDNA。取8 μl 的cDNA 為模板，采用miRNA 熒光定量PCR 試劑盒（染料法）試劑盒（B532461，上海生工）在ABI7500 擴(kuò)增儀（美國ABI 公司）上進(jìn)行擴(kuò)增，5 條miRNA 特異性引物由上海生工生物公司完成設(shè)計(jì)與合成，引物序列見表1。擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性30 s、95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s，40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)置3 個(gè)技術(shù)重復(fù)，取平均值。應(yīng)用相對定量分析方法（2-ΔΔCt）計(jì)算各組樣本中目的miRNA的相對表達(dá)量。以每組每個(gè)樣本中U6 的表達(dá)量為參照，計(jì)算各組miRNA 的相對表達(dá)量。

表1 熒光定量miRNA 檢測引物信息表

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用（）表示，采用單因素方差檢驗(yàn)分析，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 為探討不同民族前列腺癌患者癌組織中miRNA 的表達(dá)差異，選擇漢族、維吾爾族、哈薩克族3 個(gè)民族，每組3例，進(jìn)行組織miRNA 高通量測序。同時(shí)，為了對比前列腺癌組織與良性病變組織中miRNA 的表達(dá)差異，選擇漢族前列腺癌以及前列腺增生患者，每組3例，進(jìn)行組織miRNA 高通量測序。通過高通量測序，漢族前列腺癌組（HANC）、維吾爾族前列腺癌組（WEIC）、哈薩克族前列腺癌組（HAC）、漢族前列腺增生組（HANN）各組平均分別獲得18 490 709 條、14 440 655 條、17 192 254 條、17 069 016 條原始測序序列，經(jīng)過對測序片段堿基的質(zhì)量檢驗(yàn)和長度篩選，各組獲得干凈序列分別為15 814 065 條、13 418 490 條、16 318 109 條、16 399 958條，各組小RNA 文庫測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)見表2。同時(shí)，這些序列的長度均勻分布在18～24 個(gè)核苷酸上。

表2 各組小RNA 文庫測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.2 差異miRNA 表達(dá)分析 利用DESeq 軟件包中的負(fù)二項(xiàng)分布檢驗(yàn)計(jì)算基因差異表達(dá)量。采用NB（負(fù)二項(xiàng)分布檢驗(yàn)的方式）對reads 數(shù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，basemean 值來估算miRNA 表達(dá)量，篩選出P值小于0.05 且倍數(shù)變化2 倍以上的miRNA。篩選的差異表達(dá)miRNA 統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3，其中WEIC 組較HAC 組上調(diào)4 個(gè)miRNA，下調(diào)8 個(gè)miRNA；WEIC組較HANC 組上調(diào)15 個(gè)miRNA，下調(diào)21 個(gè)miRNA；HAC 組較HANC 組上調(diào)20 個(gè)miRNA，下調(diào)16 個(gè)miRNA；HANC 組較HANN 組上調(diào)69個(gè)miRNA，下調(diào)76 個(gè)miRNA。

表3 各組差異表達(dá)miRNA 統(tǒng)計(jì)

2.3 差異miRNA 靶基因預(yù)測及靶基因功能分析 針對差異表達(dá)分析得到的miRNA，利用Target-Scan、miRDB 以及miRanda 軟件對本實(shí)驗(yàn)中差異表達(dá)顯著的miRNA 進(jìn)行靶基因預(yù)測，預(yù)測結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的篩選及整理，最終使用預(yù)測到的靶基因進(jìn)行GO基因功能富集分析及KEGG 信號通路富集分析。GO總共有3類，分為生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能，對差異miRNA 的靶基因進(jìn)行顯著性富集分析見圖1，KEGG 富集分析結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，不同民族間前列腺癌患者癌組織差異miRNA 靶基因富集的通路有一定相似性，均富集到了細(xì)胞周期、前列腺癌、病毒致癌作用、癌癥相關(guān)miRNA 及糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路。此外，黏著斑以及粘附連接通路富集度也較高。相比之下，HANC 組較HANN 組有大量靶基因顯著富集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工、內(nèi)吞作用以及RNA 運(yùn)輸?shù)刃盘柾罚床煌褡迩傲邢侔┙M織之間miRNA 靶基因涉及的通路存在一定的相似性，而前列腺癌與增生組織間則存在更大的異質(zhì)性。

圖1 各組差異miRNA 靶基因GO 富集分析TOP10 條目圖

圖1 各組差異miRNA 靶基因GO 富集分析TOP10 條目圖（續(xù)）

圖2 各組差異miRNA 靶基因KEGG 富集分析TOP20 氣泡圖

2.4 差異miRNA 的表達(dá)驗(yàn)證 根據(jù)miRNA 測序結(jié)果，按照P＜0.05，F(xiàn)C（差異倍數(shù)）＞2 篩選在不同民族之間表達(dá)有差異且在HANC 組與HANN 組表達(dá)有差異的5 個(gè)miRNA 進(jìn)行擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證，驗(yàn)證基因分別是hsa-miR-1973、hsa-miR-339-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-4485-3p 和hsa-miR-619-5p。

RT-PCR 驗(yàn)證結(jié)果顯示，與HANN 組比較，HANC 組和WEIC 組中hsa-miR-1973、hsa-miR-4485-3p 和hsa-miR-619-5p 表達(dá)水平上調(diào)，且各組hsa-miR-4485-3p 和hsa-miR-619-5p 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而HANC 組和WEIC 組中hsa-miR-339-3p 和hsa-miR-423-5p 表達(dá)水平下調(diào)，各組hsa-miR-339-3p 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；通過對比不同民族miRNA 表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，與HANC 組比較，WEIC 組中hsa-miR-1973、hsa-miR-4485-3p 和hsa-miR-619-5p 表達(dá)水平下調(diào)，hsa-miR-339-3p 和hsa-miR-423-5p 表達(dá)水平則上調(diào)。但兩民族間各個(gè)miRNA 表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。另外，miRNA 在各組組織中的表達(dá)趨勢與高通量測序趨勢一致，說明高通量測序結(jié)果是可靠的，見圖3、表4。

圖3 各組前列腺組織各基因表達(dá)柱狀圖

表4 各組miRNA 表達(dá)分析（）

表4 各組miRNA 表達(dá)分析（）

注：與HANN 組比較，△P＜0.05

3 討論

大量研究表明[8，9]，miRNA 通過調(diào)控其靶mRNA，參與增殖、凋亡、細(xì)胞遷移、壞死及個(gè)體發(fā)育等很多重要的病理和生理過程。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，miRNA 往往作為促癌或抑癌因子發(fā)揮重要作用，異常表達(dá)的miRNA 影響癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、分化及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）等[10]。研究發(fā)現(xiàn)[11]，miR-21 一方面通過靶向PTEN 調(diào)控PI3K/Akt/mTOR 通路參與前列腺癌細(xì)胞生長及血管生成，另一方面調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin 通路影響細(xì)胞周期，對前列腺癌的發(fā)生具有重要調(diào)控作用。Huang S等[12]研究發(fā)現(xiàn)，miR-141-3p 與前列腺癌骨轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其過表達(dá)可以抑制NF-κB 信號通路的激活，進(jìn)而抑制前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移。

本研究采用高通量測序技術(shù)對漢族、維吾爾族、哈薩克族3 個(gè)不同民族前列腺癌患者間miRNA 表達(dá)譜進(jìn)行了研究，測序結(jié)果顯示W(wǎng)EIC 組較HAC 組相比，有12 個(gè)差異表達(dá)的miRNA；WEIC 組較HANC 組相比，有36 個(gè)差異表達(dá)的miRNA；HAC 組較HANC 組相比，有36 個(gè)差異表達(dá)的miRNA。同時(shí)，HANC 組較HANN 組相比，共篩選到145 個(gè)差異表達(dá)的miRNA。對各組差異miRNA 的靶基因進(jìn)行預(yù)測，隨后進(jìn)行GO 及KEGG 基因功能富集分析發(fā)現(xiàn)，不同民族間前列腺癌差異表達(dá)的miRNA 雖然各有不同，但其靶基因富集的通路有一定相似性，均富集到了細(xì)胞周期、前列腺癌、病毒致癌作用、癌癥相關(guān)miRNA 及糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路。此外，黏著斑以及粘附連接通路富集度也較高。相比之下，HANC 組較HANN 組的靶基因顯著富集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工、內(nèi)吞作用以及RNA 運(yùn)輸?shù)刃盘柾?，可以看出前列腺癌與增生組織間則存在更大的異質(zhì)性。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證測序的結(jié)果，更深入地研究miRNA 表達(dá)在不同民族間的異質(zhì)性。通過對高通量測序各組間表達(dá)量豐度高、差異倍數(shù)較高且差異顯著的miRNA 進(jìn)行篩選，結(jié)合文獻(xiàn)研究情況，最終選擇了5 個(gè)候選miRNA。按照與miRNA 高通量測序相同的入選標(biāo)準(zhǔn)，擴(kuò)大樣本量進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示前列腺癌組織中hsa-miR-1973、hsa-miR-4485-3p和hsa-miR-619-5p 表達(dá)水平較高，hsa-miR-339-3p 和hsa-miR-423-5p 表達(dá)水平較低，且各組hsamiR-4485-3p、hsa-miR-619-5p 和hsa-miR-339-3p比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。目前，已有研究報(bào)道了hsa-miR-619-5p 和hsa-miR-339-3p 與前列腺癌疾病的相關(guān)性，如Knyazev EN等[13]分析了前列腺癌和良性增生患者外周血循環(huán)miRNA 表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)前列腺癌患者中hsa-miR-619-5p 的表達(dá)顯著升高；Medina-Villaamil V等[14]通過miRNA 芯片分析局限性前列腺癌患者和健康人群血液循環(huán)中的miRNA，共獲得了10 個(gè)表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的候選miRNAs，而hsa-miR-339-3p 是其中之一，且該研究通過對比活檢后不同危險(xiǎn)等級患者血液miRNA 差異發(fā)現(xiàn)hsa-miR-339-3p 在高風(fēng)險(xiǎn)人群中表達(dá)更高，可作為識別前列腺癌高危人群的生物標(biāo)志物?？梢钥闯?，hsa-miR-619-5p 和hsa-miR-339-3p 均有望作為前列腺癌與前列腺增生患者鑒別診斷的標(biāo)志物。

另外，hsa-miR-1973、hsa-miR-4485-3p 和hsa-miR-423-5p 在前期前列腺癌的研究報(bào)道較少，但在其他類型腫瘤中已有研究。有研究表明[15，16]，hsa-miR-423-5p 能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的自噬，可能被認(rèn)為是一種潛在的癌癥生物標(biāo)志物。Sun X等[17]研究發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-423-5p 在乳腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，并通過體內(nèi)外研究明確了LncRNA LINC00968/hsa-miR-423-5p/PROX1 信號軸的相互調(diào)控作用可以影響乳腺癌的增殖、遷移以及血管形成等生物學(xué)過程。另有研究發(fā)現(xiàn)[18]，hsa-miR-4485-3p 在CD133+骨肉瘤干細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于CD133-細(xì)胞，提示其可能參與骨肉瘤的疾病進(jìn)展。但hsa-miR-4485-3p和hsa-miR-423-5p 在相關(guān)癌癥中的確切機(jī)制尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。既往研究顯示[19，20]，hsa-miR-1973在包括乳腺癌和早期結(jié)腸癌在內(nèi)的多種腫瘤疾病中表達(dá)增強(qiáng)。Fomicheva KA等[21]研究發(fā)現(xiàn)，與MDAMB-231 細(xì)胞培養(yǎng)相比，hsa-miR-1973 在異種移植物中表達(dá)增強(qiáng)，可能通過降低細(xì)胞對凋亡的敏感性，并作為與宿主機(jī)體相互作用的應(yīng)答，促進(jìn)了腫瘤的生長。因此，hsa-miR-1973、hsa-miR-4485-3p 和hsa-miR-423-5p 在前列腺癌疾病中具體的作用機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。

排除遺傳等因素，腫瘤在不同種族間的發(fā)病率差異還未得到很好的解釋。本研究通過對比不同民族miRNA 表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，與HANC 組相比，WEIC組 中hsa-miR-1973、hsa-miR-4485-3p 和hsamiR-619-5p 表達(dá)水平下調(diào)，hsa-miR-339-3p和hsa-miR-423-5p 表達(dá)水平則上調(diào)?；虮磉_(dá)水平與高通量測序結(jié)果趨勢一致，但兩民族間各miRNA 表達(dá)量差異不顯著，可以看出同類疾病不同民族間基因表達(dá)水平有一定差異，這可能與不同民族患者的遺傳背景有關(guān)。

綜上所述，hsa-miR-619-5p 和hsa-miR-339-3p 有潛力作為前列腺癌與前列腺增生患者分子診斷標(biāo)志物。此外，本研究初步探討了不同民族前列腺癌組織miRNA 表達(dá)差異，明確了不同民族間基因表達(dá)的異質(zhì)性，為進(jìn)一步闡述不同民族疾病發(fā)病提供了新的切入點(diǎn)。然而，由于本研究用于驗(yàn)證的樣本量較少，尚存在一定的局限性，有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。