功能性食品中氨基酸檢測(cè)方法研究進(jìn)展

◎ 陳 晨，陳 妍，陳 婷，倪煒華，王麗麗，施文婷

（嘉興市食品藥品與產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)院，浙江 嘉興 314001）

隨著現(xiàn)代食品工業(yè)的快速發(fā)展，人們的收入水平不斷提高，對(duì)食品的認(rèn)知也得到了提升，現(xiàn)代人們更注重食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，更強(qiáng)調(diào)科學(xué)的飲食結(jié)構(gòu)，具有特殊營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能的食品逐漸成為食品消費(fèi)的主流。功能性食品作為集營(yíng)養(yǎng)、保健、增強(qiáng)體質(zhì)、改善機(jī)體功能于一身的新型食品[1-2]，比起普通食品，能夠?qū)崿F(xiàn)功能化、精準(zhǔn)化的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充。人們可結(jié)合自身實(shí)際，通過(guò)合理飲食和科學(xué)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)維持機(jī)體健康、有效預(yù)防和控制疾病發(fā)生的目的[3-4]。因此，功能性食品在當(dāng)前有著非常廣泛的市場(chǎng)和群體受用基礎(chǔ)。

功能性食品根據(jù)不同特定人群的需要而添加相應(yīng)的功能性因子，如功能性糖類[5]、維生素[6]、皂苷[7]、氨基酸[8]等，因其功效豐富，備受產(chǎn)品生產(chǎn)企業(yè)與消費(fèi)者的青睞。目前功能性因子的種類呈現(xiàn)多元性，針對(duì)功能性食品中功能性因子的檢測(cè)方法逐漸增多，建立快速有效的檢測(cè)方法，構(gòu)建功能性食品中通用的品質(zhì)評(píng)價(jià)準(zhǔn)則和規(guī)范，對(duì)促進(jìn)功能性食品的發(fā)展及“健康中國(guó)”國(guó)家戰(zhàn)略的實(shí)施具有極其重要的意義。其中，氨基酸是構(gòu)成人體營(yíng)養(yǎng)所需蛋白質(zhì)的基本物質(zhì)，而蛋白質(zhì)又是人體的生命基礎(chǔ)[9]。作為功能性食品中常用的功能性因子，以其為主要功能性成分的功能性食品種類繁多，然而各類產(chǎn)品的品質(zhì)參差不齊，因此對(duì)氨基酸類功能性食品進(jìn)行檢測(cè)顯得尤為必要。

1 氨基酸檢測(cè)技術(shù)

1.1 氨基酸分析儀法

氨基酸分析儀先將蛋白質(zhì)及肽水解成單個(gè)氨基酸，然后再進(jìn)行氨基酸分析，是基于陽(yáng)離子交換柱分離、柱后茚三酮衍生、光度法測(cè)定的離子交換色譜儀。氨基酸分析儀是進(jìn)行氨基酸分離、衍生和檢測(cè)的全自動(dòng)化專用分析儀器，能夠在普通實(shí)驗(yàn)室中配備，操作方便，分離度和重現(xiàn)性較好，且能夠進(jìn)行批量檢驗(yàn)，但一般價(jià)格昂貴。

姜荷等[10]采用氨基酸分析儀，建立了同時(shí)測(cè)定功能性飲料中游離?；撬岷唾嚢彼岬亩繙y(cè)定方法。牛磺酸和賴氨酸的最低檢出限均為2 nmol·mL-1，線性范圍均為6 ～100 nmol·mL-1，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 7，RSD 均小于5%，回收率在98.7%～100.2%。此方法靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、切實(shí)可行。于方園等[11]采用氨基酸分析法對(duì)牛乳和大豆蛋白中的多種氨基酸進(jìn)行分析檢測(cè)，不同濃度梯度加標(biāo)回收率均在94.2%～103.1%，RSD 在0.89%～3.31%。該方法利用氨基酸分析儀，通過(guò)模擬摻假實(shí)驗(yàn)對(duì)牛乳和大豆蛋白中的17 種氨基酸進(jìn)行測(cè)定比較，發(fā)現(xiàn)牛乳中的大豆分離蛋白摻假量可通過(guò)天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、組氨酸和精氨酸6 種特定氨基酸的總含量進(jìn)行計(jì)算，方法簡(jiǎn)便，靈敏度高，為牛乳中大豆分離蛋白的摻假鑒別提供了一種新的檢測(cè)方法。鐘秋瓚[12]利用氨基酸分析儀測(cè)定乳飲料及乳制品中游離甘氨酸含量，研究了樣品前處理方法和儀器色譜分離條件對(duì)乳飲料及乳制品中甘氨酸測(cè)定的影響。該方法具有較好的重現(xiàn)性，加標(biāo)回收率為96.4%～100.6%，方法精密度為0.99%，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)為0.999 9。馮志強(qiáng)等[13]用氨基酸分析儀測(cè)定含乳飲料中游離甘氨酸含量，研究了樣品預(yù)處理方法和儀器色譜分離條件。測(cè)得含乳飲料中游離甘氨酸的含量，從而對(duì)含乳飲料中是否添加甘氨酸進(jìn)行分析，此方法具有較好的重現(xiàn)性，添加標(biāo)準(zhǔn)的回收率為98.8%～101.7%，方法精密度為0.53%。SHIM 等[14]利用氨基酸分析儀同時(shí)測(cè)定嬰幼兒配方奶粉中16 種氨基酸。氨基酸的回收率在87.18%～118.08%，LOD ＜0.059 mg/100 g，LOQ ＜0.198 mg/100 g。

1.2 分光光度法

分光光度法主要利用氨基酸與茚三酮產(chǎn)生藍(lán)紫色化合物，測(cè)定在某一波長(zhǎng)處最大吸收峰值的大小，從而得到氨基酸的含量。此方法檢測(cè)成本低且操作方便，適用范圍廣泛，但只能測(cè)定一種或一類氨基酸的總含量，不能進(jìn)行氨基酸的分離[15]。

周菊峰等[16]用差示分光光度法測(cè)定決明子中的8 種必需氨基酸，氨基酸與茚三酮生成藍(lán)紫色化合物，在8 種必需氨基酸最大吸收波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸光度。該法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，結(jié)果可靠，適用于內(nèi)含決明子的功能性食品中各類氨基酸的測(cè)定。楊葵華等[17]采用單因素試驗(yàn)對(duì)提取條件進(jìn)行探究，氨基酸與茚三酮顯色后，用分光光度法測(cè)定人參果中氨基酸含量。結(jié)果表明，氨基酸含量在2 ～12 mg·mL-1線性關(guān)系良好，平均回收率為99.5%，RSD 為2.9%。胡京枝等[18]對(duì)含乳飲料中游離氨基酸含量的試驗(yàn)條件進(jìn)行了研究，建立了紫外分光光度法測(cè)定游離氨基酸含量的測(cè)定方法，該方法同樣具有良好的回收率和重復(fù)性。

1.3 近紅外光譜法

近紅外光譜法主要利用有機(jī)化合物的含氫基團(tuán)在特定波長(zhǎng)范圍內(nèi)躍遷，產(chǎn)生光譜變化，結(jié)合統(tǒng)計(jì)方法間接實(shí)現(xiàn)氨基酸的定量檢測(cè)，具有簡(jiǎn)單、快速、無(wú)損、環(huán)保無(wú)污染以及同時(shí)測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)。

陶琳麗等[19]研究了20 種氨基酸的分子結(jié)構(gòu)與其近紅外光譜的相關(guān)性，為在功能性食品中氨基酸的檢測(cè)奠定了一定的理論基礎(chǔ)。研究表明，20 種氨基酸在1 000 ～2 502 nm 區(qū)域主要存在4 個(gè)特征光譜區(qū)，有非常明顯的近紅外光譜吸收且差異顯著。因此，可以利用此4 個(gè)近紅外光譜特征區(qū)域?qū)Π被徇M(jìn)行定量和定性分析，提高氨基酸近紅外光譜模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。趙琛等[20]提出了用近紅外漫反射光譜技術(shù)快速檢測(cè)發(fā)酵冬蟲夏草[21]中氨基酸含量的新方法。在一定光譜區(qū)域范圍內(nèi)建立了近紅外光譜數(shù)據(jù)與氨基酸、精氨酸和總氨酸含量間的定量關(guān)聯(lián)模型，為以冬蟲夏草加工成的功能性食品中氨基酸含量的測(cè)定提供一條新的途徑。龔加順等[22]以140 個(gè)茶飲料樣品為試材，探討了近紅外線光譜技術(shù)（Near Infrared Spectrum Instrument，NIRS）快速測(cè)定共飲料品質(zhì)相關(guān)成分的可行性。試驗(yàn)結(jié)果表明，所建立的品質(zhì)成分近紅外校正模型可應(yīng)用于茶飲料的總氨基酸（Total Amino Acids，TAA）的快速檢測(cè)分析，而無(wú)需任何化學(xué)藥品。

1.4 電化學(xué)分析法

電化學(xué)分析法一般是采用不同種類的氨基酸選擇性電極對(duì)其進(jìn)行各種氨基酸的測(cè)定。因具有檢測(cè)時(shí)間短、檢測(cè)種類多、無(wú)放射無(wú)污染等優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)得到了迅速發(fā)展[23]。

王力等[24]根據(jù)L-賴氨酸（L-lysine）具有增強(qiáng)三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)32+]電化學(xué)發(fā)光信號(hào)的特性，建立一種毛細(xì)管電泳-電化學(xué)發(fā)光分離檢測(cè)L-賴氨酸的新方法。該方法已成功用于飲料中L-賴氨酸的檢測(cè)，結(jié)果令人滿意，對(duì)于部分功能性飲料同樣適用。李笑笑[25]利用毛細(xì)管電泳與電化學(xué)聯(lián)用體系檢測(cè)含乳飲料中游離甘氨酸，以自制的石墨圓盤電極為工作電極，得到最低檢測(cè)限（S/N=3）為7.9 10-7mol·L-1，乳飲料中游離甘氨酸的加標(biāo)回收率為83%～109%，為檢測(cè)功能性飲料中的氨基酸提供新的方法。

1.5 色譜法

色譜檢測(cè)主要利用某一特定的色譜系統(tǒng)（薄層色譜、高效液相色譜或氣相色譜等系統(tǒng)）進(jìn)行混合物中各組分的分離分析，廣泛用于分析多組分樣品。色譜檢測(cè)種類較多，按流動(dòng)相分有液相色譜、氣相色譜、超臨界流體色譜等，按固定相分有填充柱色譜、毛細(xì)管柱色譜、微填充柱色譜等。色譜法具有分析速度快、分離效率高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)。

陳貫昊[26]建立了梯度淋洗-離子色譜-積分脈沖安培檢測(cè)法同時(shí)測(cè)定運(yùn)動(dòng)飲料中20 種氨基酸和6 種糖的分析方法。通過(guò)對(duì)梯度淋洗條件、色譜柱溫度、pH 值以及前處理?xiàng)l件等實(shí)驗(yàn)影響因素的考察，優(yōu)化出適合同時(shí)檢測(cè)26 種組分的分析方法。檢出限為0.001 ～0.060 mg·L-1，加標(biāo)回收率達(dá)到86.2%～105.0%（n=5），該方法高效、簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確，可用于運(yùn)動(dòng)飲料中多種氨基酸和糖的同時(shí)測(cè)定分析。馮盛斌等[27]建立反相高效液相色譜法檢測(cè)維生素功能飲料中L-賴氨酸的含量的分析方法。?；撬嵩诰€性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)r＞0.999，回收率大于97.6。結(jié)果表明，該方法操作性強(qiáng)、靈敏度高，適用于維生素功能飲料中L-賴氨酸的檢測(cè)。胡建鴻等[28]建立反相高效液相色譜法（Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography，RP-HPLC）同時(shí)測(cè)定氨基酸保健飲品中16 種氨基酸的分析方法。在各氨基酸的線性范圍內(nèi)，16 種氨基酸的線性相關(guān)系數(shù)r在0.999 6 ～0.999 9，平均回收率為96.0%～104.0%。結(jié)果表明，本方法專屬性強(qiáng)，操作方便，靈敏度高，可用于氨基飲料中氨基酸的含量檢測(cè)。賀習(xí)文等[29]建立了離子交換色譜-柱后衍生法測(cè)定綠茶飲料中39 種游離氨基酸的分析方法。經(jīng)過(guò)磺酸型陽(yáng)離子交換色譜柱分離，茚三酮柱后衍生，調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例和柱溫，39 種游離氨基酸均得到了較好的分離。該方法前處理簡(jiǎn)單易操作、實(shí)用性強(qiáng)，適用于綠茶飲料中39 種游離氨基酸的檢測(cè)。

1.6 質(zhì)譜法

質(zhì)譜作為高選擇性和高靈敏度的檢測(cè)工具，在氨基酸分析中發(fā)揮著重要作用。質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)氨基酸主要是根據(jù)其質(zhì)荷比信號(hào)推導(dǎo)出分子質(zhì)量來(lái)實(shí)現(xiàn)的，蛋白質(zhì)經(jīng)完全水解后產(chǎn)生單個(gè)的氨基酸殘基，通過(guò)質(zhì)譜分析可以獲得其質(zhì)荷比信息，通常結(jié)合需要結(jié)合色譜技術(shù)進(jìn)行鑒定，如LC-MS 以及LC-MS/MS 等。

董亞蕾等[30]建立一種用于檢測(cè)富硒食品中4 種硒代氨基酸的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法方法。結(jié)果口服液中，4 種硒代氨基酸的線性關(guān)系良好（r＞0.996），平均回收率為89.0%～104.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于7%。該方法對(duì)簡(jiǎn)單基質(zhì)的樣品中硒代氨基酸的測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但基質(zhì)效應(yīng)較為明顯。陶彌鋒[31]建立了一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析運(yùn)動(dòng)飲料中甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、絲氨酸（Ser）等16 種氨基酸的方法。16 種氨基酸在0.10 ～10.00 μmol·L-1線性良好，檢出限為0.005 ～0.050 μmol·L-1，定量限為0.03 ～0.20 μmol·L-1，加標(biāo)回收率為85.1%～96.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）為1.9%～4.8%。該方法具有前處理簡(jiǎn)單、靈敏度高和檢測(cè)速度快的優(yōu)點(diǎn)，適用于運(yùn)動(dòng)飲料中較寬濃度范圍內(nèi)多種氨基酸的同步分析，為其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值測(cè)定提供參考。尤佳麗等[32]建立了一種SPE-UPLC-MA/MS測(cè)定運(yùn)動(dòng)型乳飲料中多種氨基酸的方法，樣品通過(guò)固相萃取小柱凈化去除雜質(zhì)，由超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定，該方法不同加標(biāo)梯度回收率在85.1%～96.2%，RSD 在1.1%～5.2%，干擾雜質(zhì)少，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性和精確性。陳彩云等[33]建立了微波水解-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，LC-MS）測(cè)定保健食品中16 種氨基酸的含量，該方法分析速度快、靈敏度高、準(zhǔn)確和重復(fù)性好，縮短了樣品的前處理時(shí)間，可適用于保健食品及功能性食品中16 種氨基酸的快速檢測(cè)。

2 氨基酸檢測(cè)方法的展望

越來(lái)越多以氨基酸為功能性因子的功能性食品涌現(xiàn)，使氨基酸的研究分析方法顯得更加重要。如何研究開發(fā)一種快速有效、能同時(shí)測(cè)定功能性食品中多種氨基酸的檢測(cè)方法，對(duì)于今后功能性食品品質(zhì)評(píng)價(jià)及分析評(píng)判具有重要意義。氨基酸的分析研究已成為生命、食品、醫(yī)藥等研究領(lǐng)域以及常規(guī)的檢驗(yàn)檢測(cè)工作中的重要技術(shù)。現(xiàn)階段色譜法已成為氨基酸檢測(cè)最為廣泛使用的方法，研究方向主要集中在提高穩(wěn)定性和靈敏度上。而各種檢測(cè)器的更新?lián)Q代以及各種分析設(shè)備的聯(lián)用無(wú)疑為氨基酸的分析檢測(cè)提供了更加有力的保障，高分辨質(zhì)譜、多級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜等技術(shù)將會(huì)使氨基酸分析的靈敏度、準(zhǔn)確度、分析速度及自動(dòng)化程度均提高到一個(gè)新的水平。氨基酸檢測(cè)方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，今后隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，其應(yīng)用范圍也會(huì)越來(lái)越廣?？梢灶A(yù)見的是色譜技術(shù)與各種技術(shù)的聯(lián)用將成為檢測(cè)的主流，氨基酸的分析速度、靈敏度和重復(fù)性將會(huì)在未來(lái)走上一個(gè)新的臺(tái)階。由于功能性食品的復(fù)雜特性，研發(fā)選擇性好、準(zhǔn)確度高、前處理簡(jiǎn)便的氨基酸檢測(cè)方法將是未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。需要注意的是，功能性食品種類繁多，如何選擇合適的方法檢測(cè)其中的氨基酸，還需根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件、樣品性質(zhì)種類、檢測(cè)靈敏度需求、分析時(shí)間長(zhǎng)短以及干擾因素等具體判斷。