豬源綠色氣球菌的分離與鑒定

郭偉娜，路振香，陳雪龍，劉 暢，張留君，趙 磊

(安徽科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，安徽鳳陽 233100)

綠色氣球菌(Aerococcusviridans)屬鏈球菌科、氣球菌屬，是一種呈二聯(lián)或四聯(lián)方式排列、無芽孢、不運(yùn)動(dòng)、兼性厭氧的革蘭氏陽性球菌。目前，氣球菌屬包括8個(gè)種[1]，即綠色氣球菌、尿道氣球、柯氏氣球菌、血?dú)馇蚓⑷四驓馇蚓?、馬尿氣球菌、豬氣球菌、陰道氣球菌。綠色氣球菌是一種條件致病菌，可引起人的菌血癥、心內(nèi)膜炎、腦膜炎和關(guān)節(jié)炎等[2]。獸醫(yī)臨床上該菌可引起奶牛乳腺炎、豬關(guān)節(jié)炎、豬腦膜炎和豬肺炎等[3-4]，還可感染山羊、雞、鴨、竹鼠等動(dòng)物[5-8]。豬感染綠色氣球菌后主要表現(xiàn)為精神不振、食欲降低、體溫升高、氣喘、關(guān)節(jié)腫大，背部、腹部、四肢內(nèi)側(cè)等皮膚有出血現(xiàn)象，下痢甚至血便等；剖檢病理變化主要為心臟和肺臟表面有纖維素性滲出物，心包積液，胸腔積液，腹腔器官有纖維素性滲出物附著，腹腔、關(guān)節(jié)積液，脾臟腫大，肺臟出血水腫，淋巴結(jié)出血等[4]。

目前，國外主要是關(guān)于魚、蝦、蟹等水產(chǎn)動(dòng)物感染綠色氣球菌的報(bào)道，2010年首次從患病的羅非魚分離到2株綠色氣球菌[9]，但對(duì)豬綠色氣球菌的研究較少。本研究從某豬場送檢的病死豬肝臟組織中進(jìn)行病原分離培養(yǎng)，以及16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增與測(cè)序分析，為該病的臨床診斷及防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 安徽省鳳陽縣某生豬養(yǎng)殖場所送檢的病死豬肝臟組織?；疾∝i臨床表現(xiàn)為體溫升高，被毛粗亂，氣喘，剖檢病理變化有淋巴結(jié)腫大，氣管有黏液及出血，肺臟出血，脾臟腫大，肝臟腫大有出血。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 血瓊脂培養(yǎng)基，常德比克曼生物科技有限公司產(chǎn)品；LB肉湯培養(yǎng)基、PCR擴(kuò)增試劑盒、瓊脂糖、50×TAE緩沖液、DNA Marker DL 2 000等，生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器設(shè)備 立式壓力蒸汽滅菌器(LDZX-50FB)，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；電子天平(BS224S)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)(ZWZM-1)，上海智城分析儀器制造有限公司產(chǎn)品；隔水式恒溫培養(yǎng)箱(GSP-9050MBE)，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；小型臺(tái)式高速離心機(jī)(5424)，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；PCR擴(kuò)增儀(ETC811)，北京東勝生物科技有限公司產(chǎn)品；凝膠成像儀(Tanon1600)，上海天能科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 分離純化和染色鏡檢 用滅菌接種環(huán)蘸取病死豬的肝臟組織在血瓊脂培養(yǎng)基上劃線接種，37℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。然后對(duì)純化的病原菌進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀察。

1.2.2 生化試驗(yàn) 用接種環(huán)或接種針將分離菌分別接種至糖發(fā)酵管(葡萄糖、乳糖、蔗糖)、蛋白胨水和葡萄糖蛋白胨水中，37℃培養(yǎng)24 h～48 h后，觀察糖發(fā)酵試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、二乙酰試驗(yàn)(VP試驗(yàn))和吲哚形成試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.3 DNA模板的制備 用滅菌接種環(huán)挑取單個(gè)菌落接種于LB肉湯培養(yǎng)基，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。之后采用煮沸法提取核酸，即為DNA模板。

1.2.4 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增及測(cè)序分析 參考細(xì)菌16S rRNA基因序列的通用引物，由通用生物系統(tǒng)(安徽)股份有限公司合成，引物序列如下：27-F:5′- AGAGTTTGATCATGGCTC3′，1525-R:5′-AAGGAGGTGATCCAACC-3′。

PCR反應(yīng)體系為50 μL：PCR Master Mix 25 μL，上、下引物各2 μL，DNA模板5 μL，無菌水16 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至通用生物系統(tǒng)(安徽)股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)分析，用DNAStar軟件中的Megalign程序進(jìn)行同源性分析和遺傳進(jìn)化樹的構(gòu)建。

2 結(jié)果

2.1 分離培養(yǎng)及染色鏡檢結(jié)果

分離菌在血瓊脂培養(yǎng)基上分離純化后的菌落特征見圖1，其中左圖為菌落正面觀察結(jié)果，右圖為菌落背面觀察結(jié)果。分離菌培養(yǎng)特性主要為表面光滑、濕潤、邊緣整齊、輕度隆起、灰白色、圓形小菌落，菌落周圍有草綠色的不完全溶血現(xiàn)象。分離菌的革蘭氏染色鏡檢結(jié)果為藍(lán)紫色的革蘭氏陽性球菌，呈二聯(lián)或四聯(lián)方式排列，無芽孢。

圖1 分離菌在血瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特性

圖2 分離菌革蘭氏染色鏡檢結(jié)果(10×100)

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果

生化試驗(yàn)結(jié)果表明，糖發(fā)酵試驗(yàn)中，分離菌對(duì)葡萄糖、乳糖和蔗糖均能分解產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣，培養(yǎng)液由紫色變?yōu)辄S色；甲基紅試驗(yàn)的結(jié)果為陽性，培養(yǎng)液由黃色變?yōu)榧t色；吲哚試驗(yàn)與VP試驗(yàn)的結(jié)果為陰性，仍為黃色。

2.3 PCR擴(kuò)增及測(cè)定分析結(jié)果

分離菌16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有一條1500 bp左右的條帶，與目的條帶相符(圖3)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.分離菌的PCR產(chǎn)物；2.陰性對(duì)照

將分離菌16S rRNA基因的測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上的核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)其與綠色氣球菌719菌株的16S rRNA基因序列(GenBank登錄號(hào)：MN513224)相似性高達(dá)99.86%。同時(shí)將分離菌16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果(seq1)與GenBank中已有的10株綠色氣球菌參考菌株(表1)，用Megalign進(jìn)行同源性分析和遺傳進(jìn)化樹的構(gòu)建(圖4和圖5)，圖中seq1表示本研究中分離菌序列，其他菌株均用GenBank登錄號(hào)表示。由圖4可知，分離菌與參考菌株的同源性為99.2%～99.3%，由圖5可知，分離菌與綠色氣球菌菌株JCM20461、219、FC25026、719、NBRC 12317、DSD-PW4-OH13、SNSK 102位于同一大分支上，遺傳親緣關(guān)系較近。結(jié)果證實(shí)分離菌為綠色氣球菌，將菌株命名為AHFY，將測(cè)序結(jié)果上傳至NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中，獲得GenBank登錄號(hào)為OM278267。

圖4 16S rRNA基因序列同源性分析

圖5 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹

表1 綠色氣球菌參考菌株信息

3 討論

綠色氣球菌是一種條件致病菌，在動(dòng)物機(jī)體抵抗力下降者與其他病原混合感染時(shí)會(huì)引起菌血癥、敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、乳腺炎等病理變化。綠色氣球菌既可以感染幼齡動(dòng)物，又可以感染成年動(dòng)物，具有很強(qiáng)的致病性，同時(shí)又可以跨種屬感染，因此，獸醫(yī)臨床上應(yīng)多關(guān)注該菌的致病性研究。本研究主要是從病死豬的肝臟組織分離到1株綠色氣球菌AHFY菌株，與文獻(xiàn)[10]分離的綠色氣球菌組織來源相同。另外，其他動(dòng)物中也有從肝臟分離綠色氣球菌的報(bào)道[5，7]。綠色氣球菌感染豬可存在于多種組織器官，如心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、關(guān)節(jié)液等。當(dāng)某種病原感染后，豬發(fā)生繼發(fā)感染或混合感染的現(xiàn)象日益嚴(yán)重。豬的關(guān)節(jié)炎、腦膜炎、肺炎、菌血癥等病癥除與綠色氣球菌有關(guān)外，還與豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、多殺性巴氏桿菌、肺炎支原體、大腸埃希氏菌等多種病原有關(guān)，如豬綠色氣球菌和豬鏈球菌共同感染引起仔豬細(xì)菌性腦膜炎[11]，豬偽狂犬病病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環(huán)病毒等免疫抑制性病毒感染后可引起綠色氣球菌的繼發(fā)感染和混合感染[2]。另外，豬場環(huán)境衛(wèi)生和管理因素對(duì)豬傳染病的發(fā)生起到關(guān)鍵作用，由于綠色氣球菌是一種條件致病菌，有些生豬養(yǎng)殖場不注重飼養(yǎng)環(huán)境，消毒不徹底，為一些條件致病菌的存活和致病創(chuàng)造了有利條件。因此，在高度重視豬病毒性疾病的同時(shí)，需更加關(guān)注條件致病菌的感染。