山羊源牛無漿體對Balb/c小鼠感染性研究

彭永帥，張 曼，張 艷，菅復(fù)春，王海燕，寧長申*

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南鄭州 450046；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，河南鄭州 450046)

牛無漿體(Anaplasmabovis)隸屬于立克次體目(Rickettsiales)、無漿體科(Anaplasmataceae)、無漿體屬(Anaplasma)，1936年首次在牛體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，可感染血液單核細(xì)胞和組織巨噬細(xì)胞，大小1 μm～6 μm，在單核細(xì)胞中表現(xiàn)多種包涵體形態(tài)，其中最常見的是小型(0.5 μm～1 μm)和中型(2 μm～3 μm)球狀體，而成熟包涵體(3 μm～6 μm)較少見[1]。牛和水牛被認(rèn)為是牛無漿體的主要宿主，后來在山羊、犬、狍子、馬鹿、梅花鹿、獐、巴西的短角鹿、黃羊、豹貓、浣熊和棉尾兔等體內(nèi)也被發(fā)現(xiàn)[2]。很多蜱類被懷疑可以傳播牛無漿體，包括璃眼蜱屬、花蜱屬、扇頭蜱屬、血蜱屬等[1]。牛無漿體主要分布在非洲、亞洲和南美洲，但它也在美國和歐洲南部被發(fā)現(xiàn)[3-4]。感染牛無漿體的動(dòng)物一般表現(xiàn)輕微臨床疾病，但也有報(bào)道可導(dǎo)致發(fā)熱、虛弱、體重減輕、黏膜蒼白和淋巴結(jié)炎等比較嚴(yán)重的臨床癥狀[1]，對動(dòng)物生產(chǎn)性能影響較大。

近年來，隨著人們對牛無漿體的持續(xù)關(guān)注，其在我國多種動(dòng)物中的流行呈上升趨勢。然而，目前關(guān)于牛無漿體的研究一直停留在流行病學(xué)調(diào)查水平，其對動(dòng)物的致病性、疫苗研發(fā)、藥物治療等領(lǐng)域一直存在空白。因此，開展牛無漿體的分離鑒定及探索一種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型對該病原體的研究具有重要推動(dòng)作用。

對無漿體的檢測主要依賴于血液樣本的顯微鏡檢查和PCR檢測技術(shù)相結(jié)合的方法。牛無漿體16S rRNA和groEL基因是公認(rèn)的用于檢測該病原的目的基因[5]。本研究旨在將分離的1株牛無漿體接種至人工飼養(yǎng)的Balb/c小鼠，驗(yàn)證該菌株對Balb/c小鼠的感染性，為牛無漿體Balb/c小鼠動(dòng)物模型的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 用EDTA-Na2抗凝采血管采集購自河南洛陽某羊場的山羊頸靜脈血20 mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Balb/c健康小鼠購自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，6周齡～8周齡，體重20 g～22 g，雌雄各半,飼養(yǎng)于河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院清潔級動(dòng)物房，飼養(yǎng)方式為自由采食、自由飲水。將Balb/c小鼠隨機(jī)分為9組，每組5只。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 PCR 儀，美國ABI公司產(chǎn)品；熒光定量PCR儀，德國耶拿公司產(chǎn)品；超微量紫外分光光度計(jì)，美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；光學(xué)顯微鏡，日本奧林巴斯公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要試劑 羊外周血單核細(xì)胞分離液試劑盒，天津?yàn)柹锕井a(chǎn)品；血液DNA 提取試劑盒，美國OMEGA公司產(chǎn)品；LaTaq酶和SYBR PremixTaq和pMD-18T，日本TaKaRa公司產(chǎn)品；大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞和SanPrep柱質(zhì)粒提取試劑盒，上海生工生物工程股份有限公司產(chǎn)品；姬姆薩原液，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 單核細(xì)胞分離 取血液樣品2 mL，參照羊外周血單核細(xì)胞分離液試劑盒操作說明分離山羊單核細(xì)胞。

1.2.2 DNA提取 參照血液DNA提取試劑盒操作說明對300 μL全血或分離得到的單核細(xì)胞進(jìn)行DNA提取，所得DNA置于冰箱-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 病原鑒定及定量檢測 分別基于牛無漿體16S rRNA和groEL基因位點(diǎn)對病原進(jìn)行常規(guī)PCR(conventional PCR，cPCR)鑒定，同時(shí)為了排除不同無漿體種的混合感染，分別對山羊無漿體、綿羊無漿體、嗜吞噬細(xì)胞無漿體、邊緣無漿體、扁平無漿體和中央無漿體進(jìn)行檢測(表1)，并將PCR陽性產(chǎn)物送往北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行比對分析；用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)對病原進(jìn)行定量。

cPCR反應(yīng)總體系：10×La buffer 2.5 μL，dNTPs 4 μL，上、下游引物(20 μmol/L)均0.5 μL，LaTaq酶0.25 μL，DNA模板2 μL，滅菌純水補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，退火30 s(表1)，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃再延伸10 min。

表1 PCR引物信息及退火溫度

qPCR反應(yīng)體系：SYBR PremixTaq12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，加滅菌雙蒸水補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，57℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)。

為了利用qPCR對牛無漿體的接種濃度進(jìn)行絕對定量，構(gòu)建包含牛無漿體gltA基因的質(zhì)粒，用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。將PCR產(chǎn)物(133 bp)克隆到pMD-18T，然后轉(zhuǎn)化至大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。使用SanPrep柱質(zhì)粒提取試劑盒從轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中提取質(zhì)粒DNA，用超微量紫外分光光度計(jì)檢測DNA濃度，大于20 ng/μL可用于下一步試驗(yàn)。

為了生成定量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線并評估擴(kuò)增效率，以10倍倍比稀釋(100ng/μL～1010ng/μL)的質(zhì)粒DNA作為模板進(jìn)行擴(kuò)增。每份稀釋液在-20℃條件下保存?zhèn)溆?，為了減少污染的可能性，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA被儲存在一個(gè)單獨(dú)的冷凍箱。

1.2.4 病原接種 將不同濃度的牛無漿體采用腹腔接種方法接種至正常飼養(yǎng)的Balb/c小鼠，接種時(shí)每組內(nèi)分別設(shè)置陰性對照，接種時(shí)按照高(初濃度)、中(1/2濃度)、低(1/4濃度)劑量進(jìn)行，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，陰性對照分別注射等劑量的生理鹽水。

1.2.5 Balb/c小鼠牛無漿體感染情況檢測

1.2.5.1 Balb/c小鼠血液樣品采集 用斷尾法采集人工感染后3、6、9、12、15 d的Balb/c小鼠血液，每次采集血液樣品量約為300 μL，現(xiàn)場制作血涂片，剩余血液樣品置冰箱4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5.2 血涂片檢查 將制作好的血涂片用甲醇固定2 min～3 min，再用姬姆薩原液與磷酸鹽緩沖液配置的姬姆薩工作液染色15 min～30 min，用蒸餾水緩慢沖洗，室溫晾干后在光學(xué)顯微鏡1 000倍鏡下觀察，并拍照記錄結(jié)果。

1.2.5.3 PCR檢測 參照1.3 DNA提取方法提取小鼠血液DNA，參照1.2.4中的用于檢測牛無漿體的常規(guī)PCR引物、反應(yīng)條件和體系對小鼠血液DNA進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 牛無漿體分離及鑒定結(jié)果

對山羊單核細(xì)胞DNA樣品進(jìn)行基于牛無漿體16S rRNA和groEL基因的PCR檢測，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞樣品牛無漿體呈陽性，其它無漿體種均呈陰性。通過對單核細(xì)胞DNA樣品進(jìn)行絕對定量，測得的牛無漿體濃度為1000 ng/μL。

2.2 Balb/c小鼠牛無漿體感染情況結(jié)果

2.2.1 姬姆薩染色檢查 通過對血涂片姬姆薩染色鏡檢，在接種中等劑量和高等劑量牛無漿體Balb/c小鼠的單核細(xì)胞內(nèi)均觀察到1個(gè)或多個(gè)牛無漿體，呈紫紅色，位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，核的邊緣(圖1)。接種后3、6、9 d的血涂片中均可檢查到牛無漿體；接種后12 d檢查時(shí)，單核細(xì)胞中未見牛無漿體。由此可見，本研究接種的牛無漿體可造成Balb/c小鼠感染，9 d內(nèi)可持續(xù)感染。

箭頭指示為牛無漿體；A.陰性對照；B～D.牛無漿體感染陽性小鼠血涂片

2.2.2 PCR鑒定及檢測結(jié)果 通過對分離得到的山羊單核細(xì)胞DNA分別基于牛無漿體16S rRNA和groEL基因的PCR檢測，發(fā)現(xiàn)牛無漿體均呈陽性；測序比對發(fā)現(xiàn)，該陽性擴(kuò)增產(chǎn)物為牛無漿體目的基因片段(551 bp和529 bp)。

通過對接種牛無漿體的Balb/c小鼠血液DNA進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)接種中劑量組和高劑量組牛無漿體后3、6、9 d的DNA樣品中牛無漿體均呈陽性，低劑量組牛無漿體呈陰性；接種后12 d檢查時(shí)，高、中劑量組DNA樣品牛無漿體均呈陰性(圖2)，結(jié)果與姬姆薩染色結(jié)果一致。

S、M、L.低、中、高劑量組；P.陽性對照；N.陰性對照

3 討論

無漿體屬各成員均屬于細(xì)胞內(nèi)寄生的病原體，可從不同哺乳動(dòng)物血液和硬蜱組織中分離，并且不同無漿體的分離不依賴于宿主類型和病原體的生態(tài)型。據(jù)報(bào)道，肩胛硬蜱細(xì)胞系已能成功用于分離馬、犬、反芻動(dòng)物、人類和硬蜱源無漿體株[13]。為了從犬血液中分離嗜吞噬細(xì)胞無漿體，將其接種至篦子硬蜱系胞系(IRE/CTVM20)，培養(yǎng)7 d后在細(xì)胞中檢測到病原包涵體并完成病原的分離[13]。然而，由于細(xì)胞系的培養(yǎng)持續(xù)時(shí)間較長，操作復(fù)雜，本研究采用單核細(xì)胞分離方法分離牛無漿體，并證明分離的菌株能夠感染Balb/c小鼠，這為牛無漿體的分離提供了一種新方法，為無漿體其它菌種的分離鑒定提供了新思路。

據(jù)報(bào)道，從自然感染的動(dòng)物細(xì)胞中分離無漿體已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)，有研究從巴西鹿體內(nèi)分離鑒定了一株邊緣無漿體，并將其接種至肩胛硬蜱細(xì)胞系IDE8中，然后將感染有邊緣無漿體的IDE8細(xì)胞接種至切除脾臟的牛體內(nèi)，最后又用牛血成功感染了IDE8細(xì)胞[14]。將安氏革蜱和邊緣無漿體作為蜱-病原體交互作用模型，使硬蜱以受感染的牛血為食，從而使未感染的硬蜱感染邊緣無漿體，且感染的硬蜱被轉(zhuǎn)移到未受感染的血液中，又使邊緣無漿體感染血液[15]。用感染嗜吞噬細(xì)胞無漿體的IDE8細(xì)胞接種2只綿羊，14 d后成功感染，將感染綿羊的血液接種至另2只綿羊，不久后這2只綿羊感染并表現(xiàn)出與先前受感染的綿羊相似的臨床癥狀[16]。上述研究表明，從動(dòng)物細(xì)胞直接分離無漿體是可行的，得到的菌株具有活力。

鑒于牛無漿體能夠感染動(dòng)物單核細(xì)胞的特點(diǎn)，本研究通過分離山羊單核細(xì)胞達(dá)到了病原分離的目的，研究結(jié)果將使牛無漿體的分離鑒定、體外感染和疫苗研發(fā)方面研究更為便捷。但是，能否成功分離還應(yīng)考慮原始樣品材料中的病原載量。據(jù)報(bào)道，使用嗜吞噬細(xì)胞無漿體基于msp2基因的熒光定量PCR檢測犬血液樣品Ct值最低達(dá)13，輕微感染時(shí)Ct值達(dá)35[13]。本研究分離牛無漿體時(shí)并未對不同病原載量的血液樣品進(jìn)行定量檢測，這是本試驗(yàn)的一項(xiàng)不足之處，探索用于分離牛無漿體血液樣品中最低病原載量有待后續(xù)研究。另外，有報(bào)道從采集1周后的犬血液樣品中進(jìn)行嗜吞噬細(xì)胞無漿體分離時(shí)，許多病原體均已失活[13]，因此樣品的新鮮程度也是影響分離獲取的無漿體質(zhì)量的一個(gè)值得關(guān)注因素。

近年來無牛無漿體人工感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的報(bào)道，但是有其他無漿體人工感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的報(bào)道，李海輝等[17]對奶牛無漿體人工感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以及無漿體傳播途徑的研究，得出實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可以在免疫抑制條件下建立無漿體感染動(dòng)物模型，同時(shí)證明了無漿體的感染方式有多種，如皮下接種、腹腔注射及非蜱類吸血昆蟲機(jī)械性傳播，該試驗(yàn)結(jié)果為其他無漿體的人工感染途徑提供了依據(jù)。倪紅波等[18]研究了邊緣無漿體人工感染犢牛以及對犢牛血清生化和血液流變學(xué)影響的試驗(yàn)，觀察到血液中紅細(xì)胞的感染率呈現(xiàn)一定的消長規(guī)律，并揭示血液學(xué)與器官的變化狀況。綜上所述，無漿體的動(dòng)物感染模型有據(jù)可依，開展牛無漿體對Balb/c小鼠感染試驗(yàn)對該病原動(dòng)物模型的建立具有重要參考價(jià)值。