不同工藝制備的替米考星顆粒體外釋放度研究

李 敏，程富勝，郭麗華，周凱仁，白玉彬，李 冰，魏彥明，張繼瑜*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅蘭州 730050；3.山東德州神牛藥業(yè)有限公司，山東德州 253000)

隨著全球養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，大規(guī)模集約化養(yǎng)殖模式使畜禽的疾病呈現(xiàn)集中暴發(fā)趨勢，越來越多的抗生素、抗病毒藥物、抗真菌藥物和抗寄生蟲藥物在養(yǎng)殖場被廣泛使用。據(jù)統(tǒng)計(jì)，由胸膜肺炎放線桿菌、巴氏桿菌、支原體等病原菌引起的畜禽呼吸道疾病和泌乳動(dòng)物乳房炎等疾病給全球養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的危害和經(jīng)濟(jì)損失。我國每年因畜禽呼吸道疾病和泌乳動(dòng)物乳房炎造成的損失高達(dá)數(shù)十億元[1]。目前對于畜禽呼吸道疾病的防控主要是通過接種疫苗或使用恩諾沙星、阿莫西林和頭孢噻呋等抗生素藥物，由于病原菌的不斷變異，疫苗的保護(hù)范圍并不能全覆蓋，加上抗生素藥物的大量不規(guī)范使用，導(dǎo)致抗生素療效減弱，細(xì)菌耐藥性不斷增強(qiáng)。2014年世界衛(wèi)生組織(WHO)宣布細(xì)菌抗藥性已經(jīng)成為人類面臨的十大全球公共衛(wèi)生威脅之一[2]。因此，亟需繼續(xù)研發(fā)更有效的新型獸藥來改善和適應(yīng)畜禽疾病不斷變化的情況。

替米考星具有與其他大環(huán)內(nèi)酯類抗生素類似的特性，是畜禽專用抗生素，對革蘭氏陽性細(xì)菌、某些革蘭氏陰性菌、部分支原體和螺旋體等有抑制作用[3-4]。由于其抗菌譜廣、吸收迅速、半衰期長、表觀分布容積大、組織穿透力強(qiáng)、在靶細(xì)胞中快速積累和低濃度抑制的特性，被認(rèn)為是最安全的抗細(xì)菌感染的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，在澳大利亞、意大利和美國，替米考星已經(jīng)被批準(zhǔn)用于預(yù)防和治療牛、山羊、綿羊、豬和雞的細(xì)菌性感染的治療，在中國已被批準(zhǔn)用于治療豬和牛巴氏桿菌感染以及雞支原體感染[5-7]。但是，替米考星在胃內(nèi)易受到胃酸破壞從而導(dǎo)致功效降低，加之存在溶解性差、滲透性差、適口性差、腸外排運(yùn)和首過效應(yīng)等諸多問題，導(dǎo)致生物利用度低，口服療效不佳[8]。因此，為了提高替米考星生物利用度，增加胃內(nèi)穩(wěn)定性，降低在胃內(nèi)的損耗，研發(fā)單位在原料藥的基礎(chǔ)上，采用不同的制備技術(shù)，研制出多種替米考星新型制劑。本試驗(yàn)對新研制的3種替米考星不同口服顆粒制劑進(jìn)行了溶出度測定，為替米考星新制劑的研發(fā)和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)藥品 替米考星標(biāo)準(zhǔn)品(含量95%，批號(hào)C17582000)，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH；替米考星顆粒1(供試樣品1，含量20%，批號(hào)20201006)、替米考星顆粒2(供試樣品2，含量20%，20201008)、替米考星顆粒3(供試樣品3，含量20%，20201103)由山東德州神牛藥業(yè)有限公司自主研發(fā)； 替米考星顆粒對照品(含量20%，批號(hào)20200310)，市售替米考星腸溶顆粒。

1.1.2 主要試劑 甲醇(色譜純)，美國Fisher公司產(chǎn)品；乙腈(色譜純)，美國Fisher公司產(chǎn)品；四氫呋喃(色譜純)，二丁胺(分析純)，美國sigma公司產(chǎn)品；磷酸(色譜純)，科密歐，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；NaOH(分析純)，鹽酸(分析純)，磷酸鈉(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；純水和超純水為試驗(yàn)自制。

1.1.3 主要儀器 ME403型電子天平，瑞士Mettler Toledo公司產(chǎn)品；KQ-600DE數(shù)控超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；UPT-Ⅱ-40L優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)，上海優(yōu)普實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，德國Sartorius公司產(chǎn)品；溶出儀，德國Phmsa公司產(chǎn)品；Waters2695高效液相色譜儀，Waters2489紫外檢測器，美國Waters公司產(chǎn)品；針筒式微孔濾膜，孔徑0.22 μm，天津津騰實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；Hypersil ODS-2 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，大連依利特分析儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 Hypersil ODS-2 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為水∶乙腈∶磷酸二丁胺緩沖液∶四氫呋喃(790∶130∶25∶55)；流速為1.0 mL/min；檢測波長為290nm；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為20 μL。

1.2.2 溶液配制

1.2.2.1 磷酸稀釋液 取900 mL水，加入5.71 g磷酸，用12.5 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至2.5±0.1，加水定容至1000 mL，搖勻即得。

1.2.2.2 對照品溶液 精確稱取替米考星對照品25 mg，置于50 mL容量瓶，加10 mL乙腈超聲使其溶解，用磷酸緩沖液定容至刻度線，搖勻即得。

1.2.2.3 供試品溶液 精確稱取25 mg替米考星待測品25 mg，置于50 mL容量瓶，加10 mL乙腈超聲使其溶解，用磷酸稀釋液定容至刻度線，搖勻即得。

1.2.2.4 溶出介質(zhì) 根據(jù)《中國獸藥典》腸溶顆粒溶出度試驗(yàn)方法，分別配制pH為1.0的酸溶液和pH為6.8的磷酸鹽緩沖液[9]。

1.2.3 含量測定方法學(xué)驗(yàn)證

1.2.3.1 專屬性試驗(yàn) 精確量取空白溶液(流動(dòng)相)、對照品溶液和供試品溶液分別經(jīng)0.22 μm微孔濾器過濾，注入色譜儀，依次進(jìn)行樣品測定。

1.2.3.2 線性考察 精確稱取50 mg替米考星標(biāo)準(zhǔn)品，置于50 mL容量瓶中，加入10 mL乙腈，超聲使其溶解，加入磷酸稀釋液定容至刻度線，搖勻，配制成1 mg/mL的替米考星標(biāo)準(zhǔn)品母液待用。采用梯度稀釋法，取標(biāo)準(zhǔn)品母液配制成的質(zhì)量濃度為10、50、100、200、400、600、800、1000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，精確量取20 μL注入色譜儀，記錄峰面積，以替米考星標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積為縱坐標(biāo)Y，以替米考星標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)，繪制峰面積(Y)-質(zhì)量濃度(C)標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程。

1.2.3.3 回收率試驗(yàn) 精確稱取替米考星標(biāo)準(zhǔn)品，用10 mL乙腈溶解，用磷酸緩沖液定容至10 mL容量瓶中，配制成80 μg/mL(低)、100 μg/mL(中)、120 μg/mL(高)3個(gè)質(zhì)量濃度的對照品溶液，每各濃度的溶液分別進(jìn)樣3次，測定每個(gè)樣品的實(shí)際質(zhì)量濃度，根據(jù)實(shí)際質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度的比值，計(jì)算回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.2.3.4 精密度試驗(yàn) 精確稱取替米考星標(biāo)準(zhǔn)品，用10 mL乙腈溶解，用磷酸緩沖液定容至10 mL容量瓶中，配制成80 μg/mL(低)、100 μg/mL(中)、120 μg/mL(高)3個(gè)質(zhì)量濃度的對照品溶液，分別考察日內(nèi)精密度和日間精密度。

1.2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 按照1.2.2.3供試樣品配制方法，配制5份供試樣品溶液，分別經(jīng)0.22 μm微孔濾器過濾，按照1.2.1色譜條件，精密吸取每個(gè)樣品溶液20 μl進(jìn)樣，計(jì)算含量及其RSD值。

1.2.3.6 溶出度方法 根據(jù)溶出度與釋放度測定法中腸溶顆粒體外溶出度測定方法，用兩種介質(zhì)對替米考星不同制劑(每種3個(gè)平行)進(jìn)行體外溶出試驗(yàn)，選用漿法，溶出介質(zhì)體積為900 mL，轉(zhuǎn)速為75 r/min，溫度為37℃±0.5℃，用“1.2.2”中的方法配制酸和緩沖液兩種溶出介質(zhì)，取樣時(shí)間點(diǎn)為5、10、15、20、30、40、50、60、75、90、120 min，取樣體積為5.0 mL(同時(shí)補(bǔ)液5.0 mL)，經(jīng)濾膜過濾后測定樣品在不同溶出介質(zhì)中的溶出情況，記錄峰面積，繪制溶出曲線。

1.2.4 溶出度方法學(xué)驗(yàn)證

1.2.4.1 方法專屬性試驗(yàn) 精確量取空白溶液、對照品溶液和供試品溶液分別經(jīng)0.22 μm微孔濾器過濾，注入色譜儀，依次進(jìn)行樣品測定。

1.2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取本品90 mg，分別以酸和緩沖液900 mL為溶出介質(zhì)，在5、10、15與30 min時(shí)，分別取5 mL溶液，同時(shí)在操作容器中補(bǔ)充溶出介質(zhì)5 mL。濾過，取濾液適量，作為供試品溶液。然后分別在0、2、4、8、12、18、24 h注入液相色譜儀，記錄色譜圖。計(jì)算替米考星峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.4.3 濾膜吸附性試驗(yàn) 取兩種溶出介質(zhì)中120 min時(shí)的供試樣品溶液5 mL，分別經(jīng) 0.22 μm、0.45 μm和0.8 μm微孔濾膜處理，取濾液20 uL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，比較峰面積大小。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析方法 用Excel 2019初步整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并采用Duncan法多重比較，P>0.05定義為不具有顯著性差異，P<0.05定義為具有顯著性差異，P<0.01定義為具有極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 含量測定

2.1.1 專屬性考察 結(jié)果見圖1和圖2，表明空白溶液對樣品含量測定無干擾，該方法專屬性強(qiáng)。

圖1 空白溶液

圖2 替米考星標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.1.2 線性考察 以替米考星標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)，繪制峰面積(Y)-質(zhì)量濃度(C)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3，線性回歸方程為y=26 971x-196 608,R2=0.999 6，表明替米考星在濃50 μg/mL～1000 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與對應(yīng)的峰面積的線性關(guān)系良好。

圖3 替米考星標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.1.3 回收率與精密度 替米考星的平均回收率為110.0%，RSD值均不大于2%，表明該方法的準(zhǔn)確度較高。

2.1.4 重復(fù)性 按照1.2.2供試品的配置方法，分別配制5份供試樣品，測定5份替米考星含量RSD值分別為1.25%、1.65%、1.69%、1.97%和1.06%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.5 替米考星不同制劑含量測定 結(jié)果顯示供試樣品替米考星含量均在標(biāo)示量的90%～110%，結(jié)果見表1。

表1 不同替米考星供試樣品含量

2.2 溶出度

2.2.1 專屬性考察 結(jié)果表明，兩種溶出介質(zhì)對替米考星的測定無干擾，該方法專屬性強(qiáng)(圖4～圖6)。

圖4 空白緩沖液色譜圖

圖5 空白酸色譜圖

圖6 替米考星供試樣品色譜圖

2.2.2 穩(wěn)定性 在不同時(shí)間段對供試品溶液進(jìn)樣分析，替米考星峰面積的RSD值均小于2.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.3 濾膜吸附性試驗(yàn) 分別對3種濾過方式的峰面積進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種濾膜濾過后峰面積無差異。說明濾膜對替米考星無吸附作用，故選擇最常用的0.22 μm PES濾膜過濾。

2.2.4 酸中溶出度 替米考星供試樣品1、供試樣品2、供試樣品3、替米考星對照樣品，在酸中的溶出度見圖7。結(jié)果顯示，供試樣品1在酸中溶解良好，累積溶出度為100%；供試樣品2在酸中的累積溶出度為5.73%，供試樣品3在酸中的累積溶出度為8.29%；替米考星對照樣品在酸中的累積溶出度為2.36%，因此只有供試樣品2和3符合獸藥典對替米考星腸溶制劑在酸中溶出度小于10%的規(guī)定。

圖7 不同替米考星供試樣品在酸中的溶出曲線

2.2.5 緩沖液中累積溶出度 替米考星供試樣品1、供試樣品2、供試樣品3、對照樣品在5、10、15、20、30、40、50、60、75、90、120 min時(shí)累積溶出度見圖8，結(jié)果顯示替米考星供試樣品1、2、3以及對照樣品在緩沖溶液中的累積溶出度分別為100%、97.53%、93.60%和93.15%。

圖8 不同替米考星供試樣品在緩沖液中的溶出曲線

3 討論

針對不同的動(dòng)物和用藥途徑，目前市面上有許多不同劑型的替米考星制劑，包括可溶性粉末、預(yù)混劑、注射液、腸溶顆粒、固體脂質(zhì)納米粒、固體分散體等[8,10-13]。臨床上預(yù)混劑、注射劑和腸溶顆粒最為常見。研究發(fā)現(xiàn)，替米考星預(yù)混劑口服給藥后，吸收迅速，但是吸收不完全，并且替米考星味極苦，適口性差，給藥比較困難[14]。通過對替米考星的注射劑研究發(fā)現(xiàn)，替米考星對心臟具有很強(qiáng)的毒性，進(jìn)入血管的替米考星可以導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)心動(dòng)過速和心肌收縮力下降[10]。我國《獸藥典》明確指出給豬肌肉注射10 mg/kg的替米考星后，會(huì)出現(xiàn)呼吸急促、嘔吐和驚厥等不良反應(yīng)，加大劑量至20 mg/kg進(jìn)行肌肉注射時(shí)，大多數(shù)豬出現(xiàn)死亡等現(xiàn)象[9]。因此，同一種藥物，經(jīng)過不同生產(chǎn)工藝和制備技術(shù)所得到的不同制劑，其藥物活性成分的釋放速度、吸收程度以及安全劑量范圍不盡相同。

試驗(yàn)中3種替米考星供試樣品，為不同工藝和技術(shù)生產(chǎn)而成的顆粒制劑。研究結(jié)果顯示，在酸液中5 min替米考星供試樣品1累計(jì)溶出度已達(dá)63.83%，90 min可完全溶出，說明在酸性介質(zhì)中，顆粒崩解快，能快速釋放出主藥成分，與對照品相比極顯著(P<0.01)；供試樣品2、3在5 min時(shí)，累積溶出度分別為2.56%和5.54%，與樣品1比有顯著性(P<0.05)，在90 min時(shí)累積溶出度分別為5.73%、8.29%，隨時(shí)間不斷增加，與其初測時(shí)間點(diǎn)溶出度相比較無顯著差異(P>0.05)，但于樣品1 在90 min的溶出度差異顯著(P<0.05)。從累積溶出度變化趨勢看，樣品1主要集中在40 min前，累積溶出度達(dá)到93%以上，40 min后溶出度速率變化不大；樣品2、樣品3累積溶出度速率變化與對照品變化趨勢基本相同，從5 min～90 min不同的測定時(shí)間點(diǎn)之間累積溶出度變化無顯著性差異(P>0.05)。

在磷酸鹽緩沖溶液中，5 min時(shí)，樣品1的累積溶出度明顯高于樣品2、樣品3和對照品，而樣品2、樣品3與對照品之間無明顯差異。在中間點(diǎn)60 min時(shí)，供試樣品1、2、3的累積溶出度分別為94.88%、90.23%和82.96%，對照樣品在60 min時(shí)累積溶出度為79.01%，3種供試樣品累積溶出度均高于對照樣品，其中樣品1的累積溶出度最高。120 min時(shí)試樣品1中替米考星已完全釋放，樣品2、樣品3和對照樣品的累積溶出度分別為97.53%、93.60%和93.15%，供試樣品之間、供試樣品與對照品之間累積溶出度均無顯著差異(P>0.05)。試驗(yàn)結(jié)果表明，在緩沖溶液中，供試樣品均具有理想的溶出度。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)中所用的供試樣品所采用的原輔料的不同直接影響了在酸和緩沖液中溶出度。供試樣品1未經(jīng)過包被工藝直接由主藥替米考星與輔料加工而成的顆粒，在酸和緩沖液中均容易釋放出活性成分，供試樣品2和供試樣品3經(jīng)過包被后，在酸中，溶出度呈下降趨勢，對原藥的釋放具有很強(qiáng)阻抗作用，包被所用材料和所形成的包被結(jié)構(gòu)具有很強(qiáng)的耐酸性，與對照品的累積溶出度無顯著差異(P>0.05)。在磷酸鹽緩沖液中，供試樣品2和供試樣品3溶出度趨勢有差異性(P<0.05)，這主要與兩者的主藥成分有關(guān)，供試樣品2主藥為替米考星，而供試樣品3為磷酸修飾過的替米考星磷酸鹽，結(jié)果顯示出樣品2在緩沖溶液中具有良好的釋放效果。綜合酸和緩沖液中3種供試樣品的試驗(yàn)結(jié)果，依據(jù)獸藥典的相關(guān)規(guī)定，供試樣品2、3均符合腸溶制劑在酸中溶出量小于10%，在緩沖液中供試樣品均符合累積溶出度不低于70%，與對照品相比較，均可以作為替米考星腸溶顆粒新制劑進(jìn)一步研發(fā)，而供試樣品1不宜作為腸溶顆粒制劑研發(fā)。