自擬中藥復(fù)方與牦牛源地衣芽孢桿菌聯(lián)合治療犢牛腹瀉的效果

龔賽賽，張 朝，全楚嫻，周詩(shī)萌，高 興，曾智博，曹 暉，李家奎,2*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北武漢 430070；2.西藏農(nóng)牧學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，西藏林芝 860000；3.陜西秦寶牧業(yè)股份有限公司，陜西寶雞 721000)

犢牛腹瀉是犢牛期的一種消化系統(tǒng)疾病，其主要臨床表現(xiàn)為排稀薄或水樣糞便，呈黃色、綠色或白色，有惡臭，甚至含有黏膜或便血等，且傳染性強(qiáng)，給養(yǎng)牛行業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。引起犢牛腹瀉的原因有很多，除了消化不良及飼養(yǎng)管理不當(dāng)之外，最重要的原因是病原微生物的感染，如大腸埃希氏菌(E.coli)、沙門(mén)氏菌(Salmonella)、牛輪狀病毒(Bovine rotavirus,BRV)、牛冠狀病毒(Bovine coronavirus,BCoV)、牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)、隱孢子蟲(chóng)(Cryptosporidium)、球蟲(chóng)(Coccidia)等[2-4]。目前，生產(chǎn)上主要使用抗生素防治犢牛腹瀉，但抗生素類(lèi)藥物在應(yīng)用過(guò)程中容易產(chǎn)生耐藥性，藥物殘留超標(biāo)可引起食品安全和公共衛(wèi)生等問(wèn)題[5]，我國(guó)已禁止生產(chǎn)含有抗生素等促生長(zhǎng)類(lèi)飼料添加劑的商品飼料[6]。因此，尋找和開(kāi)發(fā)新的安全、高效、低毒的抗生素替代品便成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。傳統(tǒng)中草藥和新興益生菌可以調(diào)節(jié)動(dòng)物機(jī)體腸道菌群，促進(jìn)活性物質(zhì)的增殖，提高機(jī)體免疫力[7]。研究表明，在犢牛日糧中添加復(fù)合益生菌制劑可以顯著降低犢牛腹瀉率,提高犢牛生長(zhǎng)性能[8]。研究發(fā)現(xiàn)[9]，早期給予犢牛益生菌可改善犢牛腸道健康，調(diào)節(jié)腸道菌群，抑制病原體定殖，從而減少腹瀉病的發(fā)生。中草藥不僅具備抗菌消炎及調(diào)控機(jī)體自身免疫等作用，還具有療效好、低毒、低殘留、環(huán)保和不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)[10]。研究表明[11]，傳統(tǒng)中藥復(fù)方補(bǔ)中益氣湯、四君子湯和參苓白術(shù)湯能夠緩解抗生素相關(guān)性腹瀉，改善腸道菌群。用中藥蒲公英、黃連、板藍(lán)根等提取物能有效改善豬流行性腹瀉病毒所致的新生仔豬生長(zhǎng)性能受損和腸道損傷，減輕腹瀉[12]。因此,益生菌和中草藥替代抗生素應(yīng)用于畜牧業(yè)腹瀉疾病的防控受到越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注。本研究以1月齡以?xún)?nèi)腹瀉犢牛為試驗(yàn)對(duì)象，探究牦牛源地衣芽孢桿菌和自擬中藥復(fù)方對(duì)犢牛腹瀉的影響，為開(kāi)發(fā)用于防控犢牛腹瀉的益生菌制劑和中草藥復(fù)方提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 10日齡至30日齡中度及以上腹瀉犢牛20頭，健康犢牛5頭，腹瀉病料及試驗(yàn)犢牛來(lái)自陜西省楊凌示范區(qū)某肉牛場(chǎng)。

1.1.2 藥物和益生菌制劑的準(zhǔn)備 自擬中藥復(fù)方(TCM)及用量(1月齡內(nèi)犢牛)：干姜(3.75 g)、白術(shù)(2.4 g)、山藥(3.75 g)、茯苓(2.6 g)、白附片(1.35 g)、丹參(1.15 g)、黨參(3.75 g)、虎杖(0.75 g)、佩蘭(1.25 g)、澤蘭(1.35 g)、川芎(1.25 g)、馬尾黃連(0.625 g)、山楂(0.725 g)等中草藥用粉碎機(jī)打碎成粉按比例混合，加水灌服。牦牛源地衣芽孢桿菌(BL)，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)李家奎教授團(tuán)隊(duì)分離保存，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后制成干粉制劑，2.5 g/次(108CFU)溶于水中灌服。

1.1.3 主要試劑 Simply P病毒DNA/RNA 提取試劑盒BSC67M1，杭州博日科技股份有限公司產(chǎn)品；HiScript Ⅱ One Step RT-PCR Kit (Dye Plus) P612-01，南京諾唯贊生物科技股份有限公司產(chǎn)品；2×ProTaq預(yù)混液(含染料)AG11109，湖南艾科瑞生物工程有限公司產(chǎn)品；SuperRed/GelRed核酸染料BS354A，北京蘭杰柯科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 臺(tái)式冷凍離心機(jī)，Hettich公司產(chǎn)品；固定式旋轉(zhuǎn)混勻儀和PCR儀，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)股份公司產(chǎn)品；電泳儀，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品;藍(lán)光凝膠成像分析系統(tǒng)，北京百晶生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；全自動(dòng)生化分析儀，邁瑞公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病原檢測(cè) 收集腹瀉犢牛糞便樣本，干冰低溫條件下運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，在-80℃保存用于病原檢測(cè)。用無(wú)酶水稀釋糞便樣本至適宜濃度后1 000 r/min離心4 min，取上清液按照Simply P病毒DNA/RNA提取試劑盒、HiScript Ⅱ One Step RT-PCR Kit (Dye Plus) 、2×ProTaq預(yù)混液(含染料)說(shuō)明提取核酸并進(jìn)行病原檢測(cè)，檢測(cè)病原及擴(kuò)增引物見(jiàn)表1。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后在藍(lán)光凝膠成像分析系統(tǒng)下觀察結(jié)果。

表1 引物序列

1.2.2 動(dòng)物分組及處理 健康犢牛5頭，中度及以上腹瀉犢牛20頭，平均分為5個(gè)試驗(yàn)組，分別為健康對(duì)照組(NC)、腹瀉組(DC)、中藥復(fù)方治療組(TCM)、牦牛源地衣芽孢桿菌治療組(BL)、中藥復(fù)方聯(lián)合地衣芽孢桿菌治療組(TCM+BL)。治療組犢牛給與對(duì)應(yīng)藥物，每天2次(早、晚各1次)，加水灌服，連續(xù)治療5 d，每天上午8時(shí)對(duì)腹瀉犢牛進(jìn)行一次綜合評(píng)分。第6天上午所有犢?？崭共杉獦?，分離血清，置-20℃凍存用于生理生化指標(biāo)檢測(cè)。

腹瀉犢牛臨床評(píng)分從糞便狀況、精神狀況和脫水狀況三個(gè)方面綜合評(píng)判，綜合評(píng)分1分～3分、4分～6分、7分～9分依次判定為輕度腹瀉、中度腹瀉和重度腹瀉。糞便狀況評(píng)分：糞便正常，形態(tài)好(0分)，糞便半成型，比正常糞便軟(1分)，伴有水樣，但還是有固體成分可見(jiàn)(2分)，完全水樣的糞便(3分)；精神狀況評(píng)分：正常的行為表現(xiàn)，動(dòng)物對(duì)環(huán)境警覺(jué)(0分)，輕度抑郁，反應(yīng)遲鈍，但犢牛還能站立和吮吸，不活躍(1分)，中度抑郁，能站立或不愿站立呈爬臥狀，吮吸很弱或虛弱(2分)，嚴(yán)重抑郁，犢牛不能站立和吮吸，側(cè)躺不起(3分)；脫水狀況評(píng)分：正常，眼睛明亮，皮膚柔順(0分)，輕度失水，皮膚彈性稍微喪失，皮膚褶皺試驗(yàn)還原時(shí)間<3 s，眼球沒(méi)有凹陷(1分)，中度失水，皮膚褶皺試驗(yàn)還原時(shí)間>3 s，眼球凹陷(2分)，重度失水，皮膚褶皺試驗(yàn)還原時(shí)間>6 s，眼球明顯凹陷(3分)。

1.2.3 血清生化指標(biāo)檢測(cè) 采用邁瑞全自動(dòng)生化分析儀BS-240VET對(duì)血清樣本進(jìn)行生化指標(biāo)檢測(cè)如丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、鈣(Ca)、鎂(Mg)、尿素(UREA)、無(wú)機(jī)磷(P)。

2 結(jié)果

2.1 腹瀉病原PCR檢測(cè)結(jié)果

在18份腹瀉犢牛糞便樣本中檢測(cè)出BRV陽(yáng)性樣本11份，陽(yáng)性率為61.11%；BCoV陽(yáng)性樣本12份，陽(yáng)性率66.67%；BVDV未檢測(cè)出陽(yáng)性。以上結(jié)果表明，該場(chǎng)區(qū)犢牛腹瀉主要是由BRV和BCoV感染引起的(表2)。

表2 腹瀉犢牛病原檢測(cè)

2.2 腹瀉犢牛臨床評(píng)分變化

與腹瀉組相比，各治療組犢牛臨床評(píng)分均表現(xiàn)下降趨勢(shì)，且TCM+BL組的犢牛臨床評(píng)分降低程度最大，經(jīng)過(guò)5 d的治療后評(píng)分趨近于0。TCM組犢牛的臨床評(píng)分降低程度要高于BL組犢牛(圖1)。以上結(jié)果表明中藥和地衣芽孢桿菌能降低腹瀉犢牛的臨床評(píng)分改善犢牛腹瀉程度，中藥和地衣芽孢桿菌聯(lián)合使用其降低腹瀉犢牛臨床評(píng)分的能力要高于單一使用。

圖1 腹瀉犢牛每日臨床評(píng)分

2.3 血清生化指標(biāo)變化

與NC組相比，DC組犢牛血清中TP、ALB、ALP、ALT、AST、UREA的濃度較高且差異顯著(P<0.05)，血清Ca2+、P-、Mg2+的濃度較低且差異顯著(P<0.05)。與DC組相比，TCM組、BL組、TCM+BL組犢牛血清的TP、ALB、ALP、ALT、AST、UREA濃度均偏低且差異顯著(P<0.05)，血清Ca2+、P-、Mg2+的濃度均偏高且差異顯著(P<0.05)。以上結(jié)果表明腹瀉會(huì)引起犢牛血清各生化指標(biāo)發(fā)生異常變化，血清TP、ALB、ALP、ALT、AST、UREA的濃度升高，血清Ca2+、P-、Mg2+的濃度降低，用中藥復(fù)方和地衣芽孢桿菌進(jìn)行治療后能改善或恢復(fù)血清生化指標(biāo)的異常變化(表3)。

表3 犢牛血清生化指標(biāo)檢測(cè)

3 討論

3.1 犢牛腹瀉病因分析

BRV通常導(dǎo)致年齡小于3周齡的犢牛腹瀉，并通過(guò)糞便將病毒排放到環(huán)境中引起群體大規(guī)模感染[13-14]。BCoV主要引起1周齡～2周齡犢牛的腹瀉，在我國(guó)普遍存在[15]。崔鑫等[16]研究表明，新疆南疆部分地區(qū)規(guī)模化奶牛場(chǎng)BRV的感染率為15.38%,BCoV的感染率為9.54%,2種病毒混合感染率為6.76%。黎玉瓊等[17]調(diào)查顯示寧夏部分地區(qū)腹瀉犢牛的BRV檢出率為43.16%,BCoV的檢出率為34.74%。本研究中，實(shí)驗(yàn)室病原檢測(cè)結(jié)果顯示，在18份腹瀉樣本中BRV的陽(yáng)性檢出率為66.67%，BCoV的陽(yáng)性檢出率為61.11%，與其他學(xué)者的研究結(jié)果相似，因此可以推斷該場(chǎng)區(qū)犢牛腹瀉主要是BRV和BCoV混合感染引起的病毒性腹瀉病。

3.2 自擬復(fù)方和地衣芽孢桿菌對(duì)犢牛腹瀉的影響

傳統(tǒng)中草藥和益生菌與抗生素類(lèi)藥物相比,具有不易產(chǎn)生耐藥性、低殘留甚至無(wú)殘留的特點(diǎn),在防控犢牛腹瀉性疾病中的優(yōu)勢(shì)日益明顯。鐘秋等[18]以黃連、烏梅、訶子肉、白術(shù)等中藥制備復(fù)方訶子口服液在體外對(duì)犢牛大腸埃希氏菌具有良好的抑菌效果,對(duì)大腸埃希氏菌腹瀉模型小鼠療效顯著。王竹青等[19]用生地、枳殼、丹皮等中藥組建復(fù)方對(duì)牛病毒性腹瀉病牛進(jìn)行治療，結(jié)果表明在牛病毒性腹瀉治療中使用中藥復(fù)方可有效提高成年牛及犢牛的治療總有效率。團(tuán)勇等[20]研究表明飼喂含有枯草芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌的犢牛精料能夠顯著降低犢牛腹瀉發(fā)生的概率。研究表明乳桿菌能夠改善犢牛糞便評(píng)分，降低腹瀉發(fā)生的概率[21]。本研究中，用自擬中藥復(fù)方和牦牛源地衣芽孢桿菌治療后，犢牛腹瀉評(píng)分呈下降趨勢(shì)，腹瀉程度降低，與其他學(xué)者的研究結(jié)果一致，表明自擬復(fù)方和牦牛源地衣芽孢桿菌對(duì)犢牛腹瀉具有良好的改善效果。并且，中藥復(fù)方聯(lián)合牦牛源地衣芽孢桿菌治療時(shí)，犢牛腹瀉程度明顯下降，臨床癥狀改善優(yōu)于單一治療組，推測(cè)中藥復(fù)方和牦牛源地衣芽孢桿菌之間在治療犢牛腹瀉的過(guò)程中可能存在協(xié)同作用。

3.3 自擬復(fù)方和地衣芽孢桿菌對(duì)腹瀉犢牛血清生化的影響

血清生化指標(biāo)能夠反映動(dòng)物機(jī)體生理機(jī)能及健康狀態(tài)。腹瀉導(dǎo)致的脫水、腸道功能障礙以及其他器官的病理變化會(huì)引起動(dòng)物生化指標(biāo)的異常變化，與疾病的發(fā)生發(fā)展和動(dòng)物機(jī)體的臨床狀況密切相關(guān)。

血清TP和ALB的升高常見(jiàn)于嚴(yán)重脫水性疾病，如腹瀉。研究表明[22-23]，腹瀉會(huì)引起血清TP和ALB水平顯著升高。在本研究中也得到了相似的結(jié)果，DC組犢牛血清TP和ALB水平顯著升高，可能是腹瀉引起機(jī)體嚴(yán)重脫水從而導(dǎo)致血清中TP和ALB的濃度升高。治療5 d后，治療組犢牛的血清TP和ALB水平相較于DC組顯著降低，并且TCM+BL組犢牛的血清TP和ALB水平更接近NC組水平。試驗(yàn)結(jié)果表明自擬中藥復(fù)方和牦牛源地衣芽孢桿菌可顯著降低腹瀉引起的血清TP和ALB濃度的升高，改善腹瀉犢牛的脫水程度，并且自擬復(fù)方和牦牛源地衣芽孢桿菌之間可能存在某種協(xié)同機(jī)制，聯(lián)合使用的效果要優(yōu)于單一效果。

血清中ALT、ALP和AST濃度的變化常見(jiàn)于一些肝臟疾病，當(dāng)肝臟發(fā)生炎癥或損傷時(shí)，血清中ALT、ALP和AST濃度會(huì)急劇升高[24]。本研究中，DC組犢牛血清中ALT、ALP和AST濃度顯著升高，提示可能是腹瀉或病毒感染等因素引起肝臟炎癥或損傷。秦楓等[25]研究表明由地錦草、石榴皮等組成中藥復(fù)方能有效保護(hù)大腸埃希氏菌感染引起的雛鴨肝臟損傷，降低血清ALT、ALP和AST水平。研究表明植物乳桿菌MYS6能改善伏馬毒素B1導(dǎo)致的肉雞肝損傷，顯著恢復(fù)血清ALT、ALP和AST的活性[26]。本試驗(yàn)中，TCM組、BL組和TCM+BL組犢牛相較于DC組血清ALT、ALP和AST的濃度顯著降低，與其他學(xué)者的研究結(jié)果一致，提示自擬復(fù)方和牦牛源地衣芽孢桿菌也具有保護(hù)肝臟的效果，能夠改善腹瀉或病原感染造成的肝功能損傷。

UREA是哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)分解代謝的終產(chǎn)物，主要由腎臟排泄，血清UREA偏高常見(jiàn)于腎功能障礙。本研究中，DC組犢牛血清UREA顯著偏高，可能是腹瀉或病毒感染引起腎臟損傷。TCM組、BL組和TCM+BL組犢牛的血清UREA濃度相較于DC組顯著偏低，表明自擬復(fù)方和牦牛源地衣芽孢桿菌可能具有保護(hù)腎臟改善腎功能的作用。

Ca、P、Mg等血清離子是機(jī)體新陳代謝過(guò)程中的重要元素，反映了機(jī)體代謝平衡和健康狀態(tài)，其變化可以反映骨組織的代謝情況和某些疾病變化[27,28]。本試驗(yàn)中，DC組犢牛血清離子水平顯著降低，可能是腹瀉導(dǎo)致消化系統(tǒng)功能障礙，腸道吸收功能下降，造成離子大量流失。與DC組相比，TCM組、BL組和TCM+BL組犢牛血清離子水平顯著升高，提示自擬復(fù)方和牦牛源地衣芽孢桿菌能調(diào)節(jié)腸道吸收功能，改善機(jī)體離子流失。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，場(chǎng)區(qū)犢牛腹瀉主要是BCoV和BRV感染導(dǎo)致。由干姜、白術(shù)、山藥等中草藥組成的復(fù)方和牦牛源地衣芽孢桿菌對(duì)犢牛腹瀉疾病有良好的治療效果，能減輕腹瀉的臨床癥狀，改善或恢復(fù)脫水等引起的血清生化指標(biāo)的變化。自擬中藥復(fù)方和牦牛源地衣芽孢桿菌之間可能存在某些協(xié)同機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。