間歇有氧運(yùn)動對大鼠心肌NOX4、ROS表達(dá)及血清相關(guān)氧化因子的影響

張偉超，邢維新

(麗江師范高等專科學(xué)校體育與健康學(xué)院，云南麗江 674199)

0 引言

氧化應(yīng)激是指機(jī)體接觸各種有害刺激時(shí)，體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)大量生成，造成機(jī)體損傷[1].NADPH氧化酶(NADPH oxidases，Noxs)是心血管系統(tǒng)中ROS的主要來源，NOX4是NADPH氧化酶的同源型之一，缺血心肌NOX4表達(dá)顯著增加，ROS產(chǎn)生增強(qiáng)，發(fā)揮心臟保護(hù)作用[2].乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)是糖酵解通路中的主要酶，可催化乳酸變成丙酮酸，參與主要器官的氧化反應(yīng)，引起機(jī)體的氧化應(yīng)激水平增加[3].丙二醛(Malonic dialdehyde, MDA)是細(xì)胞和組織過氧化最重要的產(chǎn)物之一，可反映組織過氧化損傷程度[4].超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)是脂質(zhì)過氧化誘導(dǎo)的自由基，是常測量的氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物之一[5].

近年來，有關(guān)運(yùn)動訓(xùn)練與氧化應(yīng)激相關(guān)研究已成為體育科學(xué)研究領(lǐng)域的一個重大熱點(diǎn)課題，引起了國內(nèi)外相關(guān)學(xué)者的高度關(guān)注.Ranjbar研究表明，中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動可降低心肌損傷，抑制氧化應(yīng)激，增加抗氧化防御系統(tǒng)，提升心功能[6].運(yùn)動訓(xùn)練對心肌ROS和NOX4表達(dá)及血清相關(guān)氧化因子的影響已有文獻(xiàn)報(bào)道.Bostick等研究表明，運(yùn)動可降低雌性肥胖小鼠血清LDH、MDA表達(dá)，增強(qiáng)SOD活性[7].米春娟研究證實(shí)，16周中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動可以降低心臟ROS表達(dá)[8].侯改霞研究發(fā)現(xiàn)，游泳可以降低2型糖尿病大鼠心臟NOX4表達(dá)[9].可見，目前國內(nèi)外對心肌氧化應(yīng)激相關(guān)研究主要集中在心血管疾病、糖尿病等動物模型中，且缺乏全面系統(tǒng)的文獻(xiàn)報(bào)道.本文運(yùn)用DHE活性氧熒光探針、生物化學(xué)法以及Western Blot等方法，全面系統(tǒng)地探討間歇有氧運(yùn)動對正常大鼠心肌NOX4、ROS表達(dá)以及血清相關(guān)氧化因子的影響，為運(yùn)動提升心功能的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)為運(yùn)動提升心功能運(yùn)動處方的研制提供實(shí)驗(yàn)參考.

1 材料與方法

1.1 主要儀器

Leica CM1950冰凍切片機(jī)、Epoch微量紫外分光光度計(jì)、ALC-V8動物呼吸機(jī)、PowerLab/8ST生物信號采集處理系統(tǒng)、LEICA-RM2126切片機(jī)、BMⅡ型病理組織包埋機(jī)、生物組織攤烤片機(jī)、ASB240U生物信號采集分析系統(tǒng)、BX51奧林巴斯光學(xué)顯微鏡、Nikon Eclipse55i熒光顯微鏡、低溫高速離心機(jī)、酶標(biāo)儀、Bio-rad電泳儀和轉(zhuǎn)移槽、凝膠成像系統(tǒng)、小動物跑臺等.

1.2 主要試劑

BCA蛋白定量試劑盒、MDA試劑盒、SOD試劑盒、LDH試劑盒(南京建成生物有限公司)、DHE活性氧熒光探針試劑盒(碧云天生物有限公司)、兔抗單克隆抗體NOX4(美國Abcam公司).

1.3 動物分組和運(yùn)動方案

1.3.1 動物分組 雄性3月齡清潔級SD大鼠20只(西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理中心)，體重180～220 g，健康狀況良好，國家嚙齒類動物標(biāo)準(zhǔn)喂養(yǎng)，相對濕度40%～50%，動物室內(nèi)溫度25～29 ℃，分每籠10只飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為C組和CE組.

1.3.2 運(yùn)動方案 運(yùn)動方案參考Wisloff訓(xùn)練模型略加改動[10].(1)CE組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后進(jìn)行跑臺運(yùn)動.第一周為適應(yīng)性訓(xùn)練(15 m/min，30 min/d，共5 d).正式訓(xùn)練時(shí)，起始訓(xùn)練速度10 m/min，時(shí)間為10 min.之后進(jìn)行間歇有氧運(yùn)動，速度為25 m/min，運(yùn)動7 min；后間歇3min，速度為15 m/min，依次交替進(jìn)行，每次運(yùn)動總時(shí)間為60 min.每周周一至周五訓(xùn)練，連續(xù)訓(xùn)練4周；(2)血流動力學(xué) 4周間歇有氧運(yùn)動訓(xùn)練結(jié)束后，次日上午9:00，采用多導(dǎo)生理記錄儀測試左室收縮壓(Left ventricular pressure, LVSP)、左室舒張末壓(Left ventricular systolic pressure, LVEDP)左室壓力最大上升速率(+dp/dtmax)和最大下降速率(-dp/dtmax)等心功能指標(biāo)；(3)取材、樣品制備.血流動力學(xué)檢測后，迅速開胸摘取心臟，置于10%中性甲醛溶液固定、常規(guī)酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片(厚度為5 μm)，用于HE染色.選取大鼠心臟，多聚甲醛固定，30%蔗糖溶液脫水后，OCT包埋用于冰凍切片.另取大鼠心臟置于-196 ℃液氮速凍后，-80 ℃冰箱保存待用，用于Western Blot實(shí)驗(yàn)；(4)Dihydroethidium(DHE)染色檢測ROS.取10%中性甲醛固定心肌組織，放于蔗糖溶液中，OCT包埋，冰凍切片，滴加DHE工作液，37 ℃避光，孵育30 min，封片，用熒光顯微鏡觀察結(jié)果，檢測心臟超氧陰離子水平；(5)生物化學(xué)法.采用紫外分光光度法測定心臟丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性，微量酶標(biāo)法測定乳酸脫氫酶(LDH)活力，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作程序進(jìn)行；(6)Western Blot 實(shí)驗(yàn).取心肌組織50 mg，加入預(yù)冷蛋白抽提試劑500 ul，剪碎勻漿，4 ℃離心，取上清液，BCA蛋白定量.常規(guī)制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，5%BSA室溫封閉1 h，孵育一抗NOX4(稀釋濃度1:2 000)，內(nèi)參GAPDH稀釋濃度(1:10 000)，4 ℃過夜.次日室溫復(fù)溫30 min后，室溫孵育二抗(1:8 000)1 h，TBST清洗，ECL發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)分析；(7)圖像處理與數(shù)據(jù)分析.光學(xué)顯微鏡拍攝圖像，經(jīng)Image-Pro Plus軟件處理并分析.所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行處理，采用One-Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)表示，組間顯著性差異水平為P<0.05和P<0.01，Graph Pad prism5.0軟件將有效數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換之后作圖.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果

圖1結(jié)果顯示，與C組比較，CE組大鼠心肌細(xì)胞排列緊密，結(jié)構(gòu)整齊.表明間歇運(yùn)動可以顯著改善大鼠心臟形態(tài)結(jié)構(gòu)(見圖1).

圖1 大鼠HE染色觀察結(jié)果(5 μm，x200)Fig.1 HE staining of rats (5μm, x200)

2.2 心功能測定結(jié)果

表1結(jié)果顯示，與C組比較，CE組大鼠LVEDP顯著降低(P<0.01)，LVSP和±dp/dtmax顯著升高(P<0.01)，表明間歇運(yùn)動可以顯著改善大鼠心功能.

表1 大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)變化(n=10)Tab.1 Changes of hemodynamic indexes in rats (n=10)

2.3 生物化學(xué)法結(jié)果

表2結(jié)果顯示，與C組比較，CE組MDA和LDH表達(dá)均顯著降低(分別為P<0.01，P<0.05)，SOD活性顯著升高(P<0.01).表明間歇運(yùn)動可降低大鼠心臟氧化應(yīng)激，顯著改善大鼠心功能.

表2 大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)變化Tab.2 Changes of oxidative stress indexes in rats

2.4 DHE染色結(jié)果

DHE染色結(jié)果顯示，與C組比較，CE組心肌組織中ROS水平降低，表明，間歇運(yùn)動可降低心肌組織氧化應(yīng)激水平(非彩圖，出不了效果，圖略).

2.5 大鼠心臟NOX4蛋白表達(dá)結(jié)果

Western Blot結(jié)果顯示，與C組比較，CE組大鼠心臟NOX4蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05).表明間歇運(yùn)動可抑制大鼠心臟NOX4蛋白表達(dá)，降低氧化應(yīng)激水平(見圖2).

圖2 大鼠心臟NOX4蛋白表達(dá)Fig.2 NOX4 protein expression in rat heart

3 分析與討論

3.1 間歇有氧運(yùn)動可對大鼠心臟形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能產(chǎn)生影響

目前研究認(rèn)為，運(yùn)動可顯著改善大鼠心肌的形態(tài)結(jié)構(gòu)，提升心功能[11-14].本文運(yùn)用HE染色觀察大鼠心臟形態(tài)結(jié)構(gòu)，血流動力學(xué)測定心臟功能，結(jié)果顯示，與C組比較，CE組大鼠心臟細(xì)胞排列緊密，結(jié)構(gòu)整齊，LVEDP顯著降低，LVSP和±dp/dtmax顯著升高.綜上，本文再次全面系統(tǒng)證實(shí)了間歇有氧運(yùn)動可顯著改善大鼠心臟結(jié)構(gòu)，提升心功能.

3.2 間歇有氧運(yùn)動對大鼠血清MDA、LDH、SOD的影響

氧化應(yīng)激是指機(jī)體接觸各種有害刺激時(shí)，體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，活性氧大量生成，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞炎性浸潤，蛋白酶分泌增加，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物，造成機(jī)體損傷[15].LDH是一種糖酵解酶，廣泛分布于肝臟、心臟、骨骼肌腎臟等組織細(xì)胞，可催化丙酮酸接受由3-磷酸甘油醛脫氫酶形成的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的氫，形成乳酸，發(fā)生氧化反應(yīng).研究表明，LDH可催化乳酸變成丙酮酸參與主要器官的氧化反應(yīng)，引起機(jī)體的氧化應(yīng)激水平增加，機(jī)體功能下降[16].Wenjuan Wei研究證實(shí)，在心肌缺血再灌注損傷模型中，LDH表達(dá)顯著增加，氧化應(yīng)激水平升高，進(jìn)而造成心肌損傷，心功能下降[17].MDA是脂質(zhì)過氧化誘導(dǎo)的自由基，是常測量的氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物之一，其含量是反映機(jī)體抗氧化潛在能力的重要參數(shù)，亦可反映組織過氧化損傷程度[4].劉派研究證實(shí)，MDA升高，氧化應(yīng)激增加，產(chǎn)生過氧化反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致心肌細(xì)胞的損傷，并形成脂質(zhì)過氧化物，對機(jī)體造成嚴(yán)重?fù)p害[18].SOD是一種源于生命體的活性物質(zhì)，廣泛分布于動物和植物體內(nèi)，具有特殊的生理活性，極強(qiáng)的氧化能力，能消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，對抗阻斷因氧自由基對細(xì)胞造成的損害[5].張藝瀧研究證實(shí)，SOD活性增加，氧化應(yīng)激水平降低，可抑制大鼠癲癇狀態(tài)[19].研究發(fā)現(xiàn)，增加MDA含量，降低SOD活性，可以導(dǎo)致氧化應(yīng)激增加，損傷小鼠心臟功能[20].另有研究表明，心肌細(xì)胞受損時(shí)，LDH和MDA水平顯著升高，SOD活性降低，抗氧化水平降低[21-22].

有關(guān)運(yùn)動與心肌氧化應(yīng)激的研究已有文獻(xiàn)報(bào)道.研究顯示，過度訓(xùn)練、大強(qiáng)度運(yùn)動心肌組織LDH和MDA表達(dá)顯著升高，SOD活性降低，氧化應(yīng)激水平增加[23-24].上述研究結(jié)果表明，大強(qiáng)度運(yùn)動氧化應(yīng)激增加，損傷心肌細(xì)胞.本研究結(jié)果顯示，與C組相比，CE組LDH和MDA表達(dá)降低，SOD活性增加，表明間歇有氧運(yùn)動可降低正常大鼠氧化應(yīng)激水平，減少心肌損傷，改善心功能.

3.3 間歇有氧運(yùn)動對大鼠心肌NOX4、ROS表達(dá)的影響

NADPH氧化酶(NOXs)是產(chǎn)生ROS的主要來源，有7個同源物，即NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1和DUOX2，其中NOX4型主要在心臟中高表達(dá).NOX4可產(chǎn)生ROS，能催化氧還原為超氧化物，清除病原微生物，在氧化應(yīng)激導(dǎo)致的心血管疾病、腎臟疾病中發(fā)揮重要作用[25].研究發(fā)現(xiàn)，在正常生理情況下，來源于NOX4的少量ROS在氧化還原信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮第二信使作用，以維持體內(nèi)氧化還原反應(yīng)的平衡[22]，但在高強(qiáng)度運(yùn)動、心肌梗死、糖尿病、高血壓、缺氧等病理情況下，NOX4表達(dá)上調(diào)，催化產(chǎn)生大量ROS，破壞了體內(nèi)氧化還原反應(yīng)的平衡，從而導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激，最終導(dǎo)致組織器官損傷[26-28].研究證實(shí)，心梗后NOX4上調(diào)表達(dá)，誘發(fā)氧化應(yīng)激，損傷心功能[29].研究表明，有氧運(yùn)動可以降低2型糖尿病大鼠心肌NOX4的表達(dá)，從而減輕2型糖尿病大鼠心肌氧化應(yīng)激水平[30].本研究結(jié)果顯示，與C組相比，CE組NOX4表達(dá)顯著降低，間歇有氧運(yùn)動可以降低正常大鼠心肌NOX4表達(dá)，表明間歇運(yùn)動可降低大鼠心肌氧化應(yīng)激水平，保護(hù)心功能.

ROS是指氧的某些代謝產(chǎn)物和一些反應(yīng)的含氧產(chǎn)物，由氧形成、含氧而且性質(zhì)活潑的一些物質(zhì)的總稱，包括超氧陰離子自由基(O2·-)和羥基自由基(·OH)以及非自由基氧化劑過氧化氫(H2O2)和單線態(tài)氧(1O2)等[31].研究表明，ROS的主要作用一方面是調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激，引發(fā)多種細(xì)胞反應(yīng)，優(yōu)化異常線粒體和細(xì)胞的清除，以保護(hù)損傷擴(kuò)散到鄰近的線粒體、細(xì)胞和組織[32-33].另一方面，ROS不受管制的氧化和還原應(yīng)激，可迅速激活氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞損傷和細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致整個器官和有機(jī)體衰竭[34-35].研究發(fā)現(xiàn)，大強(qiáng)度運(yùn)動后缺血缺氧，導(dǎo)致心臟局部氧化應(yīng)激水平增加，ROS水平增多，心肌細(xì)胞損傷加重，誘導(dǎo)炎性因子水平增加，導(dǎo)致左心室擴(kuò)張，心肌組織惡性重塑，心功能下降[36-37].有研究報(bào)道，有氧運(yùn)動訓(xùn)練可降低心梗心臟中NOX4活性和ROS的水平，減少氧化應(yīng)激[38-39].結(jié)果表明，大強(qiáng)度運(yùn)動誘導(dǎo)了梗死區(qū)氧化應(yīng)激水平增加，間歇運(yùn)動可顯著抑制氧化應(yīng)激，改善大鼠心功能.本研究結(jié)果顯示，與C組相比，CE組大鼠心肌中ROS水平顯著降低，表明間歇運(yùn)動可顯著降低大正常鼠心肌ROS水平，保護(hù)心功能.

綜上，NOX4是ROS主要來源，在缺血缺氧、心梗、高血壓、糖尿病以及過度運(yùn)動、大強(qiáng)度運(yùn)動條件下，NOX4表達(dá)升高，ROS增強(qiáng)，氧化應(yīng)激增加，造成機(jī)體功能下降.間歇有氧運(yùn)動可以顯著降低大鼠心肌NOX4和ROS表達(dá)，降低氧化應(yīng)激，推測間歇有氧運(yùn)動可能通過下調(diào)大鼠心肌NOX4和ROS表達(dá)，降低氧化應(yīng)激，改善心功能.

4 結(jié)論

間歇有氧運(yùn)動可顯著改善大鼠心臟形態(tài)結(jié)構(gòu)，提升大鼠心功能；間歇有氧運(yùn)動可使大鼠血清MDA、LDH的含量顯著降低，SOD活性顯著增強(qiáng)，心肌NOX4和ROS表達(dá)顯著降低，進(jìn)而降低大鼠心臟氧化應(yīng)激水平，改善大鼠心功能.