墨西哥落羽杉扦插繁殖與生根機(jī)制研究

吳利雪 常麗娜 馮 緣 郭金慶 孫 明

（北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院/花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點(diǎn)試驗(yàn)室/國家花卉工程技術(shù)研究中心 北京 100083）

墨西哥落羽杉（Taxodium mucronatum）為杉科落羽杉屬樹種，主要分布于我國長江以南各省份。近年來人們對(duì)于濱水綠化樹種越來越重視，墨西哥落羽杉作為南方典型的彩葉濱水樹種，在園林景觀中具有廣泛的生態(tài)價(jià)值和應(yīng)用前景。而且因其生長速度快、觀賞價(jià)值高、耐低溫、耐水濕、耐鹽堿及抗病蟲害等優(yōu)點(diǎn)，兼具生態(tài)價(jià)值和工業(yè)利用價(jià)值[1]。因此，推廣并規(guī)模化繁殖墨西哥落羽杉，不僅可以滿足建設(shè)低碳園林的要求，而且可以彌補(bǔ)北方地區(qū)濱水景觀色彩單一的不足，應(yīng)用前景十分廣泛。

目前墨西哥落羽杉的繁殖主要利用傳統(tǒng)的播種繁殖和嫁接育苗等繁殖方法，但這2種繁殖方法存在效率低，且因難以保持親本優(yōu)良性狀等問題，嚴(yán)重影響了落羽杉的工廠化繁殖。扦插繁殖技術(shù)繁殖效率高，扦插材料充足，能夠滿足大批量的生產(chǎn)。相關(guān)學(xué)者對(duì)墨西哥落羽杉扦插繁殖技術(shù)進(jìn)行了試驗(yàn)研究，但是對(duì)其生根機(jī)制的研究較少[2-3]。因此立足于生產(chǎn)實(shí)際的需要，本研究深入探討植物生長調(diào)節(jié)劑等因素對(duì)墨西哥落羽杉扦插生根的影響，并對(duì)扦插過程中墨西哥落羽杉內(nèi)源激素及氧化酶活性的變化進(jìn)行觀察與檢測，明確其與愈傷組織誘導(dǎo)、不定根形成之間的響應(yīng)機(jī)制及相關(guān)性，進(jìn)一步篩選出能夠促進(jìn)墨西哥落羽杉插穗生根的激素處理組合，為其高效率繁殖的關(guān)鍵技術(shù)提供理論依據(jù)，也為北方地區(qū)墨西哥落羽杉規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于濟(jì)南市長清區(qū)農(nóng)業(yè)園基地的溫室（36°38′12″N，116°46′50″E），氣候類型為溫帶季風(fēng)氣候。試驗(yàn)于基地溫室內(nèi)搭建的小拱棚內(nèi)進(jìn)行，棚內(nèi)扦插池為長方形，插床長約8 m、寬約2.5 m、高0.5 m。棚膜上方架設(shè)遮光率為80%的遮陽網(wǎng)，鋪設(shè)地?zé)峋€并設(shè)置自動(dòng)噴霧設(shè)備，給排水正常。空氣濕度控制在90%～95%，氣溫控制在30～35°C。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在2020年6月中旬采集當(dāng)年生枝條為插穗，長度8~12 cm。將制作好的插穗扦插在草炭∶珍珠巖為3∶7的基質(zhì)中[2]。本試驗(yàn)采用3因素3水平L9（34）進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共設(shè)置9個(gè)處理組和1個(gè)清水對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)處理120根插穗（表1）。本試驗(yàn)用清水作為對(duì)照。扦插后每隔5 d隨機(jī)拔出5根試驗(yàn)苗，拍照觀察愈傷組織生長及生根情況，取有代表性的切片在顯微鏡下觀察、拍照并記錄，并測量與比較各處理中插穗內(nèi)源激素與酶活性的變化。

表1 植物生長調(diào)節(jié)劑處理正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3 插后管理

扦插當(dāng)天充分澆灌插床，為減少水分散失，前期密閉棚膜保濕。之后每周噴施1次50%多菌靈可濕性粉劑800倍液對(duì)插床及插穗殺菌消毒，及時(shí)清理腐爛、死亡的插穗。安裝溫濕度計(jì)，實(shí)時(shí)監(jiān)測棚內(nèi)溫濕度。

1.4 測定方法

1.4.1 形態(tài)觀察扦插后每隔5 d將破壞性試驗(yàn)苗隨機(jī)拔出5根，觀察愈傷組織生長及生根情況。

1.4.2 生根指標(biāo)測定在各扦插試驗(yàn)后每周觀察記錄生根進(jìn)程，并在扦插60 d后統(tǒng)計(jì)以下生根指標(biāo)[4]。

1.4.3 生理指標(biāo)測定以正交試驗(yàn)篩選出的最優(yōu)組合作為試驗(yàn)組，設(shè)立清水對(duì)照，采用完全隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)，各處理均保持在條件相對(duì)一致的環(huán)境中。自扦插日起60 d內(nèi)每隔10 d進(jìn)行取樣，每次取樣5根，取樣時(shí)間為上午8:00-9:30。每次取樣后立即清洗插穗，截取基部2 cm處的韌皮部，用液氮速凍后于超低溫冰箱（-80℃）中保存?zhèn)溆谩?/p>

對(duì)保留的整株樣本采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定內(nèi)源激素IAA、ABA和ZR的含量，分別采用愈創(chuàng)木酚法和氮藍(lán)四唑光還原法來測定過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性[5-6]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與表格制作，使用SPSS21.0軟件進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 墨西哥落羽杉插穗生根形態(tài)學(xué)觀察

2.1.1 插穗生根類型分析由圖1可知，墨西哥落羽杉插穗有2種生根類型，即愈傷組織生根型和皮部生根型。不同處理對(duì)生根類型的影響差異顯著，經(jīng)GGR處理的插穗，生根情況明顯優(yōu)于對(duì)照組處理，并且這些生根插穗中，愈傷組織生根型占74.13%，皮部生根型僅占12.35%。由此可知，墨西哥落羽杉以愈傷組織生根型為主，生根難度較大，這與同屬樹種中山杉的研究結(jié)果一致[7]。

圖1 墨西哥落羽杉扦插生根類型

2.1.2 扦插生根過程分析通過跟蹤觀察墨西哥落羽杉插穗扦插過程中的形態(tài)變化，將扦插生根過程分為4個(gè)階段：①愈傷組織形成期。在扦插后10~20 d插穗基部的切口處開始膨大，皮部出現(xiàn)白色半透明狀的膨大部分；扦插后20~30 d，在基部5 mm的范圍內(nèi)出現(xiàn)了白色點(diǎn)狀凸起。②根原基誘導(dǎo)期。扦插后30~40 d愈傷組織的數(shù)量繼續(xù)增加，連接成環(huán)，并有部分插穗的愈傷組織開始形成不定根。③不定根形成期。扦插后40~50 d，大部分插穗開始形成不定根。④不定根伸長期。扦插后50~60 d，不定根的根系增長增粗，并且有一部分插穗生成側(cè)根。

2.2 不同處理下墨西哥落羽杉扦插生根的情況

由表2可知，不同處理對(duì)插穗的各項(xiàng)生根指標(biāo)均達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。進(jìn)一步對(duì)不同處理間生長性狀進(jìn)行比較，結(jié)果表明，處理后的插穗全部生根，其中處理3的生根率最高，達(dá)92.80%，產(chǎn)生的不定根數(shù)最多，為6.33條/株，根系效果指數(shù)最大，為0.87。處理5的插穗生根效果最差，生根率僅為42.38%。同時(shí)，生長調(diào)節(jié)劑也影響根的長度，以處理8的平均根長最長，為4.17 cm（表3）。

表2 不同處理組合對(duì)墨西哥落羽杉插穗生根影響的方差分析

表3 不同處理組合對(duì)墨西哥落羽杉插穗生根的影響

圖3 各因素對(duì)墨西哥落羽杉扦插平均根長的極差分析

比較3個(gè)因素對(duì)各項(xiàng)生根指標(biāo)的極差可知（圖2~圖5），3個(gè)因素的主次關(guān)系為激素種類（A）>激素濃度（B）>浸泡時(shí)間（C）。從各因素水平對(duì)生根率的影響方面分析，扦插處理最優(yōu)組合為A1B3C3；從對(duì)平均根長的影響方面分析，扦插處理最優(yōu)組合為A1B2C1；從對(duì)平均根數(shù)的影響方面分析，扦插處理最優(yōu)組合為A3B3C3；從對(duì)根系效果的影響方面分析，扦插處理最優(yōu)組合為A1B3C3。綜合比較，可以確定墨西哥落羽杉嫩枝扦插優(yōu)化體系為A1B3C3，即取半木質(zhì)化插穗為試驗(yàn)材料，用2 000 mg/L的GGR處理插穗30 s為最優(yōu)生根組合。

圖2 各因素對(duì)墨西哥落羽杉扦插生根率的極差分析

圖4 各因素對(duì)墨西哥落羽杉扦插平均根數(shù)的極差分析

圖5 各因素對(duì)墨西哥落羽杉扦插根系效果的極差分析

2.3 生根過程中內(nèi)源激素含量變化

在生根過程中，內(nèi)源激素的變化趨勢與不定根的誘導(dǎo)和形成等關(guān)鍵時(shí)期有著同頻共振的關(guān)系。因此，將上述試驗(yàn)所得到最優(yōu)的植物生長激素處理組合（GGR）和對(duì)照（CK）處理下的插穗在不同時(shí)期植物的內(nèi)源激素的差異以及變化規(guī)律進(jìn)行了比較。由圖6可知，處理組和對(duì)照組插穗IAA的含量都是先升高后下降。其中處理組和對(duì)照組在愈傷組織形成階段（扦插后30 d）和根原基誘導(dǎo)階段（扦插后40 d）一直處于上升狀態(tài)，且處理組在根原基誘導(dǎo)階段（扦插后40 d）結(jié)束時(shí)含量最高，隨后IAA含量明顯下降。而對(duì)照組變化則相對(duì)滯后，在不定根形成期（扦插后50 d）才達(dá)到最大值，于不定根伸長階段（扦插后60 d）不斷下降。而且在不同時(shí)期，處理組IAA含量均明顯高于對(duì)照組的含量。不同處理下ABA含量呈現(xiàn)先下降再升高最后下降的趨勢，而且不同時(shí)期對(duì)照組插穗ABA含量均大于處理組，在愈傷組織形成階段兩者差異達(dá)到最大（圖7）。在根原基形成及不定根形成階段，ABA含量不斷下降。與前2種激素變化趨勢不同的是，處理組和對(duì)照組中的ZR含量為先下降后上升的趨勢（圖8）。處理組在愈傷組織形成時(shí)期（扦插后30 d）含量達(dá)到最低，之后ZR含量開始回升。在不定根形成及伸長階段，處理組中ZR的含量明顯低于對(duì)照組，在不定根形成階段差異最為顯著。

圖6 GGR對(duì)墨西哥落羽杉扦插生根過程內(nèi)源激素IAA的影響

圖7 GGR對(duì)墨西哥落羽杉扦插生根過程內(nèi)源激素ABA的影響

圖8 GGR對(duì)墨西哥落羽杉扦插生根過程內(nèi)源激素ZR的影響

2.4 生根過程中氧化酶含量變化

2.4.1 SOD活性的變化由圖9可知，對(duì)照組與處理組插穗內(nèi)SOD的活性變化曲線大致相同，均是先上升后下降。在愈傷組織形成期（扦插后30 d）和根原基誘導(dǎo)期（扦插后40 d），SOD活性逐漸上升，并在不定根形成期（扦插后50 d）達(dá)到最高水平。待不定根形成后，SOD活性有所下降?？偟膩砜?，處理組插穗SOD活性均明顯高于對(duì)照組。

圖9 GGR對(duì)墨西哥落羽杉扦插生根過程中SOD活性的影響

2.4.2 POD活性的變化不同處理下插穗生根過程中的POD活性整體呈先升高后降低的變化趨勢（圖10）。在愈傷組織形成階段（扦插后30 d），經(jīng)過GGR處理的插穗的POD活性雖然處于下降趨勢，但是含量明顯高于CK處理。隨后在根原基形成期（扦插后40 d）活性不斷上升并達(dá)到峰值，但在不定根形成及伸長階段開始下降。而處理組的插穗，POD活性在不定根形成前不斷上升，在不定根形成期達(dá)到最高水平，之后逐漸降低。整體來看，在根原基形成前處理組插穗POD的活性要明顯優(yōu)于對(duì)照組。但在不定根形成期，POD活性下降的速度較對(duì)照組插穗更快。

圖10 GGR對(duì)墨西哥落羽杉扦插生根過程中POD活性的影響

3 討論與結(jié)論

3.1 植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)墨西哥落羽杉扦插生根的影響

不定根的形成是植物營養(yǎng)繁殖的重要步驟。這是一個(gè)復(fù)雜的過程，受多種內(nèi)源性如生長調(diào)節(jié)劑的內(nèi)穩(wěn)態(tài)、酚類化合物的水平、酶活性及外源性因素的影響，包括營養(yǎng)狀況、相關(guān)應(yīng)激反應(yīng)、生物相互作用和遺傳特征等[8]。植物生長調(diào)節(jié)劑在促進(jìn)植物插穗生根方面有著重要作用，不僅可以調(diào)動(dòng)內(nèi)源激素的變化，還可加快植物營養(yǎng)物質(zhì)代謝的速度并加大其強(qiáng)度，從而能夠促進(jìn)插穗不定根的分化與形成[9-11]。多項(xiàng)研究表明[13-15]，相比于NAA、IAA等單一植物激素，ABT作為一種混合的植物生長調(diào)節(jié)劑能夠多樣地補(bǔ)充植物生根過程中所需要的激素，這與本試驗(yàn)研究結(jié)果相似。與ABT生根粉不同的是，GGR屬于非激素型的生理活性物質(zhì)，植物經(jīng)GGR處理后更易生根，生根生長進(jìn)程更快[16]。這可能是因?yàn)镚GR中的NAA和IAA的含量比例調(diào)配更加有利于植株的生長發(fā)育[17-18]。除植物生長調(diào)節(jié)劑種類外，其濃度和浸泡的時(shí)間都會(huì)對(duì)植物扦插生根產(chǎn)生極大的影響。陳寒蕾等的研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度生長素均可促進(jìn)菜桑和果桑的生長；郭其強(qiáng)等的研究發(fā)現(xiàn)，2種西藏柏樹插穗的生根對(duì)不同濃度的生長素和浸泡時(shí)間的影響明顯，這與本試驗(yàn)研究結(jié)果相同。

3.2 植物內(nèi)源激素變化對(duì)墨西哥落羽杉扦插生根的影響

植物內(nèi)源激素調(diào)控著植物的發(fā)育過程，影響著植物的生長變化。莖生根受內(nèi)源激素代謝的密切調(diào)節(jié)，其中內(nèi)源激素包括IAA、ZR和ABA。IAA和ZR促進(jìn)根形成，而ABA抑制根形成[9-10]。在本研究中，處理組的IAA含量在整個(gè)過程中都高于對(duì)照組，證實(shí)了外源激素具有增加內(nèi)源性激素調(diào)節(jié)能力的作用。GGR處理后的插穗在不定根形成與伸長階段ZR的含量都明顯低于對(duì)照組，這與ZR促進(jìn)根的形成相矛盾。這可能是因?yàn)槟鞲缏溆鹕紝?duì)GGR比較敏感，對(duì)GGR表現(xiàn)為高抑低促的現(xiàn)象[19]。此外Kuroha等也有類似的發(fā)現(xiàn)，ZR對(duì)黃瓜（Cucumis sativus）下胚軸的不定根的形成具有負(fù)調(diào)節(jié)作用。當(dāng)黃瓜的根被切斷時(shí)，ZR水平會(huì)迅速下降，同時(shí)生長素積累會(huì)發(fā)生在被切斷的下胚軸或莖的基部，導(dǎo)致ARS的形成[20]。此研究結(jié)果可以解釋本研究中不同生長階段ZR含量的變化趨勢。GGR處理后的插穗在整個(gè)生根過程中，處理組ABA含量幾乎都低于對(duì)照組，可見低水平的ABA有利于插穗不定根的形成，這與前人的研究結(jié)果相似，認(rèn)為ABA不僅抑制IAA的合成和極性運(yùn)輸，而且阻止IAA從結(jié)合態(tài)釋放到游離態(tài)，從而抑制不定根的形成[21-22]。因此，GGR通過抑制ABA合成來增加IAA水平顯然是促進(jìn)根系形成的有效途徑。除ABA的峰值早于不定根的萌發(fā)外，IAA和ZR達(dá)到峰值的時(shí)間與不定根的萌發(fā)時(shí)間（扦插后40 d）同步，這可以解釋為ZR在不定根萌發(fā)的早期發(fā)揮作用。由這些結(jié)果可得出，外源性激素GGR通過動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)各內(nèi)源激素的含量，加速了墨西哥落羽杉內(nèi)源性激素的調(diào)節(jié)過程，從而增強(qiáng)了墨西哥落羽杉的生根能力[23-24]。

3.3 氧化酶活性變化對(duì)墨西哥落羽杉扦插生根的影響

植物生長調(diào)節(jié)劑能夠促進(jìn)插穗內(nèi)酶的活性，提高植物的分化與再生的能力。其中，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）是與植物扦插生根關(guān)系密切的2種氧化酶類。SOD的活性是植物插穗對(duì)抗外界傷害能力的指標(biāo)之一，對(duì)于植物根系的形成和發(fā)育不但有促進(jìn)作用，而且能夠縮短整個(gè)生根過程的時(shí)間[25-26]。本研究中GGR處理組SOD的活性始終高于對(duì)照組，說明墨西哥落羽杉在生根過程需要高濃度的SOD，這可能也是其難生根的主要因素之一。本研究中，處理組POD活性在愈傷組織形成階段始終高于對(duì)照組，是因?yàn)楦逷OD活性有利于降解不利于愈傷形成的IAA[27-28]。相反，在不定根形成與伸長階段對(duì)照組POD活性高于處理組，是為了減少IAA的消耗，從而能促進(jìn)根的生長和伸長。

本試驗(yàn)首先研究了植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)墨西哥落羽杉生根的影響，最終墨西哥落羽杉的生根率可達(dá)到92.8%，較之前張春英等的研究提高了6.8%[3]。觀察墨西哥落羽杉的生根過程后，用顯微鏡觀察根系的解剖結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其屬于愈傷組織生根型。同時(shí)發(fā)現(xiàn)植物生長調(diào)節(jié)劑GGR可以動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)內(nèi)源激素及酶的活性，使其相互協(xié)作而處在有利于墨西哥落羽杉生根的動(dòng)態(tài)平衡中。