小麥花藥漂浮培養(yǎng)技術(shù)

劉寧濤 趙遠(yuǎn)玲 車京玉 張起昌 田超 尹雪巍 代麗婷 邵立剛

（1 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院克山分院，齊齊哈爾161005，2 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物資源研究所，哈爾濱 150081）

小麥花藥培養(yǎng)是一項快速、有效穩(wěn)定育種材料的技術(shù)，具有穩(wěn)定雜種性狀、縮短育種年限、選擇效率高等優(yōu)點[1-2]，也是產(chǎn)生單倍體材料的主要方法之一。圍繞小麥花藥培養(yǎng)過程中供體材料的基因型、培養(yǎng)基、愈傷組織誘導(dǎo)、綠苗分化及染色體加倍技術(shù)中效率低的問題，科學(xué)家們開展了大量的研究使得小麥花藥培養(yǎng)效率得到一定的提高，同時也相繼育成了京花1 號、Florida、花培5 號、花培28 號、豫麥37、寧春50 等小麥品種應(yīng)用于生產(chǎn)[3-5]。然而供體材料的基因型仍然是影響花藥培養(yǎng)的主要因素[6-8]，在配制雜交組合的過程中需選擇培養(yǎng)能力強(qiáng)的材料作為親本，以減少花培對基因型的依賴，提高培養(yǎng)效率，除此之外培養(yǎng)基、激素配比、培養(yǎng)條件、碳源等也是影響花藥培養(yǎng)的關(guān)鍵因素。最新研究成果表明麥芽糖作為碳源能夠形成胚狀體并進(jìn)一步再生植株，且能夠有效減少白化苗的再生[9]。在花藥培養(yǎng)方式方面的研究也表明浸潤式培養(yǎng)、液體培養(yǎng)方式[10]能夠得到更多的愈傷組織和綠苗，說明利用液體培養(yǎng)能夠有效地提高小麥花藥培養(yǎng)效率。周迪等[11]引進(jìn)匈牙利小麥液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基W14-F，對人工合成小麥和普通小麥F1花藥培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)研究，發(fā)現(xiàn)該培養(yǎng)基在愈傷組織誘導(dǎo)率方面明顯高于國內(nèi)普遍應(yīng)用的C17、N6 和1/2 MS 培養(yǎng)基。

本實驗室采用匈牙利小麥育種家Pauk Janos 花藥漂浮培養(yǎng)技術(shù)[12]，并在其基礎(chǔ)上簡化了生根培養(yǎng)、優(yōu)化了預(yù)處理等環(huán)節(jié)，愈傷組織產(chǎn)出明顯提高，同時2021 年加倍率達(dá)到了64.6%，大幅度提高了小麥花藥培養(yǎng)的效率。為了更好地促進(jìn)我國小麥花藥培養(yǎng)育種技術(shù)，對實驗室運用的小麥花藥漂浮培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行梳理，期望能夠為國內(nèi)利用小麥花藥培養(yǎng)技術(shù)開展單倍體選擇的育種者們提供參考。

1 花藥培養(yǎng)基配制

小麥花藥愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為W14-F，再生培養(yǎng)基為190-2Cu，具體配方見表1。

表1 小麥花藥誘導(dǎo)、分化、生根培養(yǎng)基配方

W14-F 誘導(dǎo)漂浮培養(yǎng)基配制完成后分裝于培養(yǎng)皿中，每皿分裝液體培養(yǎng)基12mL，用封口膜封口后滅菌，備用。190-2Cu 分化培養(yǎng)基為固體培養(yǎng)基，分裝于直徑為9cm 的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中10mL 培養(yǎng)基，滅菌備用。培養(yǎng)基pH 值為5.8。

2 花藥培養(yǎng)步驟[14]

2.1 外植體選擇與預(yù)處理外植體選擇 選擇F2重點組合作為外植體進(jìn)行花藥培養(yǎng)。外植體取材與預(yù)處理 取大田種植的健壯植株，用顯微鏡進(jìn)行鏡檢，選擇小孢子發(fā)育正處于單核靠邊期的幼穗最佳；形態(tài)學(xué)上一般表現(xiàn)為幼穗頂部處于旗葉與旗葉葉耳1/3～2/3 處的植株，用剪刀沿著莖部斜口剪斷，每個組合取20～30 穗，并用橡皮筋捆成一捆，寫好標(biāo)簽，后放入裝有自來水的小桶中，盡快帶回實驗室。用塑料密封袋密封后置于4℃冰箱內(nèi)低溫處理3d。外植體滅菌 接種之前將幼穗剝出后放入血清瓶中，加入一定量的消毒液（次氯酸鈉和無菌水比例為1∶1），并加入2 滴土溫80，水平方向放至搖床上震蕩20min。血清瓶用75%的乙醇擦拭消毒后放入超凈工作臺中，倒出消毒液，后用無菌水沖洗幼穗3～4 次，直到瓶內(nèi)不再產(chǎn)生泡沫為止。

2.2 誘導(dǎo)方法接花藥手部用75%乙醇消毒晾干后取已高壓滅菌的小鑷子一把，蘸取75%的乙醇再用酒精燈外焰烤火滅菌，之后放旁邊冷卻備用。接花藥時用左手夾住已滅菌的幼穗，用小鑷子去掉穎殼剝出花藥，放置于培養(yǎng)基上。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)將取出的小麥花藥放入裝有誘導(dǎo)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中（直徑9cm），每個培養(yǎng)皿中約300 個花藥，接種完成后需用封口膜及時密封。把密封好的培養(yǎng)皿放入恒溫培養(yǎng)箱中，在32℃下暗培養(yǎng)3d，再轉(zhuǎn)入28℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)50～60d。愈傷組織分化培養(yǎng) 當(dāng)愈傷組織形成后，直徑1～2mm 時，及時在無菌環(huán)境下將愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱條件為25±1℃、16h 光照培養(yǎng)，光強(qiáng)2000～3000Lx，8h 暗培養(yǎng)，30d 左右會出現(xiàn)綠苗。

2.3 花藥培養(yǎng)加倍技術(shù)綠苗出現(xiàn)2～3 片綠葉時，轉(zhuǎn)入盆栽，待新根生長健壯后移到溫室內(nèi)煉苗3～4d，后移栽到花盆中。

2.3.1 化學(xué)藥劑加倍法分蘗期將單倍體綠苗根部用自來水沖洗干凈，剪去根尖留約2cm 左右，根部浸入含有0.2%秋水仙堿+2%DMSO（二甲基亞砜）的溶液中5h，隨后用自來水沖洗過夜、移栽，保持高濕環(huán)境下16h 光照，白天溫度18℃，晚上15℃，約2周出現(xiàn)新分蘗后正常管理。

2.3.2 自然加倍法綠苗出現(xiàn)分蘗時給予適當(dāng)?shù)牡蜏孛{迫約6 周，弱光條件下能夠?qū)崿F(xiàn)部分植株自然加倍。

3 花藥培養(yǎng)技術(shù)注意事項

（1）在選擇花藥培養(yǎng)組合時，其親本之一應(yīng)具有強(qiáng)培養(yǎng)力且一般配合力高，以減少花培材料對基因型的依賴，進(jìn)而提高花藥培養(yǎng)的效率。（2）多數(shù)情況下研究者們選擇F1組合材料進(jìn)行花藥培養(yǎng)。匈牙利小麥花藥培養(yǎng)過程中在F1對主要流行性病害等不利性狀進(jìn)行一次淘汰，選擇F2植株進(jìn)行花藥培養(yǎng)，這樣獲得的植株更加接近育種目標(biāo)，這一點值得我們借鑒。（3）花藥培養(yǎng)過程中的污染問題。在進(jìn)行花藥培養(yǎng)之前需要對培養(yǎng)室環(huán)境進(jìn)行徹底消毒，同時要重視對外植體材料和器皿的消毒，也可以在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中適當(dāng)加入一些抗生素，降低花藥培養(yǎng)過程中污染率。另外，匈牙利的漂浮誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入了Ficoll（一種聚蔗糖），對于污染有一定的抑制作用，其作用有待于進(jìn)一步研究。（4）外植體預(yù)處理時要注意密封性，并保持一定的濕度，防止外植體材料水分散失；恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)期間也需保持一定濕度；綠苗移栽中也一定要保持濕度，提高幼苗的成活率。（5）經(jīng)誘導(dǎo)形成的愈傷組織直徑達(dá)到1～2mm 時及時轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中進(jìn)行再培養(yǎng)，直徑超過2mm，其再生能力會有所下降。（6）花藥培養(yǎng)過程中盡量多接種花藥，構(gòu)建大量的基礎(chǔ)群體，以便于能夠獲得較多的理想植株。