多樣性混合間栽對水稻根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與功能的影響

唐文強(qiáng) 張文龍 朱曉喬 董必正 李勇成 楊 楠 張 耀 王云月,* 韓光煜,*

多樣性混合間栽對水稻根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與功能的影響

唐文強(qiáng)1,**張文龍1,**朱曉喬1董必正1李勇成2楊 楠1張 耀2王云月1,*韓光煜1,*

1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性與病蟲害控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 云南生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 云南昆明 650201;2紅河州農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 云南蒙自 661100

為了明確水稻多樣性混合間栽對稻瘟病防治及根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能的影響, 利用Illumina Hiseq測序技術(shù), 對篩選的高防治效果(E=54.48%)組合(汕優(yōu)63||黃殼糯)和低防治效果(E=14.12%)組合(合系39||黃殼糯)分別在間栽和凈栽下進(jìn)行水稻根際土壤細(xì)菌16S rRNA測序分析。結(jié)果表明, 多樣性間栽系統(tǒng)中水稻根際共檢測到土壤細(xì)菌37門116綱244目384科689屬, 綠彎菌門(Chloroflexi)、變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteriota)為主要細(xì)菌優(yōu)勢類群, 相對豐度均在15%以上。Alpha多樣性分析顯示, 高防效組合在間栽條件下可顯著提高水稻根際細(xì)菌群落香農(nóng)指數(shù)和Chao1指數(shù)(<0.05), 而低防效組合無差異(>0.05)。ANOSIM及PCoA分析發(fā)現(xiàn), 凈栽條件下各品種根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著(= 0.48,<0.01), 間栽后高防效組合和低防效組合根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)無顯著差異(>0.05), 即間栽增加了組配品種間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相似性。細(xì)菌優(yōu)勢類群組成結(jié)果表明, 與凈栽相比高防效組合中汕優(yōu)63根際中酸桿菌門(Acidobacteriota)相對豐度顯著降低, 放線菌門(Actinobacteriota)和厚壁菌門(Firmicutes)顯著上升, 黃殼糯各優(yōu)勢菌門無顯著差異; 低防效組合中合系39根際中Patescilbacteria顯著下降, 黃殼糯芽單胞菌門(Gemmatimonadota)顯著上升。PICRUSt2功能預(yù)測表明, 間栽系統(tǒng)中主栽品種次生代謝產(chǎn)物的合成相對豐度顯著下降, 間栽品種轉(zhuǎn)錄、輔酶和維生素的代謝相對豐度顯著上升。綜上, 高防效組合通過混合間栽, 能改善水稻根際菌群多樣性、細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及功能, 從而有效降低稻瘟病病害發(fā)生, 為利用改良土壤微生物提高植物抗病性提供應(yīng)用途徑和多樣性間栽防治病害理論提供數(shù)據(jù)支撐。

水稻; 多樣性混合間栽; 高通量測序; 細(xì)菌群落; 細(xì)菌多樣性; 功能預(yù)測

水稻()作為最重要的糧食作物之一, 為世界半數(shù)以上人口提供主食[1]。由子囊真菌引起的稻瘟病, 是制約水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重要因子, 依靠大量化學(xué)農(nóng)藥能有效控制稻瘟病發(fā)生, 但使用不當(dāng)不僅造成農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的嚴(yán)重污染, 而且會(huì)導(dǎo)致水稻品種產(chǎn)生抗藥性, 對糧食安全和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展造成威脅, 也會(huì)給人類健康帶來直接影響且存在長期隱患[2-5]。通過提高系統(tǒng)內(nèi)生物多樣性水平, 可有效控制病害流行[6]。利用水稻混合間栽技術(shù), 提高農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性, 既能有效降低稻瘟病發(fā)生, 還能有效抑制其傳播及擴(kuò)展, 減少農(nóng)藥使用, 自然達(dá)到抗病穩(wěn)產(chǎn)與可持續(xù)發(fā)展的效果, 可作為綠色農(nóng)業(yè)和生態(tài)農(nóng)業(yè)的重要舉措[7]。

關(guān)于水稻多樣性間栽控制病害地上部分機(jī)理已有豐富的理論基礎(chǔ), 如稀釋效應(yīng)[8]、物理阻隔[9]、微生態(tài)效應(yīng)[10]和營養(yǎng)生理[11]等, 但混合間栽導(dǎo)致的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化對水稻抵御病害的作用了解仍然有限。大量研究表明, 植物根部的一部分微生物能促進(jìn)植物生長, 幫助植物根部更好地吸收養(yǎng)分[12-13]。有益的根際細(xì)菌能幫助抵御病原菌的侵入、提高寄主的抗病性。另外, 根際微生物還可以刺激宿主免疫系統(tǒng), 誘導(dǎo)系統(tǒng)性抗性抑制病害發(fā)生[14]。同時(shí), 通過間栽改變根際微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu), 從而減輕病害發(fā)生的例子也屢見不鮮[15-17]。譬如, 煙草與萬壽菊間栽, 可顯著提高煙草根際微生物群落多樣性, 有效降低煙草青枯病發(fā)生[18]。不同水稻根際微生物存在差異[19], 與單一品種種植相比, 多樣性混合間栽以一定的比例種植不同水稻品種, 由于根系間接觸頻繁并相互影響, 可能導(dǎo)致水稻根際微生物的多樣性水平發(fā)生變化。另外, 間栽系統(tǒng)中水稻感病品種與抗病品種搭配種植時(shí), 其根際微生物結(jié)構(gòu)與功能的改變, 可能會(huì)提高感病品種抵御病害的能力。目前有關(guān)多樣性混合間栽對水稻根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與功能的報(bào)道尚處于空白階段。因此, 以水稻多樣性混合間栽為例, 開展種內(nèi)間栽對根際微生物相關(guān)因子的變化研究, 不僅可以揭示不同水稻品種間栽對根際微生物的影響, 還可以補(bǔ)充通過多樣性混合間栽控制水稻病害的微生物作用原理。

為此, 本研究利用Illumina Hiseq測序技術(shù)分析凈栽和間栽下各品種水稻的根際土壤微生物多樣性和群落組成, 比較不同栽培模式下根際土壤微生物群落的變化, 探明不同間栽組合對根際微生物多樣性和群落組成影響差異, 并結(jié)合稻瘟病防治效果, 探究抑制稻瘟病發(fā)生的關(guān)鍵因素, 為揭示抑制稻瘟病發(fā)生的根際微生態(tài)機(jī)制以及研發(fā)稻瘟病綠色防控技術(shù)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

于2020年在云南省建水縣高營村(23°36′08′′N, 102°46′04′′E)進(jìn)行。根據(jù)水稻多樣性混合間栽3年田間試驗(yàn)數(shù)據(jù), 選擇抗稻瘟病現(xiàn)代品種汕優(yōu)63和合系39作為主栽品種, 感稻瘟病傳統(tǒng)品種黃殼糯作為間栽品種。試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì), 共設(shè)置5個(gè)處理: 汕優(yōu)63凈栽(Mono_SY63)、合系39凈栽(Mono_HX39)、黃殼糯凈栽(Mono_HKN)、黃殼糯||汕優(yōu)63 (Mix1_HKN/SY63)和黃殼糯||合系39 (Mix2_HKN/HX39), 各處理進(jìn)行3次重復(fù)。小區(qū)設(shè)計(jì)如圖1所示, 多樣性混合間栽種植: 主栽品種每2列為一組, 組內(nèi)株距為13.33 cm, 組間株距為26.67 cm, 行距為16.67 cm, 之后在每2組的中間一列種植間栽品種。主栽品種單作: 單作品種每2列為一組, 組內(nèi)株距為13.33 cm, 組間株距為26.67 cm, 行距為16.67 cm。間栽品種單作: 單作方式與主栽品種單作方式完全相同。2個(gè)單作小區(qū)為一個(gè)整體, 同一組合的多樣性混合間栽小區(qū)和單作小區(qū)相鄰。并在田塊四周設(shè)置2行誘發(fā)行, 誘發(fā)行種植當(dāng)?shù)攸S殼糯以利于稻瘟病發(fā)生。各小區(qū)水肥管理措施保持一致, 不使用生長調(diào)節(jié)劑, 全生育期防治蟲害而不防治病害, 采取有效措施防止鳥害。

1.2 根際土壤樣品收取及病害調(diào)查

參考Zhang[19]的方法收取水稻根際土樣。于水稻抽穗初期收取根際土壤樣品, 將圖1標(biāo)注取樣點(diǎn)中的水稻根系完整拔出, 搖動(dòng)根系去除大塊土壤, 剪取2～3個(gè)分蘗的全根于裝有35 mL 1×PBS溶液的離心管中, 搖晃至根際土壤脫離后, 棄去水稻根系并將剩余液體置于–80℃保存。

水稻孕穗期、黃熟期分別調(diào)查試驗(yàn)品種葉瘟、穗頸瘟發(fā)生情況, 稻瘟病調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)按照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 15790-2009)的5級分級標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

1.3 DNA抽提和PCR擴(kuò)增

利用E.Z.N.A. soil DNA kit (OMEGA, 美國)試劑盒進(jìn)行微生物群落總DNA抽提, 利用1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, 美國)分光光度儀檢測DNA含量和純度; 使用338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')對16S rRNA基因V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[20], PCR反應(yīng)體系為: 5× TransStart FastPfu緩沖液4 μL, 2.5 mmol L–1dNTPs 2 μL, 上游引物(5 μmol L–1) 0.8 μL, 下游引物(5 μmol L–1) 0.8 μL, TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL, 模板DNA 10 ng, 補(bǔ)足至20 μL。每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù), 擴(kuò)增程序如下: 95℃預(yù)變性3 min, 27個(gè)循環(huán)(95℃ 變性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸30 s), 然后72℃延伸10 min, 最后4℃保存(PCR儀, ABI GeneAmp 9700型)。

圖1 水稻種植模式及取樣點(diǎn)示意圖

a: 水稻混合間栽示意圖; b: 水稻凈栽示意圖; c: 水稻種植小區(qū)示意圖?？招膱A為主栽品種, 實(shí)心圓為間栽品種, 方框?yàn)楦H土壤取樣點(diǎn); SY63: 汕優(yōu)63; HX39: 合系39; HKN: 黃殼糯。

a: diagram of mixture intercropping of rice; b: diagram of monoculture of rice; c: diagram of the paddy experiment plot. Hollow circles are main cultivars, solid circles are intercropping cultivars; boxes are rhizosphere soil sampling points. SY63: Shanyou 63; HX39: Hexi 39; HKN: Huangkenuo.

1.4 高通量測序

將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物, 利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences公司)進(jìn)行回收產(chǎn)物純化, 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 并用Quantus Fluorometer (Promega, 美國)對回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測定量。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit進(jìn)行建庫: (1) 接頭鏈接; (2) 使用磁珠篩選去除接頭自連片段; (3) 利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫模板的富集; (4)磁珠回收PCR產(chǎn)物得到最終的文庫。利用Illumina公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250平臺(tái)進(jìn)行測序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用fastp軟件[21]對原始測序序列進(jìn)行質(zhì)控, 使用FLASH軟件進(jìn)行拼接: 過濾掉低質(zhì)量reads, 隨后根Barcode序列將reads拆分并截去引物序列和Barcode標(biāo)簽, 得到原始數(shù)據(jù)(raw reads), 再通過去除嵌合體序列處理, 最終得到有效數(shù)據(jù)(clean reads)使用UPARSE軟件, 根據(jù)97%的相似度對序列進(jìn)行 OTU 聚類并剔除嵌合體[22]。利用RDP classifier對每條序列進(jìn)行物種分類注釋, 比對Silva 16S rRNA數(shù)據(jù)庫(v138), 設(shè)置比對閾值為70%。

通過數(shù)據(jù)分析軟件SPSS 18.0對供試水稻品種的田間病情指數(shù)進(jìn)行方差分析; 使用OriginPro 9.1對田間病情指數(shù)繪制柱狀圖。

使用Mothur (http://www.mothur.org/wiki/Schloss_ SOP#Alpha_diversity)進(jìn)行Alpha指數(shù)分析; R語言vegan包進(jìn)行ANOSIM分析; 利用FastUniFrac (http://UniFrac.colorado.edu/)分析得到樣本間Bray- Curtis距離矩陣并使用R語言繪圖。R語言stats包進(jìn)行組間顯著差異物種分析。使用Galaxy網(wǎng)站進(jìn)行PICRUSt2功能基因預(yù)測分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間不同多樣性間栽組合對稻瘟病防效存在差異

圖2顯示, 3個(gè)供試品種田間稻瘟病抗性存在顯著差異, 并且不同多樣性混合間栽組合對稻瘟病防效也存在差異。黃殼糯葉瘟病情指數(shù)(leaf blast disease index, LDI)為38.46, 穗頸瘟病情指數(shù)(panicle blast disease index, PDI)為15.69, 汕優(yōu)63 LDI、PDI分別為1.06、0.93, 合系39 LDI、PDI分別為0.24、0.20。因此, 可將間栽品種黃殼糯視為田間感病品種,主栽品種汕優(yōu)63及合系39視為田間抗病品種。黃殼糯與汕優(yōu)63間栽, 其LDI顯著下降至13.18(<0.05), 防效達(dá)65.73%, PDI顯著下降至8.48(<0.05), 防效為54.48%, 而間栽與否對汕優(yōu)63無顯著影響(>0.05)。黃殼糯與合系39的間栽組合中, 無論是黃殼糯還是合系39, 與凈栽相比LDI和PDI都沒有顯著變化(>0.05)。因而, 我們將黃殼糯||汕優(yōu)63定義為田間稻瘟病高防效組合(Mix1), 黃殼糯||合系39定義為田間稻瘟病低防效組合(Mix2)。

圖2 不同間栽組合稻瘟病病情指數(shù)

a: 葉瘟病情指數(shù); b: 穗頸瘟病情指數(shù)。Mono: 凈栽處理; Mix1: 黃殼糯||汕優(yōu)63; Mix2: 黃殼糯||合系39; “_”后為品種名稱; 縮寫同圖1。*:< 0.05;ns: 差異不顯著。

a: leaf blast disease index; b: panicle blast disease index. Mono: monoculture; Mix1: HKN||SY63; Mix2: HKN||HX39. “_” followed by the variety name. Abbreviations are the same as those given in Fig. 1. *:< 0.05; ns: no significance.

2.2 根際土壤細(xì)菌群落Alpha多樣性分析

通過對7個(gè)根際土壤樣本細(xì)菌16S rRNA的V3～V4區(qū)測序, 結(jié)果顯示所獲細(xì)菌優(yōu)化序列數(shù)范圍為41,566～57,114, 統(tǒng)計(jì)各土壤樣品的Alpha多樣性指數(shù)于表1。此外, 各樣品覆蓋率均大于97%, 說明本研究獲得的細(xì)菌序列覆蓋度較好, 其測序深度可以滿足細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成及多樣性分析。

細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性結(jié)果表明, 高防效組合能夠顯著提高間栽品種黃殼糯根際細(xì)菌群落豐富度和均勻度, 其香農(nóng)指數(shù)和Chao1指數(shù)分別由間栽前的6.75、4879.60顯著上升至6.90、5465.00 (<0.05)。而對主栽品種汕優(yōu)63的根際細(xì)菌群落多樣性無明顯影響。盡管低防效組合對黃殼糯與合系39根際細(xì)菌群落多樣性均無顯著影響(>0.05), 但是仍然呈現(xiàn)間栽可以提高兩者香農(nóng)指數(shù)和Chao1指數(shù)的趨勢。因此, 間栽處理在一定程度上可提高水稻根際細(xì)菌多樣性, 并且不同間栽組合對水稻根際細(xì)菌多樣性影響存在差異。

表1 各樣品優(yōu)化序列及Alpha多樣性指數(shù)

縮寫同圖1和圖2。同列不同字母表示在0.05概率水平差異顯著。

Abbreviations are the same as those given in Figs. 1 and 2. Different lowercase letters in the same column indicate significant difference at the 0.05 probability level.

2.3 根際土壤細(xì)菌群落Beta多樣性分析

相似性分析(ANOSIM)表明, 不同水稻品種根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)間存在極顯著差異(= 0.48,<0.01)。基于OTU的微生物群落主坐標(biāo)分析(PCoA)顯示, 在第1主成分PC1 (差異解釋率為28.77%)上合系39與汕優(yōu)63、黃殼糯分離, 第2主成分PC2 (差異解釋率為20.42%)上黃殼糯與合系39分離, 與汕優(yōu) 63根際細(xì)菌群落未分離(圖3-a)。對于不同間栽組合(圖3-b～e), 汕優(yōu)63與黃殼糯根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)無顯著差異(= 0.25,>0.05), 兩者間栽后同樣不存在差異(= –0.05,> 0.05)。合系39與黃殼糯根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)間存在顯著差異(= 0.76,<0.05), 間栽后二者無顯著差異(= 0.30,>0.05)。綜上, 相較于合系39, 汕優(yōu)63根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與黃殼糯更為接近, 并且多樣性間栽后不同品種水稻根際細(xì)菌群落會(huì)相互影響, 兩者根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異減小, 甚至趨于一致。

2.4 根際土壤細(xì)菌群落組成及差異微生物分析

從門的分類水平看, 3個(gè)供試水稻品種細(xì)菌群落組成相似(圖4-a)。主要包含綠彎菌門(Chloroflexi)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteriota)、酸桿菌門(Acidobacteriota)、脫硫菌門(Desulfobacterota)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidota)、黏球菌門(Myxococcota)、Patescibacteria、芽單胞菌門(Gemmatimonadota)、疣微菌門(Verrucomicrobiota)、硝基螺旋菌門(Nitrospirota)、扁平菌門(Planctomycetota) 13個(gè)細(xì)菌門, 約占全部細(xì)菌豐度的96%以上。其中, 3個(gè)供試水稻品種根際細(xì)菌群落優(yōu)勢菌門中擬桿菌門、芽單胞菌門相對豐度存在顯著差異(<0.05)。

差異分析結(jié)果如圖4-b～e所示, 與凈栽相比高防效組合中汕優(yōu)63根際酸桿菌門相對豐度顯著降低3.54%, 放線菌門和厚壁菌門分別顯著上升3.69%、2.51% (<0.05), 黃殼糯各優(yōu)勢菌門無顯著差異; 低防效組合中合系39根際Patescilbacteria顯著下降1.05%, 黃殼糯芽單胞菌門顯著上升0.48% (<0.05)。

如圖5-a所示, 相對豐度前10的優(yōu)勢菌目為伯克氏菌目(Burkholderiales)、厭氧繩菌目(Anaerolineales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、分枝桿菌目(Corynebacteriales)、Vicinamibacterales、SJA-15、Gaiellales、纖線桿菌目(Ktedonobacterales)、酸桿菌目(Acidobacteriales)和互營桿菌目(Syntrophobacterales)。3個(gè)供試水稻品種根際細(xì)菌群落優(yōu)勢菌目中厭氧繩菌目存在顯著差異。

圖3 根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)PCoA及ANOSIM分析

a: 3個(gè)品種水稻凈栽處理; b: 汕優(yōu)63與黃殼糯凈栽處理; c: 汕優(yōu)63與黃殼糯間栽處理; d: 合系39與黃殼糯凈栽處理; e: 合系39與黃殼糯間栽處理; 縮寫同圖1。

a: the monoculture treatments for three varieties in rice; b: the monoculture treatments of SY63 and HKN; c: the intercropping treatment of SY63 and HKN; d: the monoculture treatments of HX39 and HKN; e: the intercropping treatment of HX39 and HKN. Abbreviations are the same as those given in Fig. 1.

圖4 優(yōu)勢菌門及其差異

a: 3個(gè)品種水稻凈栽處理; b: 汕優(yōu)63間栽處理; c: 與汕優(yōu)63間栽的黃殼糯; d: 合系39間栽處理; e: 與合系39間栽的黃殼糯; 縮寫同圖1。*:< 0.05。

a: the monoculture treatments for three varieties in rice; b: SY63 intercropping treatment; c: HKN intercropped with SY63; d: HX39 intercropping treatment; e: HKN intercropped with HX39; Abbreviations are the same as those given in Fig. 1. *:< 0.05.

圖5 優(yōu)勢菌目及其變化

a: 3個(gè)品種水稻凈栽處理; b: 汕優(yōu)63間栽處理; c: 與汕優(yōu)63間栽的黃殼糯; d: 合系39間栽處理; e: 與合系39間栽的黃殼糯; 縮寫同圖1。*:< 0.05。

a: the monoculture treatments for three varieties in rice; b: SY63 intercropping treatment; c: HKN intercropped with SY63; d: HX39 intercropping treatment; e: HKN intercropped with HX39; Abbreviations are the same as those given in Fig. 1. *:< 0.05.

差異分析結(jié)果如圖5-b～e所示, 與凈栽相比高防效組合中汕優(yōu)63根際厭氧繩菌目相對豐度顯著降低3.77%, 黃殼糯根際SJA-15相對豐度顯著降低0.70%, KD4-96 (綠彎菌門Chloroflexi未分類目)相對豐度顯著上升1.58% (<0.05); 低防效組合中合系39根際優(yōu)勢菌目無顯著變化, 黃殼糯根際酸桿菌目相對豐度顯著上升1.17% (<0.05)。

綜上所述, 不同品種水稻多樣性混合間栽時(shí), 其根際細(xì)菌群落會(huì)相互影響, 優(yōu)勢細(xì)菌類群相對豐度會(huì)更加接近鄰近水稻植株, 兩者細(xì)菌各門、目相對豐度更為接近。

2.5 根際土壤細(xì)菌功能預(yù)測

基于KEGG數(shù)據(jù)庫, 通過PICRUSt2工具對16S的OTU信息進(jìn)行功能預(yù)測, 共得到6個(gè)生物代謝通路, 去除有機(jī)系統(tǒng)和人類疾病等無關(guān)的功能基因后, 共包含22種二級(Level 2)功能分組。高防效組合中(圖6-a, b), 相較于間栽前汕優(yōu)63其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成相對豐度顯著下降(<0.05), 黃殼糯萜類和多酮類代謝、生物降解和代謝、脂質(zhì)代謝的相對豐度顯著下降(<0.05), 轉(zhuǎn)錄、折疊, 分類和降解、輔酶和維生素的代謝、能量代謝的相對豐度顯著上升(<0.05)。低防效組合中(圖6-c, d), 相較于間栽前合系39細(xì)胞活性、輔酶和維生素的代謝相對豐度顯著下降(<0.05), 碳水化合物代謝的相對豐度顯著上升(<0.05)。黃殼糯在轉(zhuǎn)錄、核苷酸代謝、輔酶和維生素的代謝相對豐度顯著上升(<0.05)。

3 討論

3.1 水稻品種的合理組配是抗病的關(guān)鍵

水稻多樣性混合間栽, 作為一種可以減輕病蟲害、增加單位面積產(chǎn)量的可持續(xù)栽培措施, 已經(jīng)在生產(chǎn)應(yīng)用中得到反復(fù)驗(yàn)證[7,23]。其中, 合理的品種組配是間栽系統(tǒng)控制稻瘟病的中心環(huán)節(jié), 在我們的混合間栽系統(tǒng)中, 選擇的主栽品種為抗病品種汕優(yōu)63和合系39, 而與其搭配的品種為同一感病品種黃殼糯, 在這樣的品種組配下, 盡管2個(gè)組合均使間栽感病品種黃殼糯的LDI和PDI呈下降趨勢, 但在降低病害發(fā)生的程度上存在明顯差異, 表現(xiàn)出汕優(yōu)63與黃殼糯搭配控病效果好, 合系39與黃殼糯組合控病效果差。我們的結(jié)果與前人研究的水稻混合間栽田間試驗(yàn)的防治效果數(shù)據(jù)相互對應(yīng)[24], Li等[25]也在不同作物搭配體系中發(fā)現(xiàn)不同品種組配, 其防效存在明顯差異的相似報(bào)道。有研究表明, 群體內(nèi)的遺傳多樣性或群落結(jié)構(gòu)越豐富, 其對環(huán)境變化的適應(yīng)能力就越強(qiáng), 表現(xiàn)出抗病能力增強(qiáng)[6], 這說明造成抵御病害能力的差異, 不但與品種抗性和自身的遺傳特性有關(guān), 混合間栽系統(tǒng)的土壤微生物多樣性和群體結(jié)構(gòu)也不容忽視。

圖6 KEEG預(yù)測功能基因在不同處理水稻根際細(xì)菌群落之間的差異

a: 汕優(yōu)63; b: 與汕優(yōu)63間栽的黃殼糯; c: 合系39; d: 與合系39間栽的黃殼糯; BOSM: 其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成; EM : 能量代謝; MCV : 輔酶和維生素的代謝; LM : 脂質(zhì)代謝; XBM : 生物降解和代謝; FSD : 折疊, 分類和降解; MTP : 萜類和多同類代謝; T : 轉(zhuǎn)錄; CAM : 碳水化合物代謝; CEM : 細(xì)胞活性; NM : 核苷酸代謝; *:< 0.05。

a: SY63; b: HKN intercropped with SY63; c: HX39; d: HKN intercropped with HX39. BOSM: biosynthesis of other secondary metabolites; EM: energy metabolism; MCV: metabolism of cofactors and vitamins; LM: lipid metabolism; XBM: xenobiotics biodegradation and metabolism; FSD: folding, sorting, and degradation; MTP: metabolism of terpenoids and polyketides; T: transcription; CAM: carbohydrate metabolism; CEM: cell motility; NM: nucleotide metabolism; *:< 0.05.

3.2 水稻根際細(xì)菌群落多樣性與水稻抗稻瘟病能力密切相關(guān)

土壤微生物群落多樣性對于土壤生態(tài)及作物健康至關(guān)重要, 當(dāng)根際微生物結(jié)構(gòu)合理, 多樣性水平越高, 作物抗病能力就越強(qiáng)[26]。與其他作物相同, 提高水稻根際微生物群落多樣性, 可以增加其對多種病害的抗性[27-28]。Alpha多樣性分析顯示, 間栽處理可提高水稻根際細(xì)菌群落Alpha多樣性水平, 由于汕優(yōu)63和合系39基因型不同, 根系分泌物譜存在差異, 塑造出不同的根際微環(huán)境, 致使根際微生物數(shù)量及種類發(fā)生特定變化, 改善感病水稻品種抗稻瘟病能力, 從而導(dǎo)致黃殼糯LDI和PDI下降。此外, 高防效組合在抑制病害發(fā)生, 提高間栽品種根際細(xì)菌群落多樣性方面表現(xiàn)更為突出。汕優(yōu)63根際細(xì)菌Alpha多樣性顯著高于黃殼糯, 而合系39根際細(xì)菌Alpha多樣性與黃殼糯無顯著差異, 這可能是導(dǎo)致不同多樣性混合間栽組合中間栽品種抗病水平出現(xiàn)差異的原因。ANOSIM和PCoA分析表明, 多樣性混合間栽能改變水稻根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu), 黃殼糯間栽后根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)出現(xiàn)顯著變化, 與主栽品種根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似, 說明黃殼糯間栽后具有與主栽品種相似的根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu), 這可能是黃殼糯表現(xiàn)出抗病能力的原因。值得注意的是, 低防效組合中主栽品種根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)出現(xiàn)顯著變化, 而高防效組合卻未出現(xiàn)顯著變化, 因此主栽品種根際細(xì)菌群落穩(wěn)定性可能與改善感病品種抗病能力相關(guān)。綜上所述, 我們推測根際細(xì)菌群落Alpha多樣性及其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性可能是影響作物抗病能力的關(guān)鍵。

3.3 混合間栽的優(yōu)勢菌門將嚴(yán)重影響水稻的生長和抗病性

根際微生物群落結(jié)構(gòu)改善對植物抵御病原侵染同樣有積極作用[29]。Zhou等[30]和郝海平等[31]的研究顯示, 間栽處理可以顯著改變根際微生物的群落結(jié)構(gòu)。本研究基于高通量測序技術(shù)的研究結(jié)果顯示, 3個(gè)供試水稻品種根際優(yōu)勢細(xì)菌門為變形菌門、綠彎菌門、放線菌門、酸桿菌門和脫硫菌門, 胡蓉等[28]和張靜等[32]對稻田微生物群落的研究發(fā)現(xiàn), 變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門、放線菌門、脫硫菌門和擬桿菌門是稻田內(nèi)的優(yōu)勢群落, 本研究與這些研究結(jié)果的細(xì)菌群落主要構(gòu)成類似。變形菌門是植物根際土壤中最豐富的菌群, 主要原因是其生長速度快, 且能充分利用植物根際分泌的各種物質(zhì)[33]。

大量研究表明, 酸桿菌門的作用主要是降解植物殘?bào)w多聚物[34]和參與鐵循環(huán)[35-36], 放線菌能夠分解纖維素和木質(zhì)素, 豐富的放線菌有利于土壤中植物有機(jī)殘?bào)w的分解[37], 厚壁菌門中大部分細(xì)菌主要是將多種碳源降解轉(zhuǎn)化為小分子物質(zhì)[38]。本研究高防效組合中, 主栽品種稻瘟病發(fā)病率有上升趨勢, 可能是因?yàn)槠涓H放線菌門和厚壁菌門相對豐度顯著上升而酸桿菌門相對豐度顯著下降, 減弱了水稻生長必需物質(zhì)的循環(huán), 導(dǎo)致水稻正常生長受到一定阻礙, 降低其抗病性, 說明放線菌門和厚壁菌門相對豐度提高不能完全抵消酸桿菌門相對豐度下降所造成影響, 酸桿菌門可能在水稻根際微生物中扮演了不可缺少的角色, 后續(xù)相關(guān)研究可關(guān)注酸桿菌門內(nèi)成員。高防效組合中間栽品種根際各優(yōu)勢菌門并無顯著變化, 但是其稻瘟病發(fā)病率卻顯著降低, 可能是在更低分類水平才有顯著變化。芽單胞菌門一般可以將各種糖分子轉(zhuǎn)化為維生素[39], 王珂等[40]發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中添加適量維生素, 可顯著改善小麥生長狀況, 提高小麥內(nèi)源激素含量。因此, 在本研究低防效組合中, 間栽品種根際芽單胞菌門相對豐度的提高可能是其稻瘟病發(fā)病率呈現(xiàn)下降趨勢的原因。

微生物群落結(jié)構(gòu)的改變, 會(huì)導(dǎo)致微生物功能發(fā)生改變。本研究通過PICRUSt2進(jìn)行功能預(yù)測, 高防效組合和低防效組合黃殼糯根際轉(zhuǎn)錄、輔酶和維生素的代謝相對豐度均顯著上升, 而分類和降解、能量代謝的相對豐度僅在高防效組合中的黃殼糯根際中顯著上升, 說明利用水稻多樣性混合間栽, 可提高間栽品種根際微生物與代謝相關(guān)功能基因豐度以抵御逆境。此外, 分類和降解、能量代謝的相對豐度的變化很可能是導(dǎo)致高防效組合黃殼糯具有更高抗病性的主要因素。

通過合理組配間栽不同抗稻瘟病能力的品種, 可以提高土壤細(xì)菌群落多樣性, 改善土壤質(zhì)量, 進(jìn)而增強(qiáng)水稻對稻瘟病的防治效果。

4 結(jié)論

合理組配不同抗稻瘟病能力的水稻品種，可提高土壤細(xì)菌群落多樣性，有效改善水稻根際土壤環(huán)境。多樣性混合間栽高防效組合能明顯促進(jìn)根際轉(zhuǎn)錄、輔酶和維生素的代謝、分類和降解、能量代謝等功能基因在感病品種根際土壤中的富集。因此，選擇適合的多樣性混合間栽組合是提高感病品種抗病能力的可行途徑。

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Effects of diverse mixture intercropping on the structure and function of bacterial communities in rice rhizosphere

TANG Wen-Qiang1,**, ZHANG Wen-Long1,**, ZHU Xiao-Qiao1, DONG Bi-Zheng1, LI Yong-Cheng2, YANG Nan1, ZHANG Yao2, WANG Yun-Yue1,*, and HAN Guang-Yu1,*

1Key Laboratory of the Ministry of Education for Agricultural Biodiversity and Pest Management, Yunnan Agricultural University / State Key Laboratory for Bio-resource Protection and Utilization in Yunnan, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, Yunnan, China;2Honghe Academy of Agricultural Sciences, Mengzi 661100, Yunnan, China

In order to clarify the effects of mixture intercropping on the control of rice blast and the structure and function of the rhizosphere bacterial community, the 16S rRNA sequencing analysis of bacteria in rhizosphere soil of the selected high control efficiency (E=54.48%) (Shanyou 63/Huangkenuo) and low control efficiency (E=14.12%) combinations (Hexi 39/Huangkenuo) under the intercropping and monoculture treatments were performed with Illumina Hiseq sequencing technology. The results showed that soil bacteria, from 37 phyla, 116 classes, 244 orders, 384 families, 689 genera, were obtained in the intercropping system. Chloroflexi, Proteobacteria, and Actinobacteriota were the dominant bacterial groups. The relative abundance was higher than 15%. Alpha diversity analysis discovered that high-efficacy combination significantly increased the Shannon index and Chao1 index of rice rhizosphere bacterial community in intercropping conditions (<0.05), whereas there was no difference at>0.05 in low-efficiency combination. ANOSIM and PCoA analyses revealed that there was significant difference in the structure of the species in the rhizosphere bacterial community in monoculture (= 0.48,<0.01), but no significant difference in the rhizosphere bacterial community structure between the high- and low-efficiency combinations following intercropping (>0.05), which indicating that intercropping increased the similarity of bacterial community structure between both combinations. Comparison to monoculture, the dominant bacterial group composition proved that the relative abundance of Shanyou63 Acidobacteriota decreased significantly, while the relative abundance of Shanyou 63 Actinobacteriota and Firmicutes increased significantly, but there was no significant difference among the dominant bacteria in Huangkenuo. Hexi 39 rhizosphere Patescilbacteria exhibited the significant decrease in low-efficiency combinations, whereas Gemmatimonadota showed the significant increase. PICRUSt2 function prediction discovered that the relative abundance of biosynthesis of other secondary metabolites in the main cultivars decreased significantly in the intercropping system, while the relative abundance of transcription, metabolism of cofactors and vitamins in intercropping cultivars increased significantly. In conclusion, to increase plant disease resistance and to provide data support for the theory of diverse intercropping for disease control, the high-efficacy combination had the ability to improve the diversity of rice rhizosphere bacteria and the structure and function of bacterial community by mixture intercropping, which effectively reduced the occurrence of rice blast and provided an application pathway for the improvement of soil microorganisms.

rice (); mixture intercropping; high-throughput sequencing; bacterial community; bacterial diversity; functional prediction

10.3724/SP.J.1006.2023.22001

本研究由云南省基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(202201AT070265), 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31800451)和云南省“高層次人才培養(yǎng)支持計(jì)劃”青年拔尖人才專項(xiàng)(YNWRQNBJ2020296)資助。

This study was supported by the Yunnan Fundamental Research Projects (202201AT070265), the National Natural Science Foundation of China (31800451), and the “High-level Talent Training Support Program” Specialized Project for Young Top Talents in Yunnan (YNWRQNBJ2020296).

韓光煜, E-mail: hanguangyu9745@163.com; 王云月, E-mail: 1371209436@qq.com

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

唐文強(qiáng), E-mail: 1092297272@qq.com

2022-01-02;

2022-09-05;

2022-09-22.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220920.0938.002.html

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