海云翔 鞏彥龍 宋敏* 董萬濤 蔣宜偉 王凱
1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué),甘肅 蘭州 730000
2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,甘肅 蘭州 730000
骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是以骨量低下,骨組織微結(jié)構(gòu)損壞,骨脆性增加,易發(fā)生骨折為特征的全身代謝性骨病[1]。OP與增齡相關(guān),隨著人口老齡化進(jìn)程加快,OP已成為影響我國老年人群生活質(zhì)量、加重社會財(cái)政負(fù)擔(dān)的重大公共衛(wèi)生問題。細(xì)胞程序性死亡(programmed cell death,PCD)包括經(jīng)典的凋亡(apoptosis)和新近發(fā)現(xiàn)的壞死性凋亡(necroptosis)、鐵死亡(ferroptosis)、焦亡(pyroptosis)等。研究表明,PCD在OP的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用[2-3]。在某些因素作用下,PCD的失衡使骨代謝微環(huán)境的調(diào)節(jié)處于紊亂狀態(tài),進(jìn)而造成骨代謝過程中骨形成與骨吸收所處的動(dòng)態(tài)平衡被打破,最終導(dǎo)致OP發(fā)生。本文就上述細(xì)胞程序性死亡方式與OP的相關(guān)研究進(jìn)行綜述,為今后基礎(chǔ)研究及臨床工作提供更多的參考。
早期研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞受某些基因或蛋白調(diào)控造成自然死亡。1964年科學(xué)家首次使用PCD來描述昆蟲在發(fā)育過程中存在細(xì)胞自然死亡現(xiàn)象[4],Kerr等[5]定義了凋亡、壞死多種細(xì)胞死亡方式。PCD組織內(nèi)無死亡細(xì)胞溶解,無可見的炎癥反應(yīng),是機(jī)體細(xì)胞通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主動(dòng)介導(dǎo)的自發(fā)性、程序性死亡方式[6],能夠被相應(yīng)的信號通路抑制劑阻斷,主要包括細(xì)胞凋亡、焦亡、鐵死亡、壞死性凋亡等。其中凋亡和焦亡屬PCD死亡機(jī)制中的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)依賴型,壞死性凋亡、鐵死亡及其他程序性壞死方式屬非caspase依賴型。PCD的紊亂與心血管系統(tǒng)、自身免疫性疾病、腫瘤及退行性疾病的發(fā)生緊密相關(guān)。因此,細(xì)胞程序性死亡使人類對多種疾病的防治機(jī)制有了新的研究方向。
凋亡是機(jī)體在特定基因或通路調(diào)控下,為維持自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)而有序引發(fā)的細(xì)胞死亡過程,主要包括死亡受體(TNFR、Fas等)調(diào)控的外源性凋亡途徑和線粒體調(diào)控的內(nèi)源性凋亡途徑[7]。不同的凋亡途徑都須經(jīng)過caspase家族成員介導(dǎo)的不可逆有限水解底物的級聯(lián)放大反應(yīng)過程作用于底物從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。
OP是人體在衰老過程中因增齡性氧化應(yīng)激、雌激素減少引起免疫系統(tǒng)低度活化,從而產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)[9],這種機(jī)制可能誘發(fā)成骨細(xì)胞內(nèi)凋亡加速,破壞骨生理平衡。腫瘤壞死因子受體1(TNFR1)作為廣譜表達(dá)的細(xì)胞膜受體,可與其配體腫瘤壞死因子α(TNF-α)相互作用介導(dǎo)信號傳遞,兩者結(jié)合激活下游基因及復(fù)合物Ⅱ的形成介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]?;罨晒羌?xì)胞膜上的死亡受體Fas和TNFR可使成骨細(xì)胞發(fā)生凋亡[11],雌激素可通過熱休克蛋白27(HSP27)減少TNF-α誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡,同時(shí)經(jīng)Fas配體途徑誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡進(jìn)而保護(hù)骨骼[12-13]。
OP形成過程中涉及線粒體途徑凋亡的信號通路包括PI3K/Akt、ERK5、JNK、Wnt/β-catenin、NF-κB、P38等,各信號通路間交互影響,調(diào)節(jié)線粒體途徑中caspase、BcL-2家族蛋白等關(guān)鍵靶點(diǎn),影響成骨細(xì)胞凋亡[14]。表達(dá)于成骨細(xì)胞的骨保護(hù)素(osteoprotegerin,OPG)可通過阻斷核因子κB受體活化因子配體(RANKL)和RANK的結(jié)合,抑制破骨細(xì)胞的分化和活性[15]。OPG可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞前體細(xì)胞中細(xì)胞色素從線粒體中釋放,激活caspase-3與caspase-9,使凋亡相關(guān)因子(AIF)和線粒體核酸內(nèi)切酶G(GEndo G)發(fā)生核轉(zhuǎn)位,從而誘導(dǎo)凋亡發(fā)生[16]。骨髓線粒體蛋白(OPA)是一種新發(fā)現(xiàn)的線粒體跨膜蛋白,OPA的下調(diào)通過誘導(dǎo)線粒體ATP產(chǎn)生和抑制P38信號通路來抑制細(xì)胞凋亡并改善OP[17]。凋亡在骨代謝微環(huán)境中受不同基因或蛋白調(diào)節(jié),通過凋亡途徑維持成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞供應(yīng)速率,糾正細(xì)胞數(shù)量不平衡,對骨代謝穩(wěn)態(tài)具有重要意義。
壞死性凋亡是區(qū)別于凋亡和壞死的新型細(xì)胞死亡模式。既與凋亡相類似,嚴(yán)格遵循細(xì)胞內(nèi)信號通路調(diào)控,又具備壞死的形態(tài)特征[18]。作為非caspase依賴型死亡方式,可在細(xì)胞內(nèi)不存caspase信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的情況下,通過死亡受體(TNFR、Toll樣受體、Fas、干擾素受體)與配體結(jié)合觸發(fā)細(xì)胞死亡程序[19],目前,TNFR介導(dǎo)的壞死性凋亡研究最為深入。當(dāng)與TNF-α結(jié)合后,死亡受體TNFR1激活并在胞質(zhì)端招募下游蛋白分子受體相互作用蛋白激酶1(RIPK1)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TRAF2)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)死亡域蛋白(TRADD)、細(xì)胞凋亡抑制蛋白(cIAPs)等信號分子聚集,并在胞膜上形成復(fù)合物Ⅰ[20-21],復(fù)合物Ⅰ根據(jù)接收的信號刺激對RIPK1進(jìn)行不同修飾,引起凋亡或壞死性凋亡[22]。Caspase-8在此過程中扮演重要的角色,當(dāng)細(xì)胞內(nèi)促死亡蛋白RIPK1募集pro-Caspase-8、TRADD等形成復(fù)合物Ⅱa時(shí),Caspase-8被激活,RIPK3活化受到抑制,誘導(dǎo)細(xì)胞走向凋亡。當(dāng)Caspase-8缺失或活性減低時(shí),促使RIPK1去泛素化并與相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(RIPK3、Fas)結(jié)合形成復(fù)合物Ⅱb,招募且磷酸化MLKL執(zhí)行壞死性凋亡。
細(xì)胞凋亡在骨重塑中起關(guān)鍵作用[23],那么壞死性凋亡是否也參與了這一過程。研究發(fā)現(xiàn),去卵巢(OVX)大鼠骨細(xì)胞中RIPK1、RIPK3水平較假手術(shù)組顯著增加[24],壞死性骨細(xì)胞數(shù)量與OVX大鼠中TNF-α的產(chǎn)生呈正相關(guān),TNF-α通過RIPK1/RIPK3途徑調(diào)節(jié)下游關(guān)鍵信號分子MLKL及線粒體分裂調(diào)節(jié)蛋白(Drp1),促使骨細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡,給予特異性壞死性凋亡抑制劑Necrostatin-1 (Nec-1)后,RIPK1和RIPK3表達(dá)顯著降低,并在體外抑制 TNF-α誘導(dǎo)的骨細(xì)胞壞死性凋亡,延緩骨組織微結(jié)構(gòu)退變[25-26]。上述表明,壞死性凋亡加速了雌激素缺乏誘導(dǎo)的OP大鼠骨細(xì)胞丟失,Nec-1在減輕骨質(zhì)流失方面的作用可能與其在雌激素缺乏誘導(dǎo)的OP大鼠模型中抑制TNF-α誘導(dǎo)的骨細(xì)胞壞死性凋亡有關(guān)。此外,Nec-1可通過抑制RIPK1/RIPK3/MLKL信號通路中RIPK1的表達(dá)減輕糖皮質(zhì)激素和乙醇誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞壞死性凋亡,促進(jìn)骨形成,可見壞死性凋亡在糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的OP及酒精性O(shè)P的發(fā)病機(jī)制中亦有重要作用[27-28]。目前,壞死性凋亡與OP的相關(guān)研究尚處于初始階段,未見Caspase、PIPK3、MLKL等中下游因子激活和抑制與OP的相關(guān)報(bào)道,這為后續(xù)研究提供了新的方向。
鐵死亡是鐵離子依賴的脂質(zhì)過氧化物增多導(dǎo)致的細(xì)胞死亡形式,Dixon等[29]報(bào)道鐵死亡后,鐵死亡在細(xì)胞代謝過程中的重要作用正在逐步被發(fā)掘。在機(jī)體的病理變化過程中,當(dāng)細(xì)胞胱氨酸運(yùn)輸?shù)鞍资艿揭种?如IKE、Erastin、炎癥刺激等),胞內(nèi)谷胱甘肽的耗盡導(dǎo)致谷胱甘肽過氧化物酶(GPX4)失活,當(dāng)活性氧(reactive oxygen species,ROS)積累到一定程度可誘發(fā)細(xì)胞死亡。近年來發(fā)現(xiàn)輔酶Q(CoQ)氧化還原酶鐵死亡抑制蛋白1(FSP1)在鐵死亡中可與GPX4起相似的作用[30],這一研究結(jié)果進(jìn)一步豐富了對鐵死亡機(jī)制的認(rèn)識。鐵代謝廣泛參與骨的生長和生產(chǎn),在OP發(fā)生的病理變化過程中,成骨細(xì)胞內(nèi)鐵蛋白的磷酸化過程是通過抑制GPX4和XC-系統(tǒng),導(dǎo)致半胱氨酸代謝的破壞和脂質(zhì)過氧化的增強(qiáng),過度活躍的Fenton反應(yīng)產(chǎn)生大量ROS,導(dǎo)致成骨細(xì)胞死亡,進(jìn)而造成骨代謝過程中骨形成與骨吸收動(dòng)態(tài)平衡被破壞,最終形成OP(圖1)[31]。
圖1 GPX4依賴的細(xì)胞內(nèi)鐵死亡示意圖Fig.1 Schematic diagram of GPX4-dependent intracellular ferroptosis
眾所周知,長期大劑量類固醇治療會改變抗氧化能力,降低成骨細(xì)胞的活力和功能,導(dǎo)致骨質(zhì)疏松和骨壞死發(fā)生。研究表明,在大劑量糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的股骨頭壞死過程中,糖皮質(zhì)激素可能參與了破壞GPX4,引起成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中氧化應(yīng)激的變化,推測類固醇激素可能誘發(fā)骨重建相關(guān)細(xì)胞的鐵依賴性或激活鐵依賴性信號通路,若能逆轉(zhuǎn)鐵依賴性通路的激活,可防止這些細(xì)胞遭受死亡或損傷[32]。由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的外泌體(EC-Exos)可通過抑制鐵蛋白吞噬依賴性鐵死亡,逆轉(zhuǎn)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞成骨抑制以拮抗OP的發(fā)生[33]。線粒體鐵蛋白(FtMt)是一種在線粒體中儲存鐵離子并攔截有毒亞鐵離子的蛋白質(zhì),Wang等[34]通過慢病毒沉默及過表達(dá)FtMt,觀察了其對鐵死亡和成骨細(xì)胞功能的影響,結(jié)果表明FtMt的過表達(dá)降低了高糖條件下成骨細(xì)胞的鐵死亡,而沉默的FtMt通過ROS/PINK1/Parkin通路誘導(dǎo)線粒體自噬,進(jìn)一步激活并增加成骨細(xì)胞中鐵死亡,由此發(fā)現(xiàn)了FtMt通過減少過量亞鐵離子引起的氧化應(yīng)激來抑制成骨細(xì)胞中鐵死亡的發(fā)生。鐵死亡作為一種重要的細(xì)胞代謝過程,在代謝微環(huán)境中受不同信號及物質(zhì)的精細(xì)調(diào)節(jié),GPX4是其經(jīng)典的調(diào)節(jié)途徑,在OP低度氧化應(yīng)激、雌激素減少病理變化過程中,成骨細(xì)胞內(nèi)GPX4參與鐵代謝途徑調(diào)節(jié)鐵死亡,進(jìn)而保持成骨細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)平衡,減少成骨細(xì)胞的死亡,對骨代謝平衡具有重要的作用。
細(xì)胞焦亡是由Gasdermin介導(dǎo)的以細(xì)胞脹大至膜破裂,導(dǎo)致內(nèi)容物釋放引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。當(dāng)機(jī)體發(fā)生病變時(shí),促使炎癥小體形成,被激活的Caspase切割GSDMs蛋白釋放出其N端結(jié)構(gòu)域,GSDMD-N通過成孔活性介導(dǎo)細(xì)胞焦亡[35](圖2)。Shi等[36]研究發(fā)現(xiàn)GSDMD只存在于細(xì)胞焦亡的途徑中,GSDME在Caspase-3的切割下能將TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)向細(xì)胞焦亡[37]。由Gasdermin介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡對于年齡因素、雌激素缺乏、高血糖、免疫等引發(fā)的骨質(zhì)疏松癥的骨重建有不利影響[38],其對成骨細(xì)胞的分化及增殖的詳細(xì)機(jī)制尚不清楚,但在此過程中均有炎癥因子的參與[39],炎癥因子被細(xì)胞識別后,能被Caspase-1介導(dǎo)并活化,通過復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制發(fā)生細(xì)胞焦亡過程,細(xì)胞焦亡反過來亦會觸發(fā)炎癥小體,通過促進(jìn)受損傷的免疫細(xì)胞死亡來調(diào)節(jié)骨細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[40]。
圖2 GSDMD依賴的細(xì)胞焦亡示意圖Fig.2 Schematic diagram of GSDMD dependent pyroptosis
阿侖膦酸鹽(ALN)是一種含氮雙膦酸鹽(NBP)的抗骨質(zhì)疏松藥物,其在抗OP的同時(shí),又有引起頜骨壞死的不良反應(yīng),Tamai等[41]在研究中發(fā)現(xiàn),NBP在體內(nèi)外均能誘導(dǎo)成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞死亡,這種死亡是細(xì)胞內(nèi)Nod樣受體家族NLRP3被激活并表達(dá),而NLRP3炎癥小體的異常激活不僅會產(chǎn)生炎癥,同時(shí)通過上調(diào)Caspase-1和gasdermin D(GSDMD)的表達(dá)導(dǎo)致成骨細(xì)胞的焦亡和功能障礙,活化的Caspase-1將底物蛋白GSDMD切割為GSDMD-N,進(jìn)而介導(dǎo)了頜骨中成骨細(xì)胞焦亡。Cheng等[42]在研究急性根尖牙周炎(AP)時(shí)發(fā)現(xiàn),服用VX-765后牙槽骨的骨丟失減少,這是VX765通過抑制Caspase-1、IL-1β、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、IL-6和IL-8等的表達(dá),從而降低了GSDMD的表達(dá),最終抑制了牙槽骨中成骨細(xì)胞的焦亡。Yang 等[43]研究發(fā)現(xiàn),高糖可通過Caspase-1/GSDMD/IL-1β途徑激活糖尿病患者牙槽骨的成骨細(xì)胞焦亡,進(jìn)而抑制牙槽骨成骨細(xì)胞的增殖和分化,這為糖尿病患者牙槽骨疾病的臨床治療及骨代謝提供理論依據(jù)。在OP引起骨代謝失衡的低度氧化應(yīng)激、雌激素減少病理過程中,通過Caspase-1細(xì)胞焦亡通路和Caspase-4/5/11細(xì)胞焦亡通路對底物蛋白GSDMD進(jìn)行激活,進(jìn)而調(diào)控成骨細(xì)胞焦亡,對骨代謝平衡具有重要的作用。
盡管凋亡、壞死性凋亡、鐵死亡及焦亡之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路不同,但它們并非是平行、沒有重疊的,這些不同細(xì)胞死亡途徑間緊密聯(lián)系且相互調(diào)節(jié),存在著“crosstalk”的物質(zhì)基礎(chǔ)。如細(xì)胞在TNF及氧化因子的作用下促使線粒體釋放凋亡因子誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡,當(dāng)Caspase-8被抑制又可引發(fā)細(xì)胞壞死性凋亡[44],細(xì)胞中存在的GSDME蛋白又會使細(xì)胞從凋亡迅速轉(zhuǎn)向焦亡[45]。凋亡還能轉(zhuǎn)換為鐵死亡,Yuan等[46]研究發(fā)現(xiàn),鐵積累可抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的數(shù)量,提高M(jìn)SCs細(xì)胞ROS水平和氧化酶4(NOX4)蛋白表達(dá),通過Caspase-3誘導(dǎo)MSCs凋亡導(dǎo)致骨質(zhì)流失,Liu等[47]發(fā)現(xiàn)鐵積累通過XIST/miR-758-3p/caspase 3軸調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞凋亡。Tian等[48]發(fā)現(xiàn)ROS在調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞中鐵過載誘導(dǎo)的壞死性凋亡中起關(guān)鍵作用,RIPK1/RIPK3/MLKL是鐵超載在體外誘導(dǎo)成骨細(xì)胞壞死性凋亡的關(guān)鍵通路。
此外,鐵離子介導(dǎo)的鐵死亡參與細(xì)胞焦亡的誘導(dǎo)過程。Zhou等[49]研究顯示,鐵離子和ROS誘導(dǎo)藥物羰基氰-間-氯苯肼共同處理黑色素瘤細(xì)胞引起細(xì)胞ROS水平顯著升高,通過ROS-Tom20-Caspase 3-GSDME信號通路導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生焦亡。Tian等[50]用不同濃度的鐵離子處理MC3T3-E1成骨細(xì)胞后,檢測到成骨細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定鐵水平的升高并伴隨有ROS的產(chǎn)生及Caspase-3的活化,而Caspase-3的活化可切割GSDME將TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)換為細(xì)胞焦亡[51]。鐵離子不僅介導(dǎo)鐵死亡,還能誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡,GPX4信號與GSDMD信號分別是引發(fā)鐵死亡和細(xì)胞焦亡的重要物質(zhì)基礎(chǔ),那么在OP病程中,也必然存在著過度的成骨細(xì)胞鐵死亡和焦亡,進(jìn)而引起成骨細(xì)胞功能異?;蛩劳?,而這種影響關(guān)系可能是由GPX4與GSDMD信號“crosstalk”引起的細(xì)胞焦亡所致。目前,本課題組正在研究GPX4與GSDMD信號“crosstalk”調(diào)控成骨細(xì)胞焦亡及其對OP發(fā)生發(fā)展的影響,以期可以提供更多證據(jù)。
在機(jī)體正常的生理過程中,細(xì)胞程序性死亡的發(fā)生處于適度的平衡狀態(tài),從而維持細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境穩(wěn)態(tài)。在OP發(fā)生的病理過程中,各程序性死亡處于失衡狀態(tài),可能通過某種機(jī)制相互影響而調(diào)節(jié)OP的發(fā)生發(fā)展。PCD作為可調(diào)控的細(xì)胞死亡方式存在于某些特殊細(xì)胞體系中,在促進(jìn)機(jī)體發(fā)育、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、免疫調(diào)節(jié)和生理病理過程中具有重要意義。盡管科學(xué)家在PCD關(guān)鍵分子及信號通路的識別方面已取得突破性進(jìn)展,但有關(guān)這些程序性死亡信號通路調(diào)控OP發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制了解甚少。未來有關(guān)PCD與OP的研究應(yīng)更多側(cè)重于程序性死亡間交互影響與OP的聯(lián)系方面,力求將凋亡、壞死性凋亡、鐵死亡及焦亡涵蓋在一個(gè)統(tǒng)一體系中,進(jìn)一步探究PCD的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與調(diào)節(jié)機(jī)制將為OP發(fā)病機(jī)制研究及治療策略提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和支撐。