蒙藥那仁滿都拉調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路抗骨質(zhì)疏松的作用及機制

余自層 郭楊 馬勇, 潘婭嵐 韓秋革 肖吉日木圖 劉孟敏

1.南京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院·中西醫(yī)結(jié)合學院，江蘇 南京 210023

2.南京中醫(yī)藥大學骨傷修復與重建新技術(shù)實驗室，江蘇 南京 210023

3.南京中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合護理研究所，江蘇 南京 210023

4.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110

蒙醫(yī)藥作為祖國醫(yī)藥的一部分，在防治骨質(zhì)疏松方面有其特有的經(jīng)驗及療效。蒙醫(yī)學認為，骨質(zhì)疏松癥歸屬“骨赫依病、骨枯癥”范疇。原因在于三根“赫依、希拉、巴達干”失衡，七素“食物精華、血、肌肉、脂肪、骨骼、骨髓、精”清濁代謝紊亂，從而導致骨強度下降，形成骨枯癥[1]。蒙藥那仁滿都拉又名升陽十一味丸，出自《至高要方》，是內(nèi)蒙地區(qū)常用復方之一，由石榴、肉桂、益智仁、蓽茇、紅花、小蜀季、玉竹、黃精、天門冬、蒺藜、天花粉組成，現(xiàn)已收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準-蒙藥分冊》。其具有增強胃火、促消化、補腎壯陽、促進清濁代謝、抑制骨枯、赫依病等功效[2]，常用于痞病、水腫、遺精、腰痛、寒瀉、骨痛等寒性病癥。長期臨床應用中發(fā)現(xiàn)那仁滿都拉可緩解骨質(zhì)疏松引起的疼痛，增加骨量，但其作用機制尚不完全清楚[3]。

既往研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展受多種通路影響，其中Wnt/β-catenin信號通路是骨生長、發(fā)育中的經(jīng)典通路[4]；Wnt通路可促進成骨細胞的生成，抑制破骨細胞的分化，在平衡骨生成與骨代謝中至關重要[5]。Wnt蛋白與其受體結(jié)合通過增加β-catenin蛋白的表達，減緩成熟成骨細胞的凋亡，進而緩解骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展[6]。基于此，本研究構(gòu)建去卵巢大鼠和成骨細胞作為研究對象，通過體內(nèi)實驗觀察蒙藥那仁滿都拉對大鼠骨密度，骨病理切片、骨骼力學及Wnt/β-catenin蛋白表達水平的影響；通過體外實驗觀察蒙藥那仁滿都拉含藥血清對成骨細胞ALP分泌、礦化及Wnt/β-catenin蛋白表達水平的影響。探索那仁滿都拉防治骨質(zhì)疏松癥的作用及機制，為后續(xù)蒙醫(yī)藥防治骨質(zhì)疏松癥提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物：2月齡SPF級SD雌鼠共30只，體重為(250±15)g，動物合格證書：SCXK(浙) 1019-0002(南京中醫(yī)藥大學動物倫理委員會的批準：A200904)；1日齡SPF級SD雌鼠共5只，體重為(10±5)g，動物合格證書：SCXK(滬)2018-0004，由南京江寧區(qū)青龍山動物實驗中心提供。

1.1.2試劑：蒙藥那仁滿都拉丸(內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司，國藥準字：Z15020446)；堿性磷酸酶顯色試劑盒、礦化染色試劑盒(中國碧云天生物技術(shù)公司)；兔抗大鼠Wnt單克隆抗體(貨號：AF5315)購于美國Affinity公司、兔抗大鼠β-catenin單克隆抗體(貨號：51067-2-AP)購于中國Proteintech公司、山羊抗兔IgG(貨號：GB23303)購于中國賽維爾生物科技有限公司；切片石蠟、HE染液、脫鈣液、二甲苯、多聚甲醛購于中源葉生物有限公司。

1.1.3儀器：倒置熒光顯微鏡DMI3000B型(德國Leica)；生物力學測試系統(tǒng)Acumen3型(美國 MTS)；小動物Micro-CT成像系統(tǒng)Quantum GX型(美國PerkinElmer)；全自動硬組織切片機RM2265型(德國 Leica)；全自動組織染色機YD-700型(金華益迪)；全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)Trans-Blot Turbo(美國 Bio-Rad)。

1.2 動物模型制備及取材

所有大鼠隨機分為5組(假手術(shù)組、模型組、蒙藥低劑量組、蒙藥中劑量組、蒙藥高劑量組)，選用異氟烷吸入式麻醉后，模型組與用藥組于脊柱兩側(cè)旁開約1 cm處行2 cm左右的切口，逐層剪開后找出卵巢，行卵巢切除手術(shù)，逐層縫合。假手術(shù)組行切開皮膚縫合手術(shù)。術(shù)后3 d傷口涂抹青霉素軟膏預防傷口感染。8周后檢測骨密度相關指標驗證造模成功與否。

分組及取材：假手術(shù)組與模型組用生理鹽水灌胃，每天2 mL；蒙藥低劑量組按照0.2 g/(kg·d)，每天2 mL；蒙藥中劑量組按照0.4 g/(kg·d)，每天2 mL；蒙藥高劑量組按照0.8 g/(kg·d)，每天2 mL。連續(xù)12周后，麻醉后取雙側(cè)股骨液氮中保存。

1.3 Micro-CT、骨骼力學檢測

采用Micro-CT技術(shù)觀察大鼠骨結(jié)構(gòu)和礦物質(zhì)變化。應用微CT成像系統(tǒng)(Analyze12)進行CT掃描和小梁形態(tài)分析?？臻g分辨率為9 μm (X射線源80 kv，384 μA；用1 mm濾鏡)掃描右側(cè)股骨標本。然后分別用內(nèi)置軟件CT-vox和CTAn重建CT圖像。將左側(cè)股骨標本提前從生理鹽水取出，使用鑷子將標本放置在生物力學測試儀上，調(diào)整跨距與加載速度分別為1.5 cm、0.01 mm/s，直至股骨最終斷裂為實驗終點。儀器所記載的載荷-位移曲線，計算出最大負荷、最大撓度和剛度[7]。

1.4 HE染色

右側(cè)股骨4%多聚甲醛固定48 h后，生理鹽水沖洗4次，每次15 min，放入EDTA脫鈣液中，置于室溫中脫鈣6周，直至1 mL注射針頭能刺穿股骨后停止脫鈣。隨后進行脫水、石蠟包埋、儀器切片等步驟，按HE染色步驟染色后，顯微鏡下觀察骨形態(tài)變化[8-9]。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測

各組細胞及組織Wnt、β-catenin蛋白表達差異，第3代細胞以2×106/mL接種于6孔板，含藥血清干預培養(yǎng)2 d，提取細胞總蛋白，以BCA蛋白測定試劑盒測定樣本蛋白濃度，加入上樣緩沖液定量分裝，95 ℃煮沸10 min使蛋白變性，預制膠電泳后PVDF轉(zhuǎn)膜，快速封閉液封閉15 min，TBST清洗3次，每次5 min，加入相應的一抗(Wnt、β-catenin)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜4次。加入兔抗大鼠二抗孵育1.5 h，TBST洗膜4次，化學發(fā)光法檢測不同樣品相應蛋白表達情況。

1.6 成骨細胞的提取與培養(yǎng)

將乳鼠浸泡于75%乙醇5 min，無菌條件下取出顱骨，置于3%雙抗的PBS溶液中剔除筋膜組織，剪碎骨片，0.25%的胰酶培養(yǎng)箱中消化30 min，全陪終止消化，離心(1 000 r/5 min)后去上清加入0.1%一型膠原酶，恒溫震蕩箱(37 ℃，80 r/h)4 h，70 μm濾網(wǎng)去除骨碎片后離心(1 000 r/5 min)去上清，PBS沖洗一遍，全培接種于T25培養(yǎng)瓶中，當細胞匯合度到90%左右時，0.25%胰酶消化1.5 min后全陪終止消化，離心(1 000 r/5 min)，去上清加入全陪傳代，取第3代細胞進行后續(xù)實驗。

1.7 含藥血清的制備

蒙藥那仁滿都拉丸(內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司，國藥準字：Z15020446)蒙藥低劑量組按照0.2 mg/(kg·d)，每天2 mL。蒙藥中劑量組按照0.4 mg/(kg·d)，每天2 mL；蒙藥高劑量組按照0.8 mg/(kg·d)，每天2 mL?？瞻捉M灌胃生理鹽水2 mL。共4組每組3只，連續(xù)給藥3 d，末次灌胃2 h后用2.5%的戊巴比妥(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，4度靜置2 h后離心(3 500 r/min，10 min)，取上層血清，0.22 μm濾膜除菌，放-80 ℃保存。

1.8 堿性磷酸酶染色、茜素紅染色

第3代細胞以適當密度接種于兩塊6孔板中貼壁后分別將10%的含藥血清加入成骨誘導培養(yǎng)基(50 μg/mL維生素C+10 mmol/L β-甘油磷酸鈉+10-8mol/L地塞米松，配制誘導液進行誘導)，干預誘導細胞14 d，棄掉細胞培養(yǎng)液，PBS清洗1 次，4%中性多聚甲醛固定15 min，其中一塊加入堿性磷酸酶染色液于室溫下避光孵育30 min，生理鹽水清洗3遍，烘箱60 ℃烘干，另一塊加入茜素紅染色液均勻覆蓋細胞，室溫染色30 min后蒸餾水充分洗滌。倒置顯微鏡下觀察并拍照。觀察各組細胞堿性磷酸酶表達差異與礦化結(jié)節(jié)差異。

1.9 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 那仁滿都拉對骨小梁及骨骼力學性能的影響

用Micro-CT結(jié)果顯示那仁滿都拉可明顯提高大鼠骨小梁密度，同時改善骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)，其中中、高劑量組效果優(yōu)于低劑量組(見圖1)；那仁滿都拉可提高骨骼力學的載荷與剛度(P<0.01，P<0.05)，但其最大位移差異無統(tǒng)計學意義(見表1)。

圖1 各組Micro-CT矢狀面與冠狀面二維掃描圖Fig.1 Micro-CT sagittal and coronal two-dimensional scans

表1 蒙藥那仁滿都拉對各組大鼠骨骼力學的影響Table 1 Effects of Mongolian medicine Narenmandura on the skeletal mechanics of rat groups

2.2 那仁滿都拉對骨組織病理學形態(tài)的影響

骨組織病理染色結(jié)果顯示假手術(shù)組大鼠骨小梁排列緊密，結(jié)構(gòu)清晰，空腔較?。荒Ｐ徒M骨小梁斷裂明顯，結(jié)構(gòu)錯亂，空腔密集；那仁滿都拉用藥組中、高劑量組可明顯改善骨小梁病理變化，與模型組相比骨小梁斷裂較少，排列較為緊密，空腔減少(見圖2)。

圖2 各組大鼠股骨組織病理染色結(jié)果(100×)Fig.2 Results of pathological staining of femoral tissues in each group (100×)

2.3 那仁滿都拉對骨組織Wnt、β-catenin蛋白表達水平的影響

Western blot法檢測各組股骨組織中Wnt、β-catenin蛋白表達水平結(jié)果顯示，模型組中Wnt、β-catenin蛋白水平較假手術(shù)組顯著減低(P<0.000 1)，而那仁滿都拉用藥組可改善這一狀況，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.000 1)(見表2、圖3)。

表2 各組大鼠Wnt及β-catenin蛋白水平檢測結(jié)果Table 2 Test results of Wnt and β-catenin protein levels in each group

圖3 各組大鼠Wnt及β-catenin蛋白水平檢測結(jié)果Fig.3 Wnt and β-catenin protein levels results in the rats

2.4 那仁滿都拉含藥血清對成骨細胞堿性磷酸酶及礦化的影響

各組細胞ALP染色結(jié)果顯示，正常組與含藥血清組細胞均呈紫色深染；其中高劑量含藥血清組細胞深染面積最大，陽性率明顯高于空白血清組；低、中劑量含藥血清組深染面積較空白組略有提高。說明含藥血清組均可促進成骨細胞ALP的分泌，高劑量組更明顯(見圖4A)。各組細胞在連續(xù)干預14 d后進行礦化染色發(fā)現(xiàn)，4組細胞均有被染為橘紅色的礦化結(jié)節(jié)形成，其中那仁滿都拉含藥血清高劑量組細胞礦化結(jié)節(jié)數(shù)量較多，體積增大，提示那仁滿都拉含藥血清可以促進成骨細胞礦化(見圖4B)。

圖4 那仁滿都拉含藥血清對成骨細胞堿性磷酸酶分泌及礦化的影響A：堿性磷酸酶染色；B：礦化結(jié)節(jié)染色Fig.4 Effect of Narenmandula-containing serum on alkaline phosphatase secretion and mineralization of osteoblastsA： Alkaline phosphatase staining; B： Staining of mineralized nodules

2.5 那仁滿都拉含藥血清對成骨細胞Wnt、β-catenin蛋白表達水平的影響

比較各組含藥血清對成骨細胞Wnt、β-catenin蛋白表達水平的影響，因此采用Western blot法對各組進行檢測，4組成骨細胞的Wnt、β-catenin的水平差異都具有統(tǒng)計學意義，其中含藥血清中、高劑量組Wnt、β-catenin蛋白表達明顯高于空白組(P<0.000 1)(見表3、圖5)。

表3 各組成骨細胞Wnt及β-catenin蛋白水平檢測結(jié)果Table 3 The results of Wnt and β-catenin protein levels

圖5 各組成骨細胞Wnt及β-catenin蛋白水平檢測結(jié)果Fig.5 Wnt and β-catenin protein levels osteoblasts

3 討論

蒙藥那仁滿都拉共有11味草藥，以石榴為君藥，肉桂、玉竹共為臣藥，三藥配伍，具有增強胃火，分解精微和糟粕，補腎健脾。佐以蓽茇、紅花、益智仁、蒺藜、黃精、天門冬、小蜀季、天花粉，以治其標。現(xiàn)代藥理學實驗發(fā)現(xiàn)，蒙藥那仁滿都拉對小鼠血清中的氧自由基及脂質(zhì)過氧化物均有較強的清除作用，并能調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)和機體能量代謝發(fā)揮抗疲勞作用[10]。田宏等[11]發(fā)現(xiàn)蒙藥那仁滿都拉可發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用治療寒盛型腎小球腎炎。復方中包含糅質(zhì)、生物堿、揮發(fā)油、多糖、黃酮類、甾類成分，均具有臨床效應。石榴籽油及其活性化合物通過抑制破骨細胞分化和促進成骨細胞生成，在骨質(zhì)疏松癥中發(fā)揮骨保護作用[12-13]。從天門冬中分離出來的麥冬素，通過減少體內(nèi)的活性氧發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用[14]。同時，黃精、玉竹通過調(diào)節(jié)ERK/GSK-3β/β-Catenin等信號通路，促進骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨分化[15]。綜上，此復方中的各種草藥中都含有抗骨質(zhì)疏松癥的活性成分，然而復方草藥配伍比單一用藥更有效地治療骨質(zhì)疏松癥。

在本研究中，Micro-CT檢測骨小梁的結(jié)果并進行矢狀面與冠狀面二維結(jié)構(gòu)展示，模型組的骨小梁密度遠低于假手術(shù)組，表明大鼠去卵巢手術(shù)可導致大鼠骨小梁減少、骨質(zhì)流失，而蒙藥組均改善這一現(xiàn)象。HE染色與骨骼力學檢測也進一步驗證了以上實驗結(jié)果，提示蒙藥那仁滿都拉可以顯著改善去卵巢大鼠的骨微結(jié)構(gòu)，增加骨小梁豐度，提高骨骼力學性能。在體外實驗中發(fā)現(xiàn)，蒙藥含藥血清可以促進成骨細胞增殖、增加ALP分泌和誘導鈣化結(jié)節(jié)的形成，這提示那仁滿都拉抗骨質(zhì)疏松效應可能與提高成骨細胞成熟、分化能力有關。

Wnt/β-catenin信號通路調(diào)節(jié)生物體的許多發(fā)育過程，維持組織中內(nèi)環(huán)境的平衡。有研究者發(fā)現(xiàn)，Wnt的缺失會導致骨質(zhì)疏松癥假膠質(zhì)瘤，這是一種以骨量低、骨形成率低為特征的疾病，這表明Wnt蛋白在骨形成中也起著關鍵作用[16-17]。β-catenin是Wnt信號通路的關鍵調(diào)節(jié)因子[18]。當Wnt信號通路被激活時，β-catenin與核轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，激活下游靶基因，從而促進成骨細胞的分化和增殖[19]。Jin等[20]在敲除β-catenin基因的動物實驗中發(fā)現(xiàn)，骨組織中I型膠原、骨鈣素的表達顯著降低，Mirco-CT顯示骨小梁減少、骨質(zhì)流失，并導致骨質(zhì)疏松癥。ALP是成骨細胞分化的特異性標志物，可以促進骨形成和骨礦化[21-22]。ALP通過促進成骨細胞合成新的膠原基質(zhì)，并釋放膜結(jié)合的基質(zhì)小泡來調(diào)節(jié)基質(zhì)的礦化，成骨細胞被基質(zhì)包圍后成為骨細胞[23]。實驗研究觀察到，該方能改善骨質(zhì)疏松模型大鼠骨小梁形態(tài)，提高骨生物力學及骨密度，改善骨微環(huán)境，促進Wnt、β-catenin蛋白的表達，具有防治骨質(zhì)疏松的作用。此外，還可促進成骨細胞活性，增加ALP表達，促進其礦化，提高成骨細胞Wnt、β-catenin蛋白的表達水平。因此，本研究認為蒙藥那仁滿都拉可能通過Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮其抗骨質(zhì)疏松作用。

綜上所述，蒙藥那仁滿都拉在體內(nèi)體外實驗中均具有良好的藥效，也進一步揭示了那仁滿都拉作為一種安全有效的抗骨質(zhì)疏松藥物的潛能；同時驗證了蒙醫(yī)“三根七素”理論指導下形成的那仁滿都拉，其顯著的抗骨質(zhì)疏松效應與促進骨形成、骨再生有關，但其具體作用機制有待進一步研究。隨著國家對民族醫(yī)藥事業(yè)支持力度的不斷提高，以及對骨質(zhì)疏松癥的逐步重視，蒙藥的運用與開發(fā)愈發(fā)被重視，為蒙藥那仁滿都拉的發(fā)展提供了良好的機遇。在蒙醫(yī)藥理論指導下，針對蒙藥特性開展藥效物質(zhì)基礎研究。通過結(jié)合中醫(yī)藥現(xiàn)代化的模式，探索蒙醫(yī)藥現(xiàn)代化的共性技術(shù)，開展蛋白質(zhì)組學篩選靶點及作用通路，為蒙藥那仁滿都拉防治骨質(zhì)疏松提供新依據(jù)。