六味地黃丸含藥血清通過(guò)誘導(dǎo)自噬對(duì)氧化應(yīng)激狀態(tài)下成骨細(xì)胞增殖的影響

郭瀾 李莉 葛繼榮* 黃景文 柴昊 謝麗華 陳娟 許鵬超

1.福建省中醫(yī)藥科學(xué)院，福建 福州 350003

2.福建省中西醫(yī)結(jié)合防治骨質(zhì)疏松重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350003

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種全身性骨代謝疾病，以單位體積骨量減少，骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征，表現(xiàn)為骨脆性增加，骨折風(fēng)險(xiǎn)增高[1]。目前的調(diào)查顯示，在我國(guó)50歲以上人群中，女性O(shè)P發(fā)病率達(dá)20.7%，男性達(dá)14.4%[2]，并且預(yù)計(jì)到2050年，中老年女性的發(fā)病率將高達(dá)50%～70%[3]。研究證明，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)的發(fā)病機(jī)制與雌激素調(diào)控、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)、腸道菌群及鐵過(guò)載等相關(guān)[4]。當(dāng)機(jī)體受到有害刺激時(shí)會(huì)生成大量的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，若不能被機(jī)體及時(shí)清除，便會(huì)打破氧化/抗氧化平衡，對(duì)組織或細(xì)胞造成損傷，這種病理反應(yīng)稱(chēng)之為氧化應(yīng)激[5-6]，是PMOP的重要發(fā)病機(jī)制之一[7]。自噬是細(xì)胞在饑餓、毒性物質(zhì)刺激等狀態(tài)下，自噬小體與溶酶體結(jié)合以降解受損的細(xì)胞器或功能喪失的大分子蛋白等物質(zhì)，再供給細(xì)胞以維持正常生理功能的過(guò)程，對(duì)機(jī)體的物質(zhì)循環(huán)再利用、維護(hù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等起到重要作用[8-9]。研究表明，自噬和氧化應(yīng)激與骨穩(wěn)態(tài)的維持及OP的發(fā)生發(fā)展有著必然的聯(lián)系，靶向調(diào)節(jié)骨組織細(xì)胞自噬水平可以作為一種前瞻性治療OP的新方法[10]。中醫(yī)的“骨痿”“骨枯”等范疇，其中肝腎陰虛型OP的推薦用藥之一為六味地黃丸[11]。本研究通過(guò)H2O2誘導(dǎo)成骨細(xì)胞模擬細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)，之后采用六味地黃丸含藥血清共培養(yǎng)，探討六味地黃丸含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞增殖、ROS及自噬水平的影響，為六味地黃丸臨床治療OP提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

MC3T3-E1細(xì)胞于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)購(gòu)買(mǎi)；SD大鼠購(gòu)于上海斯萊克；α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco，美國(guó))，青鏈霉素雙抗混合液、磷酸緩沖鹽溶液(上海源培公司，中國(guó))，自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)、H2DCFDA、CCK-8試劑盒(MedChemExpress，美國(guó))；六味地黃丸濃縮丸(同仁堂，中國(guó))。RIPA裂解緩沖液(碧云天，中國(guó))；Product Information(APExBIO，美國(guó))；BCA蛋白分析試劑盒(雅酶，中國(guó))；Rabbit Anti-β-actin(bioss，bs-0061R)，Anti-Beclin 1 antibody(Abcam，ab207612)，Anti-LC3B(abcam，ab192890)；特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天，中國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1制備六味地黃丸含藥血清：將40只SD大鼠隨機(jī)分為空白組和六味地黃丸組，先于動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。根據(jù)六味地黃丸說(shuō)明書(shū)，成人一天總用藥量相當(dāng)于中藥飲片9 g，參照徐叔云等[12]的方法，制備生藥質(zhì)量濃度為0.8 kg/L的六味地黃丸水溶液，按每天1.0 mL/100 g對(duì)六味地黃丸組大鼠進(jìn)行灌胃，空白組用等量蒸餾水灌胃。在第7天首次灌藥2 h后，麻醉大鼠進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血以制備六味地黃丸(LWDH)含藥血清及空白血清。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞培養(yǎng)基選用α-MEM培養(yǎng)基，其中含有10%體積分?jǐn)?shù)的胎牛血清，1%體積分?jǐn)?shù)的青鏈霉素。培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃，5%體積分?jǐn)?shù)CO2的培養(yǎng)箱中。細(xì)胞復(fù)蘇后2 d換液一次，當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿80%～90%時(shí)傳代，當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3CCK-8檢測(cè)：將MC3T3-E1細(xì)胞接種于96孔板，每組設(shè)置3～4個(gè)副孔，于培養(yǎng)箱中靜置24 h以待細(xì)胞貼壁，后吸走原有培養(yǎng)基，用H2O2(0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 mmol/L)干預(yù)24 h；另外一板細(xì)胞用體積分?jǐn)?shù)5%、10%、20%、30%的空白血清、LWDH含藥血清干預(yù)24 h，后用0.10 mmol/L H2O2繼續(xù)干預(yù)至48 h。干預(yù)結(jié)束后，按照10 μL/孔加入CCK-8試劑，繼續(xù)于培養(yǎng)箱中孵育1 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450 nm處吸光值，記錄并根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.2.4分組及干預(yù)：正常對(duì)照組(Control)：不做干預(yù)；模型組(Model)：0.10 mmol/L H2O2干預(yù)24 h；空白對(duì)照組(H+Blank)：20%空白血清干預(yù)24 h，0.10 mmol/L H2O2干預(yù)24 h；六味地黃丸組(H+LWDH)：20%六味地黃丸含藥血清干預(yù)24 h，0.10 mmol/L H2O2干預(yù)24 h；自噬抑制劑組(3-MA+LWDH)：3-MA提前干預(yù)1 h，再用20%六味地黃丸含藥血清共同干預(yù)24 h。

1.2.5細(xì)胞活性氧水平檢測(cè)：將MC3T3-E1細(xì)胞接種于6孔板，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)后，采用熒光探針DCFH-DA檢測(cè)每組細(xì)胞的ROS的含量。根據(jù)DCFH-DA試劑盒說(shuō)明書(shū)，用PBS配制熒光探針(DCFH-DA)稀釋液(探針濃度為10 μmol/L)，每孔加入適量的含有探針的PBS溶液，于培養(yǎng)箱中靜置1 h，棄去PBS，用新的PBS輕柔清洗2遍。閉光置于倒置熒光顯微鏡下觀察，并拍照保存。

1.2.6qRT-PCR檢測(cè)目的mRNA表達(dá)：將MC3T3-E1細(xì)胞接種于6孔板，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后根據(jù)分組進(jìn)行干預(yù)。干預(yù)結(jié)束后，根據(jù)分組收集細(xì)胞，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，采用qRT-PCR檢測(cè)成骨細(xì)胞Beclin 1、LC3B mRNA表達(dá)水平。由上海生工公司完成引物設(shè)計(jì)，具體引物信息見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences of PCR

1.2.7蛋白印跡法：根據(jù)分組收集細(xì)胞，使用RIPA裂解緩沖液、Product Information提取細(xì)胞中的總蛋白，并通過(guò)BCA蛋白分析試劑盒進(jìn)行蛋白定量。SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電泳分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜時(shí)間根據(jù)蛋白分子量確定。用脫脂奶粉4 ℃封閉4 h后，加入相對(duì)應(yīng)的一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌后，加入二抗Goat Anti-Rabbit IgG H&L antibody (bs-0295 G)，室溫孵育1.5 h，TBST洗滌4次，每次15 min。使用特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒曝光，用多色熒光/化學(xué)發(fā)光成像儀(protein simple，美國(guó))拍照保存。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。數(shù)據(jù)先進(jìn)性正態(tài)檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行描述，使用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，則進(jìn)行單因素方差分析；若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 過(guò)氧化氫對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響

H2O2的濃度為0.10 mmol/L時(shí)，相比于對(duì)照組，成骨細(xì)胞的平均增值率為70.65%，此濃度對(duì)成骨細(xì)胞增殖的抑制作用較為顯著(P<0.05)；H2O2的濃度為0.20 mmol/L時(shí)，成骨細(xì)胞平均增殖率不足20%?？梢?jiàn)，H2O2對(duì)成骨細(xì)胞的增殖具有抑制作用，且濃度為0.10 mmol/L時(shí)具有相對(duì)較小程度的抑制增殖效果，因此選取此濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。見(jiàn)圖1。

圖1 H2O2濃度對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of H2O2 concentration on osteoblast proliferation

2.2 六味地黃丸含藥血清對(duì)氧化應(yīng)激狀態(tài)下成骨細(xì)胞增殖的影響

CCK-8結(jié)果顯示，空白血清對(duì)成骨細(xì)胞增殖的作用不明顯(P>0.05)；而LWDH含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)性，且體積濃度為20%時(shí)，對(duì)成骨細(xì)胞的增殖促進(jìn)效果最佳，與空白組對(duì)比差異最顯著(P<0.05)。LWDH含藥血清濃度大于20%后，開(kāi)始對(duì)成骨細(xì)胞增殖出現(xiàn)抑制作用。因此，選取LWDH含藥血清體積濃度為20%進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。見(jiàn)圖2。

圖2 血清濃度對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of serum concentration on osteoblast proliferation

2.3 六味地黃丸含藥血清對(duì)H2O2所致成骨細(xì)胞氧化損傷的影響

熒光定量分析結(jié)果顯示，與Control組相比，Model組的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)(#P<0.05)，說(shuō)明在H2O2的干預(yù)下，成骨細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。與Model組相比，H+Blank組熒光輕度有所減弱，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；H+LWDH組熒光強(qiáng)度顯著減弱(*P<0.05)。說(shuō)明LWDH含藥血清可以降低細(xì)胞的ROS水平，減輕H2O2對(duì)成骨細(xì)胞造成的氧化損傷。見(jiàn)圖3。

2.4 六味地黃丸含藥血清對(duì)自噬相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Control組相比，Model組自噬相關(guān)Beclin 1、LC3B mRNA表達(dá)明顯下調(diào)(#P<0.05)。與Control組相比，H+Blank組自噬相關(guān)Beclin 1、LC3B mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)；與Model組相比，H+LWDH組自噬相關(guān)Beclin 1、LC3B mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(#P<0.05)；且與H+LWDH組相比，LWDH+3-MA組自噬相關(guān)基因Beclin 1、LC3B mRNA表達(dá)明顯下調(diào)(▲P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 qRT-PCR檢測(cè)Beclin 1、LC3B mRNA表達(dá)情況Fig.4 qRT-PCR detection of Beclin 1 and LC3B mRNA expression注：與Control組相比，#P<0.05；與Model組相比，*P<0.05；與H+LWDH組相比，▲P<0.05。

2.5 六味地黃丸含藥血清對(duì)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

蛋白印跡法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Control組相比，Model組自噬相關(guān)蛋白Beclin 1表達(dá)明顯下調(diào)(#P<0.05)、LC3Ⅱ/Ⅰ比值降低(#P<0.05)。與Control組相比，H+Blank組自噬相關(guān)蛋白Beclin 1表達(dá)及LC3Ⅱ/Ⅰ比值無(wú)明顯變化(P>0.05)；與Model組相比，H+LWDH組自噬相關(guān)蛋白Beclin 1表達(dá)明顯上調(diào)(#P<0.05)、LC3Ⅱ/Ⅰ比值增高(#P<0.05)；且與H+LWDH組相比，LWDH+3-MA組自噬相關(guān)蛋白Beclin 1表達(dá)明顯下調(diào)(▲P<0.05)、LC3Ⅱ/Ⅰ比值有降低趨勢(shì)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明在氧化應(yīng)激條件下成骨細(xì)胞自噬水平降低，而LWDH含藥血清可以促進(jìn)氧化應(yīng)激狀態(tài)下成骨細(xì)胞的自噬水平。見(jiàn)圖5。

圖5 蛋白印跡法檢測(cè)Beclin 1、LC3B 蛋白表達(dá)情況Fig.5 Western blotting assay for Beclin 1 and LC3B protein expression注：A：Control組；B：Model組；C：H+Blank組；D：H+LWDH組；E：LWDH+3-MA組。與Control組相比，#P<0.05；與Model組相比，*P<0.05；與H+LWDH組相比，▲P<0.05。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)[13]，絕經(jīng)期女性由于年齡的增長(zhǎng)，機(jī)體的雌激素水平會(huì)逐漸降低、抗氧化能力減弱、氧化酶活性增加，最終會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。機(jī)體內(nèi)ROS不斷堆積，會(huì)對(duì)胞膜及胞核中的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等物質(zhì)造成損傷，這不僅會(huì)使成骨細(xì)胞的活性降低，還會(huì)導(dǎo)致成骨細(xì)胞凋亡增多，最終導(dǎo)致骨代謝的失衡、骨密度的降低[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2會(huì)明顯提高M(jìn)C3T3-E1成骨細(xì)胞的ROS水平，可模擬細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，且對(duì)細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用；而六味地黃丸含藥血清可以降低氧化應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)ROS水平，減輕細(xì)胞氧化損傷，以促進(jìn)細(xì)胞的增殖。

研究顯示[16]，在多種毒性條件下，如氧化應(yīng)激狀態(tài)下，自噬對(duì)成骨細(xì)胞都具有保護(hù)作用，并且深度參與了體內(nèi)多種生物信號(hào)介導(dǎo)的成骨分化[17]。目前的研究證明[18-19]，氧化應(yīng)激和自噬之間具有復(fù)雜的相互作用關(guān)系，機(jī)體內(nèi)過(guò)多的ROS能誘導(dǎo)自噬發(fā)生，而細(xì)胞自噬的激活，可以通過(guò)降解胞內(nèi)受損的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等來(lái)降低機(jī)體的ROS水平，以調(diào)節(jié)氧化/抗氧化平衡。影響細(xì)胞自噬發(fā)生過(guò)程最關(guān)鍵的是自噬小體的形成，同時(shí)也受到很多自噬相關(guān)基因，比如LC3、Beclin 1等的調(diào)控。其中LC3有兩種亞型，當(dāng)激活細(xì)胞自噬后，LC3-Ⅰ型會(huì)迅速轉(zhuǎn)換成LC3-Ⅱ型，因此機(jī)體內(nèi)LC3-Ⅱ的表達(dá)量可以作為自噬小體形成的標(biāo)志之一[20]。Beclin l可以通過(guò)與分隔膜結(jié)合形成成熟的自噬小體[21]，因此Beclin l的表達(dá)水平與自噬水平呈正相關(guān)，被認(rèn)為是自噬的正向調(diào)節(jié)因子，若Beclin l的表達(dá)增多，則可以說(shuō)明自噬被激活。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2會(huì)降低成骨細(xì)胞Beclin 1、LC3B mRNA的表達(dá)、降低Beclin 1蛋白表達(dá)及LC3Ⅱ/Ⅰ比值；而六味地黃丸含藥血清可以提高氧化應(yīng)激狀態(tài)下成骨細(xì)胞Beclin 1、LC3B mRNA的表達(dá)、提高Beclin 1蛋白表達(dá)及LC3Ⅱ/Ⅰ比值，且在加入自噬抑制劑3-MA后，該作用被抑制。說(shuō)明六味地黃丸含藥血清減輕氧化應(yīng)激狀態(tài)下的MC3T3-E1成骨細(xì)胞的氧化損傷的機(jī)制可能是誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。

綜上所述，六味地黃丸含藥血清減輕MC3T3-E1成骨細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷以促進(jìn)細(xì)胞的增殖，可能是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬來(lái)實(shí)現(xiàn)的。目前研究發(fā)現(xiàn)[22-24]，細(xì)胞自噬具有雙重作用，在正常生理狀態(tài)下細(xì)胞保持著基礎(chǔ)水平的自噬，當(dāng)氧化應(yīng)激程度超過(guò)機(jī)體的可控范圍時(shí)，無(wú)法被清除的ROS會(huì)激活自噬的相關(guān)通路使自噬過(guò)度，以出現(xiàn)細(xì)胞自我消化現(xiàn)象，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，這被稱(chēng)為依賴(lài)ROS的自噬性死亡途徑，目前該死亡途徑在眾多腫瘤細(xì)胞系中已得到證實(shí)。六味地黃丸如何調(diào)控成骨細(xì)胞自噬處于可控范圍內(nèi)，以抵抗細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷還需要進(jìn)一步研究。